白酒大曲發(fā)酵過程中微生物群落及功能研究進(jìn)展

薄 濤，呂 娜，楊凱環(huán)，張嬌嬌，張錦華，白寶清，田 翔，范三紅,*

（1.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006；2.山西大學(xué)杏花村學(xué)院，山西 太原 030006；3.山西杏花村汾酒廠股份有限公司中國(guó)汾酒城管理中心，山西 汾陽(yáng) 032200；4.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；5.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)基因資源研究中心，山西 太原 030031；6.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031）

“以曲釀酒”是我國(guó)白酒釀造工藝的典型特征。在長(zhǎng)期生產(chǎn)實(shí)踐中，酒曲也發(fā)展出不同的類型，諸如大曲、小曲、紅曲、麥曲和麩曲[1]。其中，大曲為多數(shù)名優(yōu)白酒生產(chǎn)所必需。大曲以小麥、大麥和豌豆為原料，根據(jù)發(fā)酵過程中頂溫的不同，又可分為高溫、中溫和低溫大曲[2]。在釀酒過程中大曲功能與作用主要體現(xiàn)在3 個(gè)方面：首先，提供微生物菌群作為白酒發(fā)酵原動(dòng)力；其次，為白酒釀造提供酶和風(fēng)味物質(zhì)，作為曲香和釀造香的來源；最后，為白酒釀造提供原料，起到投糧的作用[2-4]。由此可見，大曲是影響白酒品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一。然而，大曲的工業(yè)生產(chǎn)仍面臨諸多問題，如制曲操作機(jī)械化程度較低、大曲發(fā)酵不穩(wěn)定以及同批次間和不同批次間大曲磚的品質(zhì)均存在差異等。在生產(chǎn)中保證大曲質(zhì)量穩(wěn)定完全依靠經(jīng)驗(yàn)以及簡(jiǎn)單理化指標(biāo)對(duì)發(fā)酵過程進(jìn)行控制[3]，仍然缺乏相應(yīng)的科學(xué)理論作為指導(dǎo)。

從傳統(tǒng)大曲生產(chǎn)過程來看，其特點(diǎn)是生料制曲、開放式培養(yǎng)、自然接種以及多種微生物發(fā)酵[5]。這些特點(diǎn)決定了大曲發(fā)酵是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，包含了一系列微生物群落演替、相互作用及與之關(guān)聯(lián)的生化反應(yīng)。因此，在大曲發(fā)酵過程中，蘊(yùn)含了諸多涉及微生物群落及功能的基礎(chǔ)科學(xué)問題。只有回答好這些科學(xué)問題才能加深對(duì)大曲發(fā)酵過程的客觀認(rèn)識(shí)，提出理性調(diào)控策略指導(dǎo)生產(chǎn)。

以“大曲”作為關(guān)鍵詞，在Web of Science（https://www.webofscience.com）和中國(guó)知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)近10 年已發(fā)表文獻(xiàn)檢索，并利用citespace軟件進(jìn)行計(jì)量分析，發(fā)現(xiàn)近10 年大曲越來越受到關(guān)注，論文發(fā)表數(shù)量逐年上升。在2021年論文發(fā)表數(shù)量為107 篇，截止至2022年9月已發(fā)表論文68 篇，其中包含SCI論文和中國(guó)核心期刊發(fā)表論文（圖1A）。大曲相關(guān)研究發(fā)表論文最多的是我國(guó)學(xué)者及研究機(jī)構(gòu)（圖1B）。分別對(duì)近10 年已發(fā)表SCI論文和中國(guó)知網(wǎng)收錄論文進(jìn)行關(guān)鍵詞共現(xiàn)圖譜分析，發(fā)現(xiàn)微生物多樣性、細(xì)菌群落、真菌群落、高通量測(cè)序、芳香化合物、風(fēng)味成分、環(huán)境條件、理化指標(biāo)、篩選分離、酶活力等關(guān)鍵詞高頻出現(xiàn)（圖1C、D）。這一結(jié)果表明微生物群落及其在大曲發(fā)酵中的功能是研究熱點(diǎn)之一。

圖1 近10 年（2013.1.1—2022.10.1）大曲相關(guān)研究文獻(xiàn)計(jì)量分析Fig.1 Bibliometric analysis of Daqu research in last decade (January 1st,2013–October 1st 2022)

本文對(duì)近期大曲發(fā)酵過程中微生物群落及其功能相關(guān)研究進(jìn)行綜述，介紹大曲微生物群落的組成、形成機(jī)制、演替規(guī)律及驅(qū)動(dòng)因子，闡述大曲中的功能微生物、功能酶及二者與風(fēng)味物質(zhì)形成的關(guān)系，并對(duì)大曲微生物群落相關(guān)研究進(jìn)行展望，以期為進(jìn)一步揭示大曲發(fā)酵機(jī)制提供參考。

1 不同類型大曲微生物群落結(jié)構(gòu)組成

大曲為酒醅發(fā)酵提供了微生物和相關(guān)酶，同時(shí)也是白酒風(fēng)味及其前體物質(zhì)的載體，其“菌、酶、風(fēng)味”的多樣性和豐富度決定了白酒的風(fēng)格[1,6]。因此，解析生產(chǎn)用曲中微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)于進(jìn)一步揭示微生物群落與風(fēng)味物質(zhì)形成的關(guān)系、加深白酒發(fā)酵機(jī)制的理解至關(guān)重要。根據(jù)發(fā)酵過程中大曲達(dá)到的最高溫度（頂溫），可將其分為高溫（頂溫60～70 ℃）、中溫（頂溫50～60 ℃）和低溫（頂溫45～50 ℃）大曲[7-9]，分別應(yīng)用于醬香、濃香、清香型白酒的生產(chǎn)[10]。因原料和發(fā)酵工藝的差異，3 種不同類型大曲中優(yōu)勢(shì)微生物和微生物群落結(jié)構(gòu)均不盡相同，其優(yōu)勢(shì)微生物如表1所示。

表1 3 種類型大曲優(yōu)勢(shì)微生物比較分析Table 1 Comparative analysis of dominant microorganisms in three types of Daqu

高溫大曲以小麥為原料，制曲過程中發(fā)酵頂溫為60～70 ℃[16]，是釀造醬香型白酒的主要用曲。高溫大曲細(xì)菌群落主要由嗜熱微生物組成，厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）是高溫大曲中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門[2]，子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）在真菌群落中占優(yōu)勢(shì)[11]。在醬香型高溫大曲制曲過程中，由于大曲處于曲房不同位置，溫度和水分含量等參數(shù)變化不同步，最終形成白色、黑色、黃色和紅色4 種不同類型的大曲[17]。在不同顏色大曲中，克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和嗜熱真菌屬（Thermoactinomyces）均為優(yōu)勢(shì)菌屬；黑曲和紅曲中糖多孢菌屬（Saccharopolymonas）和嗜熱真菌屬（Thermomyces）為優(yōu)勢(shì)菌屬；散囊菌目（Eurotiales）是黃曲中的優(yōu)勢(shì)類群。功能預(yù)測(cè)分析表明白曲和黃曲中編碼細(xì)菌酶的基因豐度更高，這些基因的高表達(dá)與克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）密切相關(guān)；黑曲中編碼真菌酶基因豐度最高，這些基因與嗜熱真菌屬（Thermomyces）相關(guān)[2,5]。

中溫大曲是釀造濃香型白酒的主要用曲[18]。中溫大曲中最常見的真菌是絲狀霉菌（Filamentous molds）和酵母菌，包括曲霉屬（Aspergillus）、根霉屬（Rhizopus）、支鏈霉菌屬（Amylomyces）、紅曲霉屬（Monascus）、脫胞菌屬（Absidia）、根毛霉屬（Rhizomucor）和毛霉屬（Mucor），酵母菌包括酵母菌屬（Saccharomycopsis）、伊薩氏菌屬（Issatchenkia）、酵母屬（Saccharomyces）、畢赤酵母屬（Pichia）、念珠菌屬（Candida）和紅酵母屬（Rhodotorula）。大曲微生物群落中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、鏈霉菌屬（Streptomyces）和醋桿菌屬（Acetobacter）[12-13]。

低溫大曲是清香型白酒的糖化發(fā)酵劑。其中細(xì)菌與真菌相對(duì)豐度比在4∶1以上。其中厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）是優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，而芽孢桿菌屬（Bacillus）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和嗜熱放線菌屬（Thermoactinomyces）是優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。子囊菌門（Ascomycota）是優(yōu)勢(shì)真菌門，而酵母菌屬（Saccharomycopsis）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）和紅曲霉屬（Monascus）是優(yōu)勢(shì)真菌屬[14]。根據(jù)不同制曲工藝可生產(chǎn)出3 種感官和理化性質(zhì)截然不同的低溫大曲，分別為紅心曲（頂溫（47±1）℃）、后火曲（頂溫：（49±1）℃）和清茬曲（頂溫：（45±1）℃）[19-20]。在清香型白酒釀造中，紅心、后火和清茬曲一般以質(zhì)量比3∶4∶3的比例混合后投入生產(chǎn)中使用[21]。在屬水平，3 種低溫大曲各自獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)微生物數(shù)量眾多，而這些微生物能夠作為區(qū)分不同類型低溫大曲的潛在生物標(biāo)志物。清茬曲中顯著富集的細(xì)菌主要屬于放線菌綱（Actinomycetia）和假諾卡氏菌目（Pseudonocardiales），優(yōu)勢(shì)菌屬為糖多孢菌屬（Saccharopolyspora），優(yōu)勢(shì)真菌主要是隸屬于子囊菌門（Ascomycota）的嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）。后火曲中顯著富集的細(xì)菌是厚壁菌門的芽孢桿菌屬（Bacillus）和梭狀芽孢桿菌屬（Clostridia），顯著富集的真菌主要屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和毛霉菌門（Mucoromycota）。紅心曲中顯著富集的細(xì)菌主要屬于鏈霉菌科（Streptomycetaceae）、乳桿菌目（Lactobacillales）和變形桿菌門（Proteobacteria）（尤其是腸桿菌科（Enterobacteriaceae）），顯著富集的真菌屬于酵母目（Saccharomycetes）[14-15]。

厚壁菌門（Firmicutes）中的芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）以及放線菌門（Actinobacteria）的嗜熱放線菌屬（Thermoactinomyces）在3 種大曲中均為顯著富集的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，而子囊菌門（Ascomycota）中的酵母菌屬（Saccharomyces）和嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）是3 種大曲中共有的優(yōu)勢(shì)真菌。高溫大曲中獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)微生物有葡萄球菌（Staphylococcus）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）和嗜熱真菌屬（Thermomyces）。其中，葡萄球菌（Staphylococcus）的存在可能與高溫大曲加工環(huán)境，尤其是女工赤腳踩制這一特殊工藝有關(guān)[2]；此外，高溫大曲發(fā)酵過程中60～70 ℃的頂溫使得大部分微生物無法生長(zhǎng)與繁殖，而只有耐高溫的微生物能夠顯著富集，如嗜熱真菌屬。中溫大曲中絲狀霉菌為優(yōu)勢(shì)微生物，如曲霉屬（Aspergillus）和根霉屬（Rhizopus）。低溫大曲中適應(yīng)中低溫環(huán)境的微生物占據(jù)優(yōu)勢(shì)，如細(xì)菌放線菌綱（Actinomycetia）和假諾卡氏菌目（Pseudonocardiales）等。總之，不同類型大曲中優(yōu)勢(shì)微生物不同，這是形成我國(guó)白酒香型種類豐富的原因之一。

2 大曲中微生物群落溯源及演替規(guī)律

由于大曲制曲是自然接種和開放式培養(yǎng)，因此原料和環(huán)境是其微生物來源。在這種生產(chǎn)模式下，追溯大曲微生物具體來源及解析微生物群落動(dòng)態(tài)演替規(guī)律能夠?yàn)檎{(diào)控大曲發(fā)酵提供理性指導(dǎo)。對(duì)中溫大曲微生物來源進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)真菌群落諸如扣囊覆膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）、米根霉（Rhizopus oryzae）、嗜鹽梗孢酵母（Sterigmatomyces elviae）、黃曲霉/米曲霉（Aspergillus flavus/oryzae）、伯頓斯孢畢赤酵母（Hyphopichia burtonii）、傘狀毛霉菌（Lichtheimia corymbifera）等主要來源于制曲環(huán)境，包括工具和室內(nèi)地面[22]。大多數(shù)細(xì)菌群落主要來源于原料，包括α變形菌綱（Alphaproteobacteria）、γ變形菌綱（Gammaproteobacteria）和芽孢桿菌屬（Bacilli）[22]。在大曲發(fā)酵過程中，不利于白酒發(fā)酵的α變形菌綱和γ變形菌綱相對(duì)豐度下降，而具有發(fā)酵功能的酵母菌和芽孢桿菌相對(duì)豐度增加[22]。在高溫大曲微生物群落來源的研究中，同樣也發(fā)現(xiàn)原料小麥?zhǔn)谴笄旱闹匾獊碓碵23]。

在大曲發(fā)酵開始時(shí)，由原料或環(huán)境中引入大曲的微生物群落會(huì)在發(fā)酵過程中被另一個(gè)微生物群落所代替，這種時(shí)時(shí)刻刻發(fā)生在大曲中的現(xiàn)象叫做微生物群落演替[13]。高溫大曲制曲過程可分為6 個(gè)關(guān)鍵階段，分別為入房堆曲、第一次翻曲、第二次翻曲、干火、后火和出房階段，不同的發(fā)酵階段優(yōu)勢(shì)微生物不同。在高溫大曲制曲初期，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為乳桿菌屬和魏斯氏菌屬（Weissella）；隨著大曲發(fā)酵溫度升高，無色桿菌屬（Achromobacter）、寡養(yǎng)單孢菌屬（Stenotrophomonas）、代爾夫特菌屬（Delftia）在第一次翻曲、第二次翻曲和干火階段成為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌；出房階段發(fā)酵溫度下降，糖多孢菌（Saccharopolyspora）、嗜熱放線菌屬（Thermoactinomyces）、巖石芽孢桿菌屬（Scopulibacillus）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）和芽孢桿菌屬（Bacillus）的相對(duì)豐度上升。威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）是初始生產(chǎn)階段的主要優(yōu)勢(shì)真菌，但隨著發(fā)酵溫度的升高而消亡。此外，復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）和嗜熱子囊菌（Thermoascus）由于能夠適應(yīng)高溫，其相對(duì)豐度逐漸增加，并且嗜熱子囊菌在干火期、后火期和出房期大曲中逐漸積累，到出房期，嗜熱真菌屬（Thermomyces）和嗜熱子囊菌成為優(yōu)勢(shì)真菌[24]。濃香型中溫大曲中細(xì)菌和真菌均具有明顯的時(shí)間演替規(guī)律，根據(jù)發(fā)酵過程中不同階段微生物群落的相似性，將整個(gè)發(fā)酵過程分為兩個(gè)階段：P1期（發(fā)酵第1～6天）和P2期（發(fā)酵第7～28天），P1期和P2期的微生物群落具有顯著的差異。P1期相對(duì)豐度較高的微生物屬為魏斯氏菌屬（Weissella）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和嗜熱放線菌屬（Thermoactinomyces）。P2期魏斯氏菌屬（Weissella）和芽孢桿菌屬（Bacillus）相對(duì)豐度有所下降，嗜熱放線菌屬（Thermoactinomyces）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）的相對(duì)豐度上升。并且，P1期的優(yōu)勢(shì)真菌較多，而P2期時(shí)僅嗜熱子囊菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)[13]。另一項(xiàng)針對(duì)中溫大曲的研究中觀察到相似情況，在粉碎原料壓制成曲塊時(shí)，其中僅白粉病菌（Blumeria）相對(duì)豐度較高，與原料中的微生物群落組成相似，此時(shí)環(huán)境微生物還未進(jìn)入大曲中生長(zhǎng)繁殖。在移入曲房培菌期間，由于曲房環(huán)境適宜，大曲中真菌豐富度和多樣性急劇增加，此時(shí)伊薩酵母屬（Issatchenkia）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、根霉屬（Rhizopus）、根毛霉屬（Rhizomucor）相對(duì)豐度升高，魏斯氏菌屬（Weissella）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）等細(xì)菌的相對(duì)豐度也有所升高。培菌期結(jié)束進(jìn)入貯藏期后，微生物的種類有所下降，最終趨于穩(wěn)定[25]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵開始前，中溫大曲中一些細(xì)菌和鏈霉菌（Streptomyces）相對(duì)豐度較高。發(fā)酵前4 d，大多數(shù)細(xì)菌類群和幾種真菌類群快速繁殖，大曲發(fā)酵第4～12天溫度不斷升高導(dǎo)致大多數(shù)微生物生長(zhǎng)受到抑制，而耐熱類群，包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）和嗜熱真菌屬（Thermomyces），能夠存活并繼續(xù)繁殖。通過將中溫大曲放置在37 ℃培養(yǎng)箱中降低大曲品溫，可以降低微生物群落中耐熱類群的相對(duì)豐度[12]。

通過上述研究發(fā)現(xiàn)大曲在制曲過程中微生物群落總體呈現(xiàn)如下演替規(guī)律：發(fā)酵開始時(shí)，來自原料、環(huán)境和工具的微生物會(huì)進(jìn)入到大曲并分解利用原料中的大分子物質(zhì)，此時(shí)相對(duì)豐度較高的微生物屬為芽孢桿菌（Bacillus）、魏斯氏菌（Weissella）與一些霉菌如根霉屬（Rhizopus）、根毛霉屬（Rhizomucor）等糖化菌；發(fā)酵過程中溫度不斷升高，無法適應(yīng)高溫環(huán)境的微生物的豐度會(huì)逐漸下降，能夠耐受高溫的微生物在發(fā)酵中期占據(jù)優(yōu)勢(shì)，如嗜熱放線菌屬（Thermoactinomyces）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）等；發(fā)酵結(jié)束進(jìn)入貯曲階段后，微生物的組成逐漸趨于穩(wěn)定。

3 大曲微生物群落演替驅(qū)動(dòng)因子

大曲微生物群落演替的發(fā)生是微生物適應(yīng)特定環(huán)境條件的結(jié)果，根據(jù)生態(tài)位理論，微生物群落會(huì)受到生物和非生物驅(qū)動(dòng)因子的共同影響[26]。大曲中微生物之間相互作用是影響微生物群落結(jié)構(gòu)和推動(dòng)其演替的主要生物驅(qū)動(dòng)因子[27]。如乳酸菌是大曲發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)微生物，其利用原料產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸，導(dǎo)致大曲pH值降低，抑制了其他不耐酸微生物尤其是梭狀芽孢桿菌和產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)[14]。此外，有研究表明乳酸菌可產(chǎn)生乳酸鏈球菌素、乳酸菌素等抗生素和細(xì)菌素來拮抗芽孢桿菌及其他革蘭氏陽(yáng)性菌[28]。能夠適應(yīng)高溫和低濕度環(huán)境的酵母菌在大曲整個(gè)發(fā)酵過程中占主導(dǎo)地位[29]，而畢赤酵母會(huì)強(qiáng)烈地抑制對(duì)酒精發(fā)酵產(chǎn)生不利影響的芽孢桿菌和絲狀真菌的生長(zhǎng)[30]。在低溫大曲中顯著富集的優(yōu)勢(shì)真菌根霉屬（Rhizopus）具有很強(qiáng)的淀粉酶生產(chǎn)能力，可以將原料中淀粉直接降解為酵母菌可利用的還原糖，因此，根霉屬（Rhizopus）真菌可以刺激酵母的生長(zhǎng)[31]。大曲微生物群落演替除了受微生物類群間相互作用驅(qū)動(dòng)外，環(huán)境理化因子是主要非生物驅(qū)動(dòng)因子，也是可以人為控制的因素。加深環(huán)境理化驅(qū)動(dòng)因子對(duì)大曲發(fā)酵影響的認(rèn)識(shí)對(duì)提出更科學(xué)的大曲發(fā)酵調(diào)控策略具有重要意義。溫度、濕度、pH值和酸度等因素是大曲微生物群落演替主要環(huán)境理化驅(qū)動(dòng)因子[32-35]。酸度、水分和溫度是中溫大曲中細(xì)菌群落演替的環(huán)境驅(qū)動(dòng)因子，真菌群落演替主要由水分驅(qū)動(dòng)[13]。進(jìn)一步對(duì)中溫大曲發(fā)酵過程環(huán)境變化與微生物群落間相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大曲微生物群落演替驅(qū)動(dòng)因子會(huì)隨著發(fā)酵時(shí)間的推移發(fā)生變化。在發(fā)酵前12 d，溫度升高與微生物群落快速演替顯著相關(guān)，而發(fā)酵12 d后溫度變化和微生物群落演替并無顯著相關(guān)性。大曲發(fā)酵時(shí)內(nèi)部產(chǎn)生的生物熱是大曲微生物群落演替不可忽視的驅(qū)動(dòng)因子之一。在發(fā)酵前4 d，曲磚內(nèi)伴隨著微生物快速繁殖產(chǎn)生生物熱。然后，生物熱作為主要內(nèi)源性驅(qū)動(dòng)因子在第4～12天促進(jìn)微生物群落演替。人為降低大曲磚中生物熱降低了耐熱類微生物的相對(duì)豐度，包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、嗜熱放線菌屬（Thermoactinomyces）和嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）[12]。對(duì)產(chǎn)自青海的低溫大曲研究發(fā)現(xiàn)，水分和溫度顯著影響核心真菌群，其中水分是根霉屬（Rhizopus）、畢赤酵母屬（Pichia）、異常維克漢遜酵母屬（Wickerhamomyces）、酵母菌屬（Saccharomycopsis）和曲霉屬（Aspergillus）演替的驅(qū)動(dòng)因子，而溫度是酵母屬（Saccharomyces）演替的驅(qū)動(dòng)因子[36]。

4 貯曲過程中大曲微生物群落及理化指標(biāo)的變化

大曲發(fā)酵過程為大曲品質(zhì)奠定了基礎(chǔ)，但剛發(fā)酵完成的大曲并不能直接投入釀酒生產(chǎn)，成熟的大曲通常存放在通風(fēng)良好的開放式房間一段時(shí)間，這一過程稱為貯曲[37]。在低溫大曲貯曲階段，微生物菌群會(huì)隨著外部環(huán)境如水分和溫度等的變化而不斷變化。貯曲前，細(xì)菌群落中以泛菌屬（Pantoea）為主，真菌群落復(fù)膜孢酵母菌屬（Saccharomycopsis）、未被分類的發(fā)菌科（Trichocomaceae_unclassifified）和畢赤酵母屬（Pichia）的相對(duì)豐度較高。在之后的貯曲過程中，乳桿菌屬（Lactobacillus）和魏斯氏菌屬（Weissella）在貯曲前2 個(gè)月內(nèi)逐漸成為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬；真菌群落中，復(fù)膜孢酵孢母菌屬（Saccharomycopsis）、未被分類的發(fā)菌科（Trichocomaceae_unclassifified）和畢赤酵母屬（Pichia）的相對(duì)豐度較高，隨著貯曲的進(jìn)行，未被分類的發(fā)菌科（Trichocomaceae_unclassifified）相對(duì)豐度降低，最終在貯曲2 個(gè)月后形成以未被分類的發(fā)菌科（Trichocomaceae_unclassifified），復(fù)膜孢酵母菌屬（Saccharomycopsis）、畢赤酵母屬（Pichia）、Tremellales_unclassifified為主的真菌群落結(jié)構(gòu)。上述研究結(jié)果表明，發(fā)酵后大曲中的微生物依然保持活躍，而貯曲可以促進(jìn)復(fù)雜的微生物群落結(jié)構(gòu)達(dá)到平衡并趨于穩(wěn)定，這對(duì)于酒醅發(fā)酵和白酒質(zhì)量至關(guān)重要[38]?；钴S的微生物群落亦能導(dǎo)致曲磚內(nèi)酶和代謝物含量不斷變化[38]，研究發(fā)現(xiàn)貯曲過程中微生物菌群與大曲理化性質(zhì)及風(fēng)味成分之間顯著相關(guān)，通過貯曲能夠去除令人不快的揮發(fā)性成分，穩(wěn)定大曲風(fēng)味結(jié)構(gòu)[39]。隨著大曲貯藏期的延長(zhǎng)，其理化性質(zhì)和酶學(xué)指標(biāo)均有不同程度的變化：機(jī)械壓制大曲和人工壓制大曲在貯藏過程中水分含量和淀粉含量均呈現(xiàn)平緩下降趨勢(shì)，酸度呈持續(xù)的增高趨勢(shì)，同時(shí)，機(jī)械壓制大曲糖化力、液化力、發(fā)酵活性、酯化力均持續(xù)下降；而人工壓制大曲除發(fā)酵活性在貯曲7 個(gè)月之內(nèi)呈顯著的增高趨勢(shì)之外，其余酶學(xué)指標(biāo)均呈下降趨勢(shì)[4]。機(jī)械壓制生產(chǎn)的中溫大曲有效貯藏時(shí)間為1～5 個(gè)月，石磨和人工壓制中溫大曲最長(zhǎng)能貯存4 個(gè)月。人工壓制生產(chǎn)的中溫大曲在貯藏期第5個(gè)月（第210天）淀粉含量低于QB/T 4259—2011《濃香大曲》的規(guī)定（50.0～65.0 g/100 g）。這可能是由于毛霉菌屬（Mucoromycota）和芽孢桿菌屬（Bacillus）分別在貯曲第3個(gè)月和第4個(gè)月后相對(duì)豐度顯著上升，而芽孢桿菌屬和毛霉菌屬作為重要的糖化菌能將淀粉分解成小分子寡糖和單糖，導(dǎo)致淀粉含量降低[40]。乳酸菌在中溫大曲貯曲的整個(gè)過程占據(jù)優(yōu)勢(shì)；醋酸桿菌屬（Acetobacter）在中溫大曲貯曲后期相對(duì)豐度較高，并且可將乙醇氧化成乙酸[41]。因此，機(jī)械壓制中溫大曲和人工壓制中溫大曲在整個(gè)貯藏期間酸度持續(xù)升高，并在貯藏第6 個(gè)月（第240天）超過QB/T 4259—2011規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)值（0.3～1.5 mmol/10 g）[38,40]。綜上所述，貯藏期應(yīng)不超出一定的時(shí)間范圍，以免大曲變質(zhì)造成糧食浪費(fèi)。

5 大曲微生物功能研究進(jìn)展

制曲過程中紛繁復(fù)雜的微生物不斷演替更迭，并發(fā)揮著各自的功能。研究表明，大曲發(fā)酵體系中主要集成了酵母菌、霉菌和細(xì)菌三大微生物模塊[42-43]。

酵母菌是一種在大曲中顯著富集的優(yōu)勢(shì)真菌，可以提高大曲中淀粉糖化力、酸性蛋白酶活性以及乙醇合成速率[44]，從而影響白酒的風(fēng)味和品質(zhì)。同時(shí)，芳香化合物是一類對(duì)白酒整體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的關(guān)鍵香氣化合物，而酵母菌作為白酒主要產(chǎn)香菌之一，其相對(duì)豐度與芳香族化合物的積累量呈顯著正相關(guān)[45]，如乙酸乙酯和丁酸乙酯等揮發(fā)性香氣化合物已經(jīng)被證實(shí)由酵母菌產(chǎn)生[44]。目前，研究表明在種水平上顯著富集的扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）被認(rèn)為是最好的產(chǎn)酯和產(chǎn)淀粉酶的酵母菌[43,46]。

霉菌可以分泌多種水解酶，如糖化酶、蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，降解原料中的大分子物質(zhì)，如淀粉和蛋白質(zhì)，增加整個(gè)反應(yīng)體系中糖和氨基酸的含量[47]，這不僅為其他微生物的生長(zhǎng)和繁殖提供了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并且極大地促進(jìn)了白酒風(fēng)味化合物的合成。如高溫大曲中曲霉屬（Aspergillus）和鏈孢菌屬（Alternaria）作為小麥源真菌屬微生物在大曲發(fā)酵早期階段參與糖異生I、蔗糖降解III、磷酸戊糖途徑、5-氨基咪唑核糖核苷酸合成I、甲基酮合成和鳥苷二磷酸-甘露糖生物合成等多種代謝途徑，這可能對(duì)大曲中風(fēng)味物質(zhì)的形成和菌群演替發(fā)揮重要作用[48]。其中，曲霉屬可產(chǎn)生酸性或堿性蛋白酶等大量胞外酶，產(chǎn)生酯類和芳烴類等多種次級(jí)代謝物[49]。中溫大曲中毛霉（Mucorales）和散囊菌目（Eurotiales）是潛在優(yōu)勢(shì)菌群，負(fù)責(zé)大曲中相關(guān)降解酶的分泌和風(fēng)味前體化合物的產(chǎn)生，絲衣霉屬（Trichoderma）和曲霉屬（Aspergillus）分別參與愈創(chuàng)木酚和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的生物合成[50]。

細(xì)菌在大曲發(fā)酵過程中同樣發(fā)揮至關(guān)重要的作用。首先，細(xì)菌為發(fā)酵提供酸性環(huán)境。中溫大曲發(fā)酵早期出現(xiàn)的酸性熱環(huán)境主要是由乳酸桿菌和橫梗霉屬（Lichtheimia）的分解代謝活動(dòng)造成的，這可能有助于微生物群落的有效自我馴化[50]；其次，產(chǎn)生蛋白酶、果膠酶、脂肪酶、糖化酶和纖維素酶等酶類，并參與多種代謝途徑。高溫大曲中鑒定出的乳酸桿菌目（Lactobacillales）可產(chǎn)生豐富的酯酶和脂肪酶，與大曲主要風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生密切相關(guān)，也是甲酯和乙酯類化合物主要產(chǎn)生菌[51]。吡嗪類化合物主要由芽孢桿菌和曲霉產(chǎn)生，芽孢桿菌還賦予大曲特有的發(fā)酵大豆的香氣[52]。中溫大曲中魏斯氏菌屬（Weissella）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）等細(xì)菌參與了2,3-丁二醇代謝，高溫放線菌（Thermoactinomyces）屬參與了丁酸代謝[50]。在低溫大曲發(fā)酵過程中細(xì)菌發(fā)揮20 種不同的功能，并可以將其分為3 類：代謝、信息存儲(chǔ)和處理以及細(xì)胞過程與信號(hào)傳導(dǎo)。與代謝相關(guān)的功能表現(xiàn)出最高豐度，主要包括氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、轉(zhuǎn)錄、能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化、翻譯等。在此基礎(chǔ)上，低溫大曲中的細(xì)菌能夠促進(jìn)或抑制風(fēng)味物質(zhì)的積累[14,53]，例如乳酸菌可以利用原料中的糖類產(chǎn)生乳酸和其他化合物，因此其相對(duì)豐度與酸味、鮮味和澀味顯著相關(guān)。乳酸菌產(chǎn)生的乳酸是乳酸乙酯的前體化合物，而乳酸乙酯是清香型白酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，可增強(qiáng)白酒的醇厚風(fēng)味和甜味，并能降低乙醇對(duì)感官的影響，延長(zhǎng)回味[14,54-56]。芽孢桿菌相對(duì)豐度與對(duì)白酒風(fēng)味最關(guān)鍵的兩個(gè)指標(biāo)（苦味和酸味）呈負(fù)相關(guān)，它可以抑制苦味的產(chǎn)生以及平衡風(fēng)味。因此，富含芽孢桿菌的后火曲在生產(chǎn)中可用于調(diào)節(jié)清香型白酒的苦味和酸味。嗜熱子囊菌相對(duì)豐度與含硫有機(jī)化合物的產(chǎn)生呈顯著負(fù)相關(guān)，含硫有機(jī)化合物是各種發(fā)酵食品和酒精飲料中的重要風(fēng)味物質(zhì)，具有低檢測(cè)閾值和強(qiáng)感官特性[57]。白酒中的含硫有機(jī)化合物通常會(huì)產(chǎn)生一種令人不快的香氣，類似于洋蔥和煮熟白菜散發(fā)出的氣味[56]。嗜熱子囊菌產(chǎn)生豐富的水解酶，其具有高熱穩(wěn)定性和活力，可有效抑制含硫有機(jī)化合物的生成，防止不良?xì)馕兜漠a(chǎn)生[14]。

大曲是白酒釀造的糖化發(fā)酵劑，亦是白酒香氣來源之一，以上研究表明這些功能的發(fā)揮依賴于微生物分泌的各種酶類[58]。針對(duì)大曲中酶種類和功能的研究，傳統(tǒng)方法主要通過測(cè)定大曲中酶的活力、催化底物以及產(chǎn)物鑒定[59]。近年來，利用宏基因組學(xué)、宏蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)，鑒定出了大曲中復(fù)雜的酶系統(tǒng)，根據(jù)CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)被注釋為6 類：糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GH）、糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferases，GT）、碳水化合物結(jié)合模塊（carbohydrate-binding module，CBM）、碳水化合物酯酶（carbohydrate esterases，CE）、輔助模塊酶（auxiliary activities，AA）和多糖裂解酶（polysaccharide lyases，PL）。它們可以組裝或降解自然界廣泛存在的碳水化合物，例如用于能量?jī)?chǔ)存的淀粉，用于結(jié)構(gòu)維持的纖維素、糖復(fù)合物。在大曲中，GT和GH的相對(duì)豐度最高，PL最低[53]。GHs是一組重要的水解糖苷鍵的酶，與淀粉液化、糖化和纖維素降解有關(guān)[60]。GT與寡糖和多糖的生物合成有關(guān)，表明大曲中含有能合成多糖的微生物。與釀造黃酒用的麥曲相比，大曲具有較高的蛋白酶和纖維素酶活性、較低的葡萄糖淀粉酶和淀粉酶活性[53]。醬香型高溫大曲中的優(yōu)勢(shì)微生物巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）分泌的纖維素酶可水解大曲和高粱纖維素中的β-1,4-糖苷鍵，生成其他微生物可利用的纖維二糖和葡萄糖，有利于制曲過程中微生物的生長(zhǎng)和富集。紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis）可產(chǎn)生蛋白酶和氨基酸酶，水解大曲中的蛋白質(zhì)不僅可為微生物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其形成的氨基酸還可與葡萄糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，為白酒香氣提供前體物質(zhì)。葡萄球菌（Staphylococcus）代謝可產(chǎn)生水解長(zhǎng)鏈脂肪酸和甘油的脂肪酶并生成游離脂肪酸和甘油，這構(gòu)成了白酒中的香味物質(zhì)或香味前體物質(zhì)[61]。

6 結(jié)語(yǔ)

目前對(duì)于大曲發(fā)酵過程及生產(chǎn)用曲中微生物群落結(jié)構(gòu)及功能有了較為清晰的認(rèn)識(shí)，但是生產(chǎn)中大曲發(fā)酵是否正常、成曲質(zhì)量等的評(píng)價(jià)主要還是依賴于感官經(jīng)驗(yàn)和簡(jiǎn)單理化指標(biāo)。對(duì)于大曲發(fā)酵的內(nèi)在機(jī)制并沒有完全清楚，針對(duì)這一問題的研究依然存在挑戰(zhàn)。首先，當(dāng)前關(guān)于大曲微生物群落的研究多采用不依賴于分離培養(yǎng)的高通量測(cè)序技術(shù)，包括擴(kuò)增子測(cè)序和宏基因組測(cè)序。不管是利用哪種方法，數(shù)據(jù)均反映的是樣本中全部微生物的信息，并不能區(qū)分活的和已經(jīng)死亡的微生物。而根據(jù)這些數(shù)據(jù)得出的結(jié)果與真實(shí)情況相比會(huì)產(chǎn)生滯后效應(yīng)，阻礙對(duì)微生物功能及大曲發(fā)酵機(jī)制的理解。因此，大曲發(fā)酵過程中活微生物群落實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化應(yīng)該被更多的關(guān)注，而培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)[62]、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)[63]、基于疊氮溴化丙錠處理的擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)[64]都是有力的研究手段。其次，關(guān)于影響大曲發(fā)酵過程中微生物群落演替的推動(dòng)因子，先前研究報(bào)道主要關(guān)注點(diǎn)在理化因子，諸如溫度、濕度、水分含量、酸度等。其中，溫度是影響大曲發(fā)酵最重要的因素之一，生產(chǎn)中通過調(diào)節(jié)環(huán)境溫度調(diào)控大曲發(fā)酵中微生物群落的生長(zhǎng)繁殖。然而，值得注意的是，溫度在影響微生物群落演替過程中既是因也是果。大曲發(fā)酵過程中，觀測(cè)溫度可以分為曲房環(huán)境溫度和大曲曲磚內(nèi)部溫度。環(huán)境溫度作為外部可控因素是大曲溫度和微生物群落變化的因；但是大曲溫度不止受到環(huán)境溫度的影響，微生物代謝活動(dòng)產(chǎn)生的生物熱對(duì)大曲溫度也產(chǎn)生巨大且顯著的影響，此時(shí)大曲內(nèi)部溫度是生物熱引起的結(jié)果。而關(guān)于微生物群落對(duì)生物熱的貢獻(xiàn)以及生物熱反向?qū)Υ笄l(fā)酵及微生物群落演替的影響目前還知之甚少。此外，除了理化因子，大曲中含量和種類不斷變化的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)亦是推動(dòng)大曲微生物群落演替及發(fā)酵進(jìn)程的重要因素，而相關(guān)研究報(bào)道較少。魏軍林等[65]針對(duì)營(yíng)養(yǎng)相互作用對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物群落構(gòu)建的推動(dòng)作用進(jìn)行了綜述，提出深入解析傳統(tǒng)發(fā)酵食品中營(yíng)養(yǎng)相互作用對(duì)微生物群落構(gòu)建的影響有助于更全面地認(rèn)識(shí)其發(fā)酵機(jī)制，為制定理性調(diào)控策略提供了依據(jù)。第三，關(guān)于微生物群落互作研究主要還是基于測(cè)序數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析及預(yù)測(cè)，或者是兩種微生物群落間的體外互作分析，對(duì)于兩種以上更為復(fù)雜的高階微生物互作研究開展較少，解析大曲內(nèi)活微生物群落間互作機(jī)制更是研究難點(diǎn)。面對(duì)這些挑戰(zhàn)，整合宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、培養(yǎng)組學(xué)等技術(shù)手段，多組學(xué)技術(shù)聯(lián)用將能夠深入大曲發(fā)酵機(jī)制研究[66]。實(shí)際上，這些挑戰(zhàn)也是大多數(shù)傳統(tǒng)發(fā)酵食品發(fā)酵機(jī)制研究所要面對(duì)的，深入解析上述科學(xué)問題將有助于進(jìn)一步揭示包括大曲在內(nèi)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的發(fā)酵機(jī)制，助力其發(fā)酵過程控制與高效生產(chǎn)。