王 朝 趙 煜

[1.天津市兒童醫(yī)院（天津大學兒童醫(yī)院）天津市兒科研究所 天津市兒童出生缺陷防治重點實驗室，天津 300134；2.天津市兒童醫(yī)院（天津大學兒童醫(yī)院）消化科，天津 300134]

在感染性疾病的治療中，抗菌藥物一直發(fā)揮著不可替代的重要作用，但由于不合理用藥的出現(xiàn)和持續(xù)，很多病原菌發(fā)生抗藥性變異，抗菌藥物的殺滅或抑制作用逐漸降低，甚至喪失，使感染性疾病的治療面臨重大挑戰(zhàn)。在細菌抵抗抗菌藥物作用的過程中，除基因的抗藥性變異外，表型變異導致的持留菌也扮演著重要角色。持留菌是細菌在抗菌藥物等環(huán)境壓力下出現(xiàn)的極小一部分可以耐受環(huán)境變化并生存下來的細菌亞群，這類細菌在基因上并未發(fā)生變異，在環(huán)境壓力去除后繼續(xù)生長繁殖所形成的新菌群會保持與最初菌群相同的抗菌藥物敏感性[1]。持留菌會使感染性疾病遷延不愈，加大了臨床治療難度，但目前專門針對持留菌的藥物少之又少。本文對近年來有關(guān)持留菌形成機制和清除策略的研究進行綜述。

1 持留菌的形成機制

細菌的持留現(xiàn)象很早就被發(fā)現(xiàn)，但其發(fā)生、發(fā)展機制目前尚不完全清楚。根據(jù)形成原因，持留菌可分為誘導形成和自發(fā)形成兩大類。誘導形成即特定環(huán)境壓力導致的持留菌形成；自發(fā)形成指即使在非壓力環(huán)境下，仍有一定比例的持留菌形成[1]。已知的一些細菌生理或耐藥機制與持留很相似，其中最主要的就是細菌休眠和靶標失活，但這2種機制或現(xiàn)象并不能完全解釋持留菌的復雜生理機制。與作為“被動防御”的休眠相比，持留其實是一種增強藥物外排作用的“主動防御”[2]。例如，細胞內(nèi)的金黃色葡萄球菌持留菌保持代謝活性，并產(chǎn)生與某些應(yīng)激反應(yīng)一致的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[3]。持留現(xiàn)象屬于低頻表型變異，且具有高度異質(zhì)性，其形成與細胞生理的很多基本過程有關(guān)，包括但不限于能量代謝、復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、胞內(nèi)藥物濃度和防御機制[4]。持留菌的形成也與饑餓、宿主免疫和抗菌藥物的頻繁刺激等宏觀環(huán)境有關(guān)，并能從進化角度進行闡釋[5]。持留菌在上述不同層面的變化會體現(xiàn)在細菌不同的生理通路或分子機制中。

1.1 細菌毒素-抗毒素（toxin-antitoxin，TA）系統(tǒng)

TA系統(tǒng)是一類豐富的基因元件，編碼一類能夠抑制細胞生長的毒素（蛋白質(zhì)或RNA）和一類能夠抵消毒素作用的抗毒素。大多數(shù)毒素是干擾DNA復制或翻譯的酶，但也有各種各樣的活性分子和細胞靶標?？苟舅匾彩怯傻鞍踪|(zhì)或RNA構(gòu)成的，單獨或者與其他信號元件一起對TA系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄或翻譯進行調(diào)節(jié)，進而控制同源毒素。根據(jù)抗毒素的性質(zhì)和抑制毒素的方式，TA系統(tǒng)可分為多種類型[6]。在對結(jié)核分枝桿菌的研究中，一種Ⅱ型TA系統(tǒng)被認為可能發(fā)揮持留菌形成的分子開關(guān)的作用，有望成為開發(fā)更短、更有效的結(jié)核病治療方案的藥物靶點[7]。有研究者在金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)了一種I型RNA抗毒素SprF1，可以通過結(jié)合核糖體減弱翻譯促進持留菌的形成[8]。有研究在銅綠假單胞菌中鑒定出一種通過減少煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）的方式促進持留菌形成的新的TA系統(tǒng)，其編碼基因分別為PA14_51010和PA14_51020[9]。有研究者對Hip激酶進行了全面的分析，發(fā)現(xiàn)了7個新的激酶家族，擴展了這一家族的多樣性，為Hip激酶超家族的研究開辟了新途徑[10]。

1.2 應(yīng)激反應(yīng)

目前，大多數(shù)研究都集中于眾所周知的應(yīng)激反應(yīng)，如饑餓、SOS應(yīng)激反應(yīng)、活性氧（reactive oxygen species，ROS）和DNA損傷。由于靜止期持留菌水平的增加，許多研究者認為，饑餓、饑餓誘導的應(yīng)激反應(yīng)和其信號素鳥苷酸四（五）磷酸[guanosine pentaphosphate or guanosine tetraphosphate，（p） ppGpp]是持留菌發(fā)生、發(fā)展的依賴因素。（p） ppGpp水平的升高會使翻譯停止，使復制受到抑制，并通過促進RNA聚合酶的回溯參與DNA修復。缺乏relA的突變體通常由于（p）ppGpp水平降低或應(yīng)激反應(yīng)改變而出現(xiàn)較低水平的持留現(xiàn)象[11]。SOS應(yīng)激反應(yīng)的失活或DNA修復機制的損傷會降低持留水平[12]。低水平的DNA損傷只在能夠觸發(fā)SOS應(yīng)答的菌株和經(jīng)歷輕度SOS誘導的細胞中增加持留水平。大腸埃希菌在靜止期，持留菌只見于某種處理后出現(xiàn)于恢復期的功能性SOS應(yīng)答和DNA修復過程[12]。提示持留的發(fā)生依賴于SOS應(yīng)激反應(yīng)，也依賴于功能正常的DNA修復機制。ROS是免疫系統(tǒng)清除體內(nèi)細菌的重要因子，殺菌類抗菌藥物的致死作用有少部分源于ROS，此類抗菌藥物通過刺激呼吸和消耗主要在三羧酸循環(huán)中形成的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）來誘導ROS的形成，因此ROS很有可能也參與了持留菌的形成。在鮑曼不動桿菌中，群體感知依賴的持留誘導也會導致產(chǎn)生對抗ROS的物質(zhì)，如過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的增加，考慮到進入靜止期后持留菌會增加。有研究者將注意力集中在群體感應(yīng)和細菌間的通信上，發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌產(chǎn)生的銅綠菌素在鮑曼不動桿菌中表現(xiàn)出跨菌種持留誘導[13]。這表明在自然微生物環(huán)境中，群體感應(yīng)和細菌間通信誘導的持留現(xiàn)象可能比預(yù)想的更為普遍。

1.3 生態(tài)學與持留菌形成

無論是在不同物種之間，還是在同一物種的不同菌株或分離物之間，細菌的持留水平在自然界中均有很大的差異[14]，造成這種差異的原因仍然是一個有爭議的問題。VAN等[15]認為，持留是由進化精心設(shè)計和塑造的用以抵御不利條件的特殊策略，它是生命過程中不可避免的“副作用”。目前尚缺乏關(guān)于持留菌應(yīng)對抗菌藥物治療的演變實驗數(shù)據(jù)，但是可以從押注對沖策略和社會學角度對其進行闡釋。

1.3.1 押注對沖策略

押注對沖策略是生物體應(yīng)對環(huán)境變化的種群水平策略。種群中一定數(shù)量的個體向不同表型轉(zhuǎn)換，每種個體都適應(yīng)1種未來可能出現(xiàn)的環(huán)境。由于存在次優(yōu)變異體，種群的平均適應(yīng)度會降低，但卻在時間上優(yōu)化了適應(yīng)性，這種策略如同經(jīng)濟學領(lǐng)域的投資策略——不要把所有的雞蛋放在1個籃子里。在幾乎所有的生命形式中都存在這種押注對沖策略。這些變異在難以預(yù)測或極端情況下對生命自身是有利的。持留菌的某些特性使其成為押注對沖策略的教科書式范例，不僅見于多種抗菌藥物暴露的情況，也見于更普遍的酸、氧化、高溫、DNA破壞劑、鹽度、金屬離子、膽汁酸、輻射或噬菌體等應(yīng)激條件[15]，使持留菌能夠保證種群免于滅絕。有研究者通過優(yōu)化控制理論將生物種群動態(tài)研究和金融風險管理數(shù)學相結(jié)合，在理論上證明了持留現(xiàn)象是一種最佳的對沖策略[16]。體外實驗中，當經(jīng)歷不太頻繁的抗菌藥物治療時，大腸埃希菌種群持留水平與連續(xù)治療之間的無藥期長度成反比；停止治療后，之前的高持留水平又緩慢下降，這與持留現(xiàn)象的數(shù)學對沖模型所預(yù)測的結(jié)果一致[17]。這些結(jié)果表明抗菌藥物治療可以促進持留菌的進化。

1.3.2 社會特性

在更廣闊的生態(tài)環(huán)境中，除了押注對沖策略外，持留性也可以被視為一種社會特性。完全相同個體的大量繁殖會加劇細菌對相同資源的競爭，而持留菌的出現(xiàn)則可以緩解這種競爭。接觸依賴性生長抑制（contact-dependent growth inhibition，CDI）可以誘導克隆細菌群體產(chǎn)生高水平的持留菌，可以認為CDI系統(tǒng)介導了一種種群密度依賴的押注對沖策略，這可能是CDI系統(tǒng)提高宿主適應(yīng)性的機制之一[18]。以這種方式來看，持留也可以被看作是一種合作的、社會性的特征，它受到親緣選擇的影響，并導致親緣選擇。然而，這一理論仍有待全面的實驗檢驗和探索。

1.4 突變的影響

需要注意的是，除了上述環(huán)境誘發(fā)因素外，所有類型的持留水平都可能因基因突變而增加或減少。當然，這種突變是與持留表型相關(guān)的突變，而不同于抗藥性突變。很多能夠增加持留或耐受性的突變已被發(fā)現(xiàn)，如最早發(fā)現(xiàn)的高持留突變——hipA7突變可以使大腸埃希菌的觸發(fā)型持留水平增加多個數(shù)量級，達到整個種群數(shù)量的約20.0%，而野生型菌株的持留水平通常低于0.1%[1]。有研究結(jié)果顯示，細胞染色體倍性是氟喹諾酮類藥物所致持留菌的重要決定因素，二倍體大腸埃希菌持留水平明顯高于單倍體大腸埃希菌[19]。另外，表觀遺傳學變異，如甲基化改變，也被發(fā)現(xiàn)與持留菌形成有關(guān)[20]，這為持留菌的研究打開了新的視角。

1.5 細胞衰老

細胞衰老也可能導致同基因種群的變異。細胞內(nèi)容物的非對稱分裂使其具有不同特性，細菌衰老概念假設(shè)細胞分裂為1個相對幼稚子代細胞和1個相對衰老子代細胞，而基本上任何細胞化合物的不對稱分布都可能產(chǎn)生表型變異。一般認為，衰老的細胞會遺傳更多受損的物質(zhì)，如氧化蛋白和受損的DNA，導致生長緩慢。衰老過程中的表觀遺傳會導致細胞更傾向于產(chǎn)生衰老的子代細胞，衰老細胞的積累將導致靜止期持留水平的增加。有實驗觀察結(jié)果支持衰老誘導持留的假設(shè)，研究者采用微流控技術(shù)發(fā)現(xiàn)在恥垢分枝桿菌中，衰老細胞的存活率反而更高[15]，清楚地表明了細胞衰老在抗菌藥物耐受中的作用。

2 清除策略和方法

2.1 直接殺滅

抗菌藥物通過破壞特定的、必需的大分子靶標的正常功能來殺死細菌。根據(jù)持留菌的特性，直接殺滅持留菌的化合物必須針對干擾去極化，或破壞細胞膜、DNA交聯(lián)，或抑制必需酶，或產(chǎn)生ROS等過程。目前尚處于研究階段的對持留菌有直接殺滅或抑制作用的藥物見表1。此外，在新型分子生物材料的幫助下也可以實現(xiàn)“老藥新用”，一種全新設(shè)計的抗結(jié)核肽和由透明質(zhì)酸組裝而成的“氣凝膠”被證明可以有效地結(jié)合和清除結(jié)核分枝桿菌持留菌[29]。

表1 部分尚在研究階段的對持留菌有直接殺滅或抑制作用的藥物

持留菌實際上是由幾個對1種或一小群特定抗菌藥物有耐藥性的細菌亞群組成的，因此不同種類抗菌藥物制劑的組合可以形成多目標攻擊，從而有效地殺滅不同的耐藥細菌亞群。在鮑曼不動桿菌感染的治療中，黏菌素和阿米卡星聯(lián)用是最有效的根除持留菌的方法[30]。黏菌素和環(huán)丙沙星聯(lián)用對根除銅綠假單胞菌持留菌具有較好的效果[31]。聯(lián)合使用對新陳代謝有強烈和微弱依賴性的2類抗菌藥物可以高效清除持留菌[32]。這種對已知藥物進行重新組合再利用的方法可以減少藥物研發(fā)成本和時間。

有趣的是，一些已知的非抗菌藥物被發(fā)現(xiàn)具有抗持留菌效果。一些抗癌藥物最近被證明具有強大的抗持留菌活性。索拉非尼衍生物SC5005在清除包括生物膜內(nèi)的金黃色葡萄球菌持留菌方面表現(xiàn)出優(yōu)越的活性[33]。DNA交聯(lián)劑絲裂霉素C能有效殺死鮑曼不動桿菌和伯氏疏螺旋體等幾種重要病原菌的持留菌[34]。雖然現(xiàn)有抗癌藥物的跨領(lǐng)域再利用有多種優(yōu)點，但其較大的副作用和較高的毒性會影響其抗持留菌的臨床應(yīng)用。此外，有研究利用深度學習的方法進行篩查，發(fā)現(xiàn)為治療糖尿病研發(fā)的海利霉素可能是一種廣譜抗菌藥物，對多種病原具有殺滅作用，并能根除大腸埃希菌持留菌[35]。

2.2 致敏或復蘇持留菌

致敏持留菌主要包括刺激抗菌藥物靶標和刺激抗菌藥物內(nèi)流泵，如L- 絲氨酸等代謝產(chǎn)物能夠增強大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的持留菌對慶大霉素的敏感性[36]。有文獻提示，毒素或能誘導持留菌復蘇，某些TA系統(tǒng)有介導解毒作用，如抗毒素MazE的表達可以中和MazF誘導的持留菌[37]。復蘇持留菌也可以通過非抗毒素途徑實現(xiàn)，這些途徑可以逆轉(zhuǎn)毒素對細胞生理的影響，而不是直接抑制毒素本身，如乙?；膖RNA被肽基tRNA水解酶Pth脫乙酰，有助于恢復持留菌的生長[38]。有單細胞觀察實驗結(jié)果表明，持留菌還可基于核糖體含量而復蘇，核糖體含量越高，持留細胞復蘇的速度就越快[39]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，可誘導持留形成的毒素HokB在特定條件下同樣可以誘導持留菌復蘇[4]，這一機制給持留菌復蘇相關(guān)研究提供了一些新提示。

2.3 減少持留菌形成

消除現(xiàn)有的持留菌可以大大提高慢性感染的治療效果，而在抗菌藥物治療之前抑制或消除其形成則有可能預(yù)防慢性感染。有學者對持留菌形成機制進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)了促進幾種干擾持留形成從而減少持留菌數(shù)量的方法，如抑制銅綠假單胞菌中的群體感應(yīng)調(diào)節(jié)子MfvR可以減少持留菌的形成[40]。一種合成的二萜類似物4-（4，7-二甲基-1，2，3，4-四氫萘-1-基）戊酸可以通過靶向（p）ppGpp合成酶抑制分枝桿菌持留菌和生物膜的形成[41]。目前，許多TA系統(tǒng)已被發(fā)現(xiàn)與持留菌相關(guān)，尋找毒素抑制劑亦不失為一種好方法?；诮Y(jié)構(gòu)學原理從HipA抑制劑中篩選出的類似物，在與氨芐西林和卡那霉素聯(lián)用后，進一步降低了大腸埃希菌的持留水平[41]。由于蛋白質(zhì)應(yīng)激是持留菌形成的原因之一，通過使用滲透劑等輔助手段來限制蛋白質(zhì)的聚集，也能降低大腸埃希菌的持留水平，并可使持留菌對一些抗菌藥物敏感[42]。

3 總結(jié)和展望

目前已知的絕大多數(shù)細菌均可產(chǎn)生持留菌，且持留菌不僅能促進抗性突變，還可以促進抗性質(zhì)粒的傳播。可以推測，臨床感染性疾病，尤其是慢性感染性疾病中廣泛存在持留菌，這是復發(fā)感染和遷延不愈的重要原因，其潛在危害不容忽視。持留菌與種群中的其他細菌在遺傳上是相同的，并且在環(huán)境壓力（如抗菌藥物）誘導下的表型只是暫時的，這更加重了持留菌研究的難度，需要更多的研究者將注意力集中于此，以促進闡明持留菌形成機制，尋找抗持留菌方法，研發(fā)相關(guān)藥物。這將有助于解決目前出現(xiàn)的抗菌藥物臨床應(yīng)用危機，給感染性疾病的治療帶來廣泛而深遠的影響。