染色體全自動(dòng)掃描儀在低比例嵌合體核型分析中的應(yīng)用

黃閩忠 許黎娟 鄭杰輝 莆田市第一醫(yī)院產(chǎn)前診斷科 （福建 莆田 351100）

內(nèi)容提要：目的：為了提高低比例嵌合體核型分析的性能，研究染色體全自動(dòng)掃描儀在該方面的作用，從而發(fā)現(xiàn)可改進(jìn)的部分，以提高低比例嵌合體核型檢出率。通過(guò)與傳統(tǒng)方法比對(duì)，探討染色體全自動(dòng)掃描儀在低比例嵌合體核型分析中的價(jià)值。方法：收集在本院進(jìn)行診斷、咨詢(xún)的2000例女性患者作為研究對(duì)象，采用數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組（n=1000）和研究組（n=1000），對(duì)照組采用顯微鏡手動(dòng)分析法，研究組采用染色體全自動(dòng)掃描儀系統(tǒng)分析法，取外周血液淋巴細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，常規(guī)染色體采用G顯帶技術(shù)核型分析，對(duì)照組和研究組均分析計(jì)數(shù)30個(gè)中期分裂相，分析5個(gè)核型，出現(xiàn)異常者則加倍核型分析，計(jì)數(shù)100個(gè)核型。結(jié)果：通過(guò)觀察計(jì)數(shù)，對(duì)照組中，檢查時(shí)出現(xiàn)低比例嵌合體5例，檢查低比例嵌合體率為0.5%；研究組中，檢查時(shí)出現(xiàn)低比例嵌合體20例，檢查低比例嵌合體率為2%，查出率顯著上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：相比傳統(tǒng)手動(dòng)核型分析方法，染色體全自動(dòng)掃描儀在低比例嵌合體核型分析方面，提高了低比例嵌合體核型的檢出率和準(zhǔn)確度，給臨床提供診斷參考，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

嵌合體說(shuō)的是一個(gè)胚胎中有兩種或兩種以上遺傳構(gòu)成有差異的細(xì)胞系現(xiàn)象[1]，即一個(gè)胚胎中存在兩種或兩種以上染色體數(shù)目不同的細(xì)胞群，嵌合占比低的稱(chēng)低比例嵌合體[2]。嵌合體的形成原因是在有絲分裂期間，染色體不分離從而形成45，X、47，XXX、46，XX三種，末期延遲導(dǎo)致染色體丟失，形成2種配子，分別為45，X、46，XX[3]。嵌合體是一種染色體異常，其形成原因分為兩種類(lèi)型。首先是同源嵌合體，它是在受精卵形成后的卵裂和胚胎發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)突變導(dǎo)致的。這種突變可能會(huì)在胚胎發(fā)育的任何階段發(fā)生，從而形成全身性或者組織部分性嵌合體。同源嵌合體可能會(huì)受到多種外界因素的影響，例如物理、化學(xué)因素等。而異源嵌合體則通常出現(xiàn)在骨髓移植過(guò)程中。在同一個(gè)體內(nèi)，不同來(lái)源的細(xì)胞系會(huì)結(jié)合，從而形成異源嵌合體。并且嵌合體患者中異常核型的比例影響著患者的臨床表現(xiàn)和嚴(yán)重程度，伴隨著異常核型比例的升高而使患者有更高的風(fēng)險(xiǎn)，但也不排除存在與這種情況不一致的現(xiàn)象。通常情況下，在顯微鏡下人工對(duì)染色體中期分裂相進(jìn)行查找是一項(xiàng)極其費(fèi)時(shí)費(fèi)力的工作，而且由于長(zhǎng)時(shí)間的觀察容易導(dǎo)致視覺(jué)疲勞，忽略掉一些不太明顯的異常核型，從而造成人為的觀察結(jié)果出錯(cuò)而導(dǎo)致錯(cuò)誤的診斷。因此，染色體全自動(dòng)掃描儀正是對(duì)焦這一問(wèn)題實(shí)現(xiàn)其工作性能的，它結(jié)合了顯微鏡、全自動(dòng)掃描、圖像、核型分析和計(jì)算機(jī)等多種技術(shù)[4]，工作模式、操作管理和質(zhì)量控制使其得到廣泛應(yīng)用。本文探討染色體全自動(dòng)掃描儀在低比例嵌合體核型分析中的應(yīng)用價(jià)值。

1.資料與方法

1.1 臨床資料

收集2016年11月～2021年1月在本院進(jìn)行診斷、咨詢(xún)的2000例女性患者作為研究對(duì)象，其有不良生育史或者原發(fā)性、繼發(fā)性不孕癥等，年齡25～45歲，平均（33.87±5.34）歲，采用數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組和研究組。對(duì)照組中有1000例，年齡26～44歲，平均（34.19±5.37）歲。研究組中有1000例，年齡25～44歲，平均（33.55±5.19）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并通過(guò)，且患者及其家屬均簽署知情同意書(shū)。研究組和對(duì)照組的年齡等基本資料經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較無(wú)顯著差異性（P＞0.05），結(jié)果具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①成年女性；②沒(méi)有溝通障礙及智力障礙；③資料信息完全；④知道研究具體情況且簽署知情同意書(shū)，在專(zhuān)業(yè)人員指導(dǎo)下積極配合研究。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①女性或其配偶存在染色體異常；②具有不良孕產(chǎn)史等；③有精神病或有精神病家族史。

1.2 方法

染色體檢查方法為取女性患者外周血液淋巴細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，放入溫度為37°C、二氧化碳濃度為5%的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)6d或者7d，期間連續(xù)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，并且及時(shí)換液，當(dāng)出現(xiàn)許多個(gè)克隆的圓形細(xì)胞時(shí)加入秋水仙素，然后再培養(yǎng)3h左右，進(jìn)而收獲制片，常規(guī)染色體采用G顯帶技術(shù)核型分析。對(duì)照組和研究組都分析計(jì)數(shù)30個(gè)中期分裂相，分析5個(gè)核型，出現(xiàn)異常者則加倍核型分析，計(jì)數(shù)100個(gè)核型。

對(duì)照組采用顯微鏡手動(dòng)分析法，即標(biāo)本經(jīng)過(guò)培養(yǎng)、收獲、制片、顯帶后，在顯微鏡下使用傳統(tǒng)核型分析方法進(jìn)行核型分析和核型計(jì)數(shù)。

研究組采用染色體全自動(dòng)掃描儀系統(tǒng)分析法，標(biāo)本經(jīng)過(guò)培養(yǎng)、收獲、制片、顯帶后，將其放入掃描儀中進(jìn)行掃描，由系統(tǒng)里的分析軟件自動(dòng)分析核型，結(jié)果顯示在電腦上，分析軟件與自動(dòng)掃描平臺(tái)配置使用，設(shè)定掃描2張片子，每個(gè)片子上有100個(gè)中期分裂相，自動(dòng)掃描儀系統(tǒng)中的中期分裂相選擇分析具有條件穩(wěn)定、要求標(biāo)準(zhǔn)化的特點(diǎn)。

1.3 觀察指標(biāo)與判定標(biāo)準(zhǔn)

觀察統(tǒng)計(jì)嵌合體的數(shù)量，包括47，XXX和45，X和46，XX。通常，對(duì)30例染色體進(jìn)行了普通計(jì)數(shù)，5例進(jìn)行了核型分析。如果出現(xiàn)下列情況，當(dāng)清點(diǎn)計(jì)數(shù)時(shí)，只有一種染色體是45，X或47，XXX，則需要增加數(shù)量到100種染色體核型。加二減三原則的含義是：100個(gè)核型中同一染色體缺少1條，且有3個(gè)或3個(gè)以上的核型；或者說(shuō)是，100個(gè)核型中同一染色體上多出1條，且有2個(gè)或2個(gè)以上的核型，那就屬于嵌合體。認(rèn)為＜10%的可能是低比例嵌合體。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以[n(%)]形式顯示，再行檢驗(yàn)獲得統(tǒng)計(jì)值。P＜0.05為組間數(shù)據(jù)對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

使用顯微鏡手動(dòng)分析法對(duì)1000例女性患者進(jìn)行染色體核型檢查，檢查時(shí)出現(xiàn)低比例嵌合體5例，檢查低比例嵌合體率為0.5%。使用染色體全自動(dòng)掃描儀系統(tǒng)分析法對(duì)1000例女性患者進(jìn)行染色體核型檢查，檢查時(shí)出現(xiàn)低比例嵌合體20例，檢查低比例嵌合體率為2%。兩組的低比例嵌合體查出率之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.114，P=0.003），研究組中檢查出嵌合體的數(shù)量顯著高于對(duì)照組中的數(shù)量，查出率明顯上升。說(shuō)明染色體全自動(dòng)掃描儀提高了低比例嵌合體的查出率。染色體全自動(dòng)掃描儀分析100個(gè)核型中發(fā)現(xiàn)45，X的核型有4個(gè)，并且保證了顯微鏡下中期分裂相四周不存在其他核型染色體，見(jiàn)表1。

表1 兩組低比例嵌合體的檢出情況

3.討論

在胚胎發(fā)育過(guò)程中，在胚胎發(fā)生過(guò)程中，或在胚胎成熟后24h以?xún)?nèi)，均可產(chǎn)生畸形的染色體。在2～4d（分裂和胚胎階段），嵌合產(chǎn)物的數(shù)量會(huì)發(fā)生變化。在3個(gè)胚胎細(xì)胞中，其中一個(gè)胚胎細(xì)胞中的一種細(xì)胞發(fā)生了染色體的改變，從而造成了胚胎細(xì)胞所形成的細(xì)胞和細(xì)胞功能的改變[5]。在不同的組織和器官中，如果出現(xiàn)了一些有缺陷的染色體嵌合體，那么通過(guò)外周血液的檢測(cè)是很難檢測(cè)到的。在進(jìn)行染色體核型分析的時(shí)候，偶爾會(huì)遇到1個(gè)核型是45，X的情況，在使用顯微鏡分析的時(shí)候，通常的方法是增加計(jì)數(shù)，然后在鏡面下手動(dòng)找核型。但是，在選擇的時(shí)候，并沒(méi)有固定的標(biāo)準(zhǔn)，而且很困難。通常，當(dāng)數(shù)到30～50個(gè)核型時(shí)，大概率就不想再繼續(xù)進(jìn)行了。因此，大部分的人都會(huì)覺(jué)得，在采集制作過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)缺失，用這樣的傳統(tǒng)人工核型分析和計(jì)數(shù)的方法，即使能夠勉強(qiáng)計(jì)數(shù)到100個(gè)核型，也有可能會(huì)遺漏一些異常核型，從而造成低比例嵌合體核型的查出率下降。

自從出現(xiàn)染色體全自動(dòng)掃描儀后，上述問(wèn)題便開(kāi)始得到解決，隨著技術(shù)的改善和性能的優(yōu)化，全自動(dòng)掃描儀得到廣泛的應(yīng)用[6-9]，以便于對(duì)異常染色體的識(shí)別和分析判斷?，F(xiàn)下，一直在對(duì)染色體全自動(dòng)掃描儀內(nèi)部的部件進(jìn)行升級(jí)，使準(zhǔn)確度能夠達(dá)到更高[10]。掃描儀系統(tǒng)組成和配置包括顯微鏡部分、掃描系統(tǒng)主機(jī)部分、核型分析終端部分和黑白激光打印機(jī)，它內(nèi)嵌有一套標(biāo)準(zhǔn)化的中期分裂相選擇功能，掃描拍攝的用于核型分析的片子數(shù)量可自行確定，一般給一個(gè)患者掃描2～3張片子，再由系統(tǒng)選擇清晰、分散性好的染色體中期分裂相，如圖1所示。本文分析5個(gè)，計(jì)數(shù)30個(gè)核型，如果出現(xiàn)異常就計(jì)數(shù)100個(gè)核型。分裂相會(huì)非常清晰地顯示在電腦屏幕上，可以打印報(bào)告。

圖1.染色體中期分裂相圖

周靜等[11]研究報(bào)道，在羊水細(xì)胞性染色體嵌合產(chǎn)前診斷中，傳統(tǒng)的羊水細(xì)胞染色體核型分析技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果并不準(zhǔn)確，會(huì)丟失異常類(lèi)型的獲得數(shù)據(jù)，因此需要選擇更精準(zhǔn)的分析技術(shù)，綜合分析以提供更準(zhǔn)確的臨床信息，指導(dǎo)產(chǎn)前診斷和臨床咨詢(xún)。也有研究表明[12]，對(duì)于淋巴細(xì)胞微核試驗(yàn)中，對(duì)比全自動(dòng)染色體掃描儀和傳統(tǒng)手動(dòng)收獲淋巴細(xì)胞，結(jié)果顯示，使用前者方法得到的微核率、微核細(xì)胞率和微核陽(yáng)性率均優(yōu)于后者，因此，認(rèn)為使用全自動(dòng)染色體掃描儀不僅可以減輕實(shí)驗(yàn)室人員的工作量，還可以提高淋巴細(xì)胞微核的檢出率。

本研究中，使用兩種方法進(jìn)行低比例嵌合體核型分析，對(duì)照組采用顯微鏡手動(dòng)分析法，研究組采用染色體全自動(dòng)掃描儀系統(tǒng)分析法，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果上看，對(duì)照組檢查出的嵌合體例數(shù)為5，研究組檢查出的嵌合體例數(shù)為20，嵌合體檢出率明顯上升，P＜0.05，兩組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這是因?yàn)?，傳統(tǒng)顯微鏡核型分析完全是手工操作的，在自身顯微鏡下進(jìn)行分裂相分析時(shí)，一般選擇具有比較完整特征的核型分析，會(huì)忽略不太明顯的異常核型，因此很難發(fā)現(xiàn)比例較低的嵌合體。而染色體全自動(dòng)掃描系統(tǒng)內(nèi)部有一套完善的標(biāo)準(zhǔn)化的識(shí)別和判斷中期分裂相的功能，在超大工作量的同時(shí)，工作效率也不會(huì)降低，提高了低比例嵌合體核型的查出率。

綜上所述，染色體全自動(dòng)掃描儀在低比例嵌合體核型分析方面，提高了低比例嵌合體的檢出率，彌補(bǔ)了人工分析的不足，為臨床提供低比例嵌合體診斷的參考依據(jù)，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。盡管有嵌合體形成的人群不一定會(huì)出現(xiàn)癥狀，但這種遺傳物質(zhì)的存在可能會(huì)影響生育。它可能會(huì)導(dǎo)致胎兒畸形或者胚胎停止發(fā)育的幾率增加。所以在必要時(shí)，應(yīng)該進(jìn)行胚胎染色體檢查，以保證胚胎的健康。