劉唱,羅銀利,金哲虎,金升元

皮膚創(chuàng)傷愈合是維持創(chuàng)傷后皮膚完整性所必需的基本生理過程,分為止血期、炎癥期、增殖期(肉芽組織形成、血管化、創(chuàng)面閉合)和重塑期(包括瘢痕形成,可持續(xù)數(shù)周至數(shù)年)4個階段［1-2］,這些階段驅(qū)動不同的細(xì)胞類型協(xié)同活動,包括角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和浸潤性免疫細(xì)胞等［3］。無論是深達(dá)皮膚全層的創(chuàng)傷以及淺表的皮膚創(chuàng)傷,再上皮化過程中角質(zhì)形成細(xì)胞都發(fā)揮著重要作用,以確保創(chuàng)面閉合,繼續(xù)下一步愈合過程［4-5］。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一類高度保守的非編碼小分子RNA,是基因表達(dá)調(diào)控的重要分子。近年來,隨著對miRNAs在角質(zhì)形成細(xì)胞中的作用有更深的了解,miRNAs已逐漸成為傷口愈合潛在治療靶點(diǎn)。

1 miRNAs與皮膚創(chuàng)傷愈合

miRNAs是一類非編碼小RNA,人類基因中含有眾多非編碼區(qū),先前認(rèn)為非編碼區(qū)是進(jìn)化上保守的無功能DNA。然而,近年來研究表明,這些DNA轉(zhuǎn)錄后可變?yōu)橛泄δ艿姆蔷幋aRNA或初始RNA。非編碼RNA中最重要的就是miRNAs,對人類1/3左右的基因起著調(diào)控作用［6］。miRNAs在細(xì)胞的增殖、遷移、分化、發(fā)育、炎癥等過程中都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。因此,miRNAs在包括傷口愈合在內(nèi)的許多病理過程中?？捎^察到失調(diào),并被認(rèn)為是許多疾病的治療靶點(diǎn)［7-8］。早期miRNAs在皮膚領(lǐng)域中的研究主要集中于皮膚腫瘤的發(fā)生及皮膚病的治療,近年來的研究表明,其在皮膚創(chuàng)面愈合過程中也起著重要作用,miRNAs已逐漸成為皮膚領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)［9］。

研究表明,miRNAs主要參與創(chuàng)傷愈合的炎癥、增殖和重塑階段［10］。其對皮膚創(chuàng)傷愈合重要性的一個主要方面源于它們對表皮角質(zhì)形成細(xì)胞行為的調(diào)節(jié)［5］,包括miR-21、miR-31、miR-132、miR-19a/b、miR-20a、miR-184、miR-129和miR-335等,探索它們在皮膚創(chuàng)傷愈合中的作用及其調(diào)控機(jī)制,可為治療提供新的靶點(diǎn),具有潛在價值和廣闊前景。多種細(xì)胞因子和生長因子均可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移,在眾多細(xì)胞因子和生長因子中,轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)是角質(zhì)形成細(xì)胞遷移有效的誘導(dǎo)因子之一［11］。一些由TGF-β誘導(dǎo)的miRNAs,如miR-21、miR-31和miR-132等,已經(jīng)成為關(guān)鍵的miRNA,它們的變化可驅(qū)動角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移、再上皮化和其他傷口愈合因素。本文將重點(diǎn)介紹那些通過上調(diào)表達(dá)有望促進(jìn)傷口愈合的miRNA,例如通過刺激角質(zhì)形成細(xì)胞遷移和其他傷口愈合途徑的miRNA。

1.1角質(zhì)形成細(xì)胞與microRNA-21 越來越多的研究表明miR-21在多種腫瘤和心血管系統(tǒng)疾病中顯著上調(diào),在腫瘤和心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［12-13］。miR-21在器官損傷中也具有潛在價值,如腦損傷［14］、心肌缺血/再灌注損傷［15］和肝臟損傷［16］等。此外,許多研究也確定了miR-21在皮膚創(chuàng)傷和傷口愈合中的關(guān)鍵作用［17］。在小鼠創(chuàng)面中,miR-21-5p是增殖階段表達(dá)升高的miRNAs之一,敲減miR-21-5p可抑制小鼠皮膚創(chuàng)面再上皮化,而過表達(dá)miR-21可促進(jìn)肉芽組織形成和創(chuàng)面閉合。最近,一種miR-21的模擬物也被證明可以加速傷口閉合［18］。

研究表明,TGF-β可誘導(dǎo)人類永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(human immortalized keratinocytes,HaCaT)中miR-21-5p的上調(diào)［19］。敲減miR-21-5p可降低細(xì)胞依賴TGF-β的遷移,miR-21模擬物可顯著促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的遷移,miR-21-5p活性的減弱會導(dǎo)致傷口愈合延遲,miR-21的表達(dá)升高則可加速傷口愈合。Li等［20］的研究表明,miR-21是通過Smad7-Smad2/3-Elastin信號通路促進(jìn)傷口愈合進(jìn)程的。然而,Pastar等［21］的研究卻表明,局部應(yīng)用miR-21-5p模擬物抑制了體外人皮膚器官培養(yǎng)創(chuàng)傷模型的再上皮化,并抑制了大鼠傷口模型中肉芽組織的形成和再上皮化。miR-21-5p在傷口愈合中的轉(zhuǎn)化潛力仍有待進(jìn)一步研究,對于這種相反的結(jié)果,提示在解釋使用反義寡核苷酸或反義寡核苷酸的結(jié)果時需要謹(jǐn)慎。

1.2角質(zhì)形成細(xì)胞與microRNA-31 研究表明,miR-31在胰腺癌、結(jié)直腸癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào),在卵巢癌、前列腺癌中表達(dá)下調(diào)［22-23］。miR-31在人和小鼠皮膚中與再上皮化有關(guān),在創(chuàng)緣皮膚中表達(dá)升高,且主要在角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)［24-25］。TGF-β1、TGF-β2、IL-6可誘導(dǎo)原代人角質(zhì)形成細(xì)胞中miR-31-5p的表達(dá),其中IL-6依賴的miR-31-5p的升高是由轉(zhuǎn)錄因子NF-κB介導(dǎo)的,最近在小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞中也觀察到了類似結(jié)果［25-26］。在小鼠皮膚創(chuàng)傷愈合模型中,小鼠表皮miR-31的缺失會抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和傷口閉合,miR-31模擬物則可加速傷口閉合［24,27］。從機(jī)制上講,miR-31是通過調(diào)節(jié)NF-κB、RAS/MAPK、Notch信號通路和部分細(xì)胞因子,正向調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞活性的［28］。

1.3角質(zhì)形成細(xì)胞與microRNA-132 研究表明,miR-132在心肌梗死后、阿爾茨海默病中表達(dá)上調(diào),在乳腺癌、腎癌中表達(dá)下調(diào)［29-31］。在人類正常皮膚傷口愈合炎癥階段表達(dá)也上調(diào),其特點(diǎn)是能夠減輕炎癥,同時在傷口愈合過程中刺激角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和再上皮化［32-33］。在外科腹部傷口中,miR-132-3p是人體皮膚動態(tài)調(diào)節(jié)的miRNA［32］。在多種刺激中,只有TGF-β1和TFG-β2在原代角質(zhì)形成細(xì)胞中誘導(dǎo)miR-132-3p的表達(dá)。對pre-miR-132負(fù)載角質(zhì)形成細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析和基因本體論(gene ontology,GO)分析發(fā)現(xiàn)下調(diào)的免疫反應(yīng)基因高度富集,在pre-miR-132轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的基因在與細(xì)胞周期相關(guān)的過程中被富集［32］。Pre-miR-132可通過增加表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)及其下游靶基因STAT3和ERK的激活來促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。

miR-132的抗炎和增殖作用可歸因于miR-132-3p抑制肝素結(jié)合性表皮生長因子(heparin binding epidermal growth factor, HB-EGF)。結(jié)合對miR-132表達(dá)調(diào)控后HB-EGF水平的分析,均證實(shí)了miR-132對HB-EGF的調(diào)節(jié)作用［32］。此外,用siRNA沉默HB-EGF可以復(fù)制pre-miR-132對角質(zhì)形成細(xì)胞的影響,包括抑制NF-κB和增強(qiáng)EGFR信號通路。

總之,miR-132的缺失延遲了小鼠皮膚傷口愈合,miR-132-3p模擬物可加速糖尿病小鼠的傷口愈合［32-33］。與此一致,在人類體外皮膚創(chuàng)傷中,抑制miR-132可減慢再上皮化,而miR-132-3p模擬物則可加速再上皮化［32-33］。由于miR-132在糖尿病足潰瘍中的表達(dá)低于普通皮膚傷口,這些研究發(fā)現(xiàn)共同表明miR-132的上調(diào)在創(chuàng)傷愈合治療中具有巨大潛力。

1.4角質(zhì)形成細(xì)胞與microRNA-19a/b和micro RNA-20a 研究表明,miR-19a/b和miR-20a在食管癌、胃癌、乳腺癌中表達(dá)上調(diào)［34-35］。最近,Li等［36］還發(fā)現(xiàn)其在創(chuàng)傷愈合過程中可以抑制炎癥。由miR-17～92簇編碼的6個miRNAs(miR-17、miR-18a、miR-19a和miR-19b、miR-20a、miR-92)在慢性創(chuàng)傷中與受傷的普通皮膚相比較低,其中miR-19a、miR-19b和miR-20a在表皮中的表達(dá)明顯下調(diào)。尤其是在糖尿病小鼠中,角質(zhì)形成細(xì)胞特異性miR-17～92條件性基因敲除小鼠的傷口愈合被延遲,使用特異性條件性敲入(conditional knock-in,cKI)miR-17～92簇或單獨(dú)的miR-19b則可加速糖尿病小鼠的傷口愈合［36］。

從機(jī)制上講,miR-19a/b和miR-20a是通過降低Toll樣受體(TLR3)介導(dǎo)的NF-κB信號通路從而抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。因此,作為創(chuàng)面炎癥的重要調(diào)節(jié)因子,miR-19a/b和miR-20a的缺失可能會導(dǎo)致慢性創(chuàng)面的持續(xù)炎癥和愈合障礙。與此一致,miR-19b和miR-20a聯(lián)合治療可以改善2型糖尿病小鼠模型的傷口愈合［36］。Zhang等［37］的研究也表明,miR-17～92簇促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)展是通過miR-17、miR-18a、miR-19a和miR-19b的協(xié)同活性來實(shí)現(xiàn)的。

1.5角質(zhì)形成細(xì)胞與microRNA-184 研究表明,miR-184在骨肉瘤和腎癌中表達(dá)上調(diào),在子宮內(nèi)膜癌、燒傷組織中表達(dá)下調(diào)［38-41］。當(dāng)miR-31和miR-132促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移和增殖時,miR-184具有促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移和分化的能力［42-44］。細(xì)胞外Ca2+的升高是角質(zhì)形成細(xì)胞分化的主要誘導(dǎo)劑,在細(xì)胞中可誘導(dǎo)miR-184的表達(dá)［42,44］。此外,miR-184的上調(diào)與角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的減少和角質(zhì)形成細(xì)胞分化的增強(qiáng)有關(guān),這與細(xì)胞周期蛋白E:DNA的損傷和NOTCH信號通路也有關(guān)［42,44］。鑒于通過基底層以上的遷移是表皮分化所固有的,Richardson等［43-44］又研究了miR-184對角質(zhì)形成細(xì)胞遷移的影響,研究表明角質(zhì)形成細(xì)胞單層劃痕損傷可誘導(dǎo)miR-184的表達(dá)增加50倍,這提示miR-184可能在再上皮化的后期階段發(fā)揮關(guān)鍵作用。外源性的miR-184可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移增加約3倍,而miR-184抑制劑則可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移減慢約3倍。

然而,還需要進(jìn)一步的研究來確定miR-184是否可以通過其對角質(zhì)形成細(xì)胞分化和遷移的影響來促進(jìn)正常人和糖尿病傷口的愈合。鑒于終末分化是表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的最終命運(yùn),miR-184在遷移過程中激活分化途徑的能力可能是其轉(zhuǎn)化潛力的基礎(chǔ)。

1.6角質(zhì)形成細(xì)胞與microRNA-129和microRNA-335 研究表明,miR-129和miR-335在乳腺癌、胃癌中表達(dá)下調(diào),在糖尿病大鼠創(chuàng)面中表達(dá)也下調(diào)［45-47］。糖尿病創(chuàng)面是一個高度蛋白水解的環(huán)境,其基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的持續(xù)升高會導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解、炎癥調(diào)節(jié)失衡和傷口閉合受損［48］。越來越多的研究表明,MMP-9是難愈合傷口病理的主要驅(qū)動因素［49-50］,特異性蛋白1(specificity protein ,Sp1)可調(diào)節(jié)HaCaT細(xì)胞中MMP-9的表達(dá),暴露在糖化白蛋白中以重現(xiàn)糖尿病傷口中富含晚期糖基化終產(chǎn)物(AGE)的微環(huán)境可增加HaCaT和原代角質(zhì)形成細(xì)胞中Sp1和MMP-9的表達(dá)［51］。

Wang等［51］的研究表明,糖尿病患者血清中共有58個miRNAs表達(dá)下調(diào),其中miR-129-5p和miR-335-5p是Sp1的預(yù)測調(diào)控因子,熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)和蛋白免疫印跡分析均證實(shí)了這一點(diǎn)。更重要的是,miR-129-5p和miR-335-5p在糖化血清白蛋白處理的HaCaT細(xì)胞中表達(dá)也降低,這建立了miR-129-5p和miR-335-5p的缺失及其靶點(diǎn)Sp1的上調(diào)之間的聯(lián)系。同時,HaCaT細(xì)胞中Sp1和MMP-9的年齡依賴性升高可以被miR-129-5p和miR-335-5p模擬物完全逆轉(zhuǎn)。與此一致,反復(fù)給糖尿病大鼠傷口皮內(nèi)注射miR-129-5p和miR-335-5p模擬物加速了傷口愈合。從機(jī)制上講,miR-129-5p和miR-335-5p是通過抑制Sp1介導(dǎo)的MMP-9表達(dá)促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合的［51］。

2 總結(jié)與展望

通過給予特定的miRNA模擬物或抑制劑來調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)對多種疾病均有良好的效果,例如腫瘤和心血管疾病等。越來越多的研究表明,miRNAs是皮膚創(chuàng)傷愈合的重要調(diào)節(jié)因子,其可通過對表皮角質(zhì)形成細(xì)胞行為的調(diào)控促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合,這提示miRNAs是皮膚創(chuàng)傷愈合的潛在治療靶點(diǎn)。通過文獻(xiàn)總結(jié)我們還發(fā)現(xiàn)了一種組合方法,其中兩個或更多的miRNA模擬物靶向不同但互補(bǔ)的創(chuàng)傷愈合過程,可能比任何單一的miRNA模擬物更能有效的促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。重要的是,調(diào)控miRNAs可能比針對單個蛋白質(zhì)為靶點(diǎn)的傳統(tǒng)藥物更有效,因?yàn)閙iRNAs往往通過靶向網(wǎng)絡(luò)中的幾個關(guān)鍵基因來調(diào)控整個信號網(wǎng)絡(luò)。然而目前皮膚創(chuàng)傷愈合中精確的miRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍未建立,如何利用 miRNAs調(diào)節(jié)皮膚創(chuàng)傷愈合以及瘢痕修復(fù),仍是一個亟待解決的問題。因此,明確miRNAs在皮膚創(chuàng)傷愈合中的治療潛力和分子機(jī)制是非常有意義的,這將有助于開發(fā)更有效的創(chuàng)傷愈合治療方法。隨著研究者對miRNAs在創(chuàng)傷愈合作用中的深入研究,有望為創(chuàng)傷愈合的治療提供新的視野和更大的臨床價值。