魏 鑫, 王 升, 王宏光, 王興東, 楊玉春, 劉有春, 劉 成

(遼寧省果樹科學研究所,遼寧營口 115009)

藍莓學名越橘,杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)植物,因果實中富含花青素等營養(yǎng)物質(zhì)而深受消費者歡迎[1-2]。藍莓為淺根性灌木類植物,抗寒性較弱[3]。而我國北方地區(qū)冬季嚴寒、氣候干燥,種植藍莓時冬季需采取防寒保護措施才能安全越冬,這既增加了生產(chǎn)成本、工作量,同時在防寒過程中易對樹體造成損傷,導致減產(chǎn)。低溫脅迫導致的凍害是影響藍莓栽培的重要非生物脅迫之一,嚴重影響遼寧地區(qū)藍莓產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展[4]。因此,開展藍莓抗寒生理機理研究對挖掘利用抗寒資源、完善抗寒基礎理論、制定適宜的防寒技術措施等均具有重要意義。

抗寒機理研究是鑒定植物抗寒性強弱的生理基礎[5]。藍莓不同組織器官的生物學性狀和基因的差異是影響其抗寒性差異的主要原因[6-7]。藍莓的抗寒性強弱與休眠和水分狀態(tài)變化密切相關,通常休眠越深,束縛水含量越高,其抗寒性越強?？购詮姷钠贩N具有較高的果糖和葡萄糖含量,受低溫脅迫后,相對電導率的變化相對平緩,丙二醛含量積累較低[1,8-10]。王明潔等通過對越冬期露地栽培條件下枝條受傷情況以及質(zhì)膜相對透性、脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活性的綜合分析,參試藍莓抗寒性由強到弱依次為美登>齊伯瓦>北藍>藍豐>康維爾[11]。藍莓抗寒性的強弱除與品種自身特性有關外,還與環(huán)境條件、栽培技術、管理水平、植株營養(yǎng)狀況等諸多因素有關[12]。影響藍莓抗寒性的因素有很多,需要通過系統(tǒng)分析并結(jié)合田間凍害情況調(diào)查和受凍后的生長恢復情況等加以綜合判斷。因此,本試驗通過人工模擬低溫環(huán)境的方法,測定5個藍莓品種1年生枝條的質(zhì)膜透性、保護酶活性及丙二醛、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、纖維素、總含水量、自由水和束縛水含量等抗寒生理指標,以期闡釋藍莓抗寒生理機理,為研究藍莓抗寒生理學鑒定方法、挖掘利用藍莓抗寒特異資源和選育抗寒新品種提供數(shù)據(jù)基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試品種為：6年生矮叢品種美登、半高叢品種北陸、北高叢品種藍豐、南高叢品種密斯梯和兔眼品種精華。供試材料定植于遼寧省果樹科學研究所藍莓資源圃塑料大棚內(nèi),采取常規(guī)管理措施。

1.2 試驗方法

1.2.1 取樣與材料處理 于2015年1月7日選取經(jīng)抗寒鍛煉后的5個品種植株不同方向、完全木質(zhì)化直徑為0.3～0.5 cm的1年生枝。先后采用自來水和蒸餾水清洗干凈,濾紙吸干,自封袋分裝好后備用。一部分用于不同低溫處理,處理溫度為-15、-20、-25、-30、-35、-40 ℃、對照(至于冰箱中 4 ℃ 冷藏保存),冷凍時溫度下降幅度和解凍時的溫度回升幅度均為5 ℃/h,到達處理所需溫度后,維持24 h,然后解凍。測定相對電導率、保護酶活性、丙二醛和游離脯氨酸含量。一部分烘箱 120 ℃ 殺青20 min后,80 ℃烘干至恒質(zhì)量,粉碎成粉末后用于測定可溶性總糖、還原糖、淀粉、可溶性蛋白、糖組分和纖維素含量,一部分用于測定枝條總含水量、自由水含量并計算束縛水含量、自由水含量/束縛水含量,每處理3次重復,每次重復10個枝條。

1.2.2 測定指標與方法 電解質(zhì)滲透率采用電導率儀法[13]測定;丙二醛(MDA)含量采用TBA顯色法[14]測定;過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法[14]測定;過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法[14]測定;超氧化物酶(SOD)活性采用氮藍四唑光還原法[14]測定;游離脯氨酸含量采用硝基水楊酸[14]測定;可溶性糖、還原糖、淀粉、纖維素含量采用蒽酮比色法[14-15]測定;可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍比色法[14]測定;糖組分采用高效液相色譜法[16-17]測定;總含水量、自由水和束縛水含量采用烘干稱質(zhì)量法和阿貝折射儀[14]測定。

1.3 統(tǒng)計分析

用Excel 2007軟件處理試驗數(shù)據(jù),用Origin 2018軟件制圖,用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析,用Duncan’s檢驗差異顯著性和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對5個藍莓品種枝條相對電導率的影響

由圖1可知,5個品種在試驗低溫范圍內(nèi),相對電導率隨處理溫度的降低逐漸升高。5個品種相對電導率隨溫度降低變化的速率有所不同。美登、北陸和藍豐品種相對電導率隨溫度的降低變化較為平緩。密斯梯和精華2個品種在-25 ℃后相對電導率明顯提高。-40 ℃時,美登、北陸、藍豐、密斯梯、精華5個品種相對電導率較4 ℃時分別增加了1.18、1.52、1.48、3.45、1.55倍。

4 ℃條件下,5個品種枝條相對電導率最低,密斯梯相對電導率顯著高于美登、北陸、精華,與藍豐差異不顯著。密斯梯、藍豐、美登和北陸間差異不顯著;-40 ℃處理下,5個品種枝條相對電導率均最高,且5個品種由高至低依次為密斯梯、精華、藍豐、北陸、美登,品種間差異均顯著(P<0.05)。

2.2 低溫脅迫對5個藍莓品種枝條丙二醛(MDA)含量的影響

5個品種在試驗低溫范圍內(nèi),由圖2可知,MDA含量隨處理溫度的降低逐漸升高。4 ℃時,美登與-15 ℃差異未達顯著水平,但顯著低于其他溫度(P<0.05)。-40 ℃時顯著高于其他溫度(P<0.05);4 ℃時,北陸枝條MDA含量與15、-20 ℃差異不顯著,但顯著低于其他溫度(P<0.05)。-40 ℃ 時,極顯著高于4、15、-20 ℃(P<0.01);4 ℃ 時,藍豐枝條MDA含量與15、-20 ℃差異不顯著,但顯著低于其他溫度(P<0.05)。-40 ℃時,與-35 ℃差異未達顯著水平,但顯著高于其他溫度(P<0.05);4 ℃時,密斯梯枝條MDA含量與15 ℃差異不顯著,但極顯著低于其他溫度(P<0.01)。-40 ℃時,與-30、-35 ℃差異不顯著,但極顯著高于其他溫度(P<0.01);4 ℃時,精華枝條MDA含量與15、20 ℃差異不顯著,但極顯著低于其他溫度(P<0.01)。-40 ℃時,與-30、-35 ℃差異不顯著,但極顯著高于其他溫度(數(shù)據(jù)未顯示)。

密斯梯品種在-35 ℃時,枝條MDA含量顯著高于精華(P<0.05),極顯著高于其他3個品種(P<0.01)。其他各溫度處理條件下時,均極顯著高于其他4個品種(P<0.01);美登品種在4、-20、-35 ℃時,與北陸、藍豐間差異不顯著,但顯著低于密斯梯、精華(P<0.05)。-40 ℃時,與北陸間差異不顯著,但顯著低于藍豐、密斯梯、精華(P<0.05)。

2.3 低溫脅迫對5個藍莓品種枝條過氧化物酶(POD)活性的影響

由圖3可知,5個品種在試驗溫度范圍內(nèi)均成單峰變化趨勢,但出峰溫度有所不同。密斯梯和精華2個品種在-25 ℃時,POD活性達最高,極顯著高于其他溫度(P<0.01)。美登、北陸和藍豐3個品種在-30 ℃時,POD活性達到最高,美登和藍豐顯著高于其他溫度(P<0.05),北陸與-35 ℃差異未達顯著水平,但顯著高于其他溫度(P<0.05)。4 ℃ 時,美登、密斯梯枝條POD活性極顯著低于其他溫度(P<0.01),北陸、藍豐、精華3個品種枝條POD活性與-40 ℃差異不顯著,但顯著低于其他溫度(數(shù)據(jù)未顯示)。

在4 ℃和-40 ℃溫度下,美登枝條POD活性顯著高于其他4個品種(P<0.05),在其他溫度條件下,極顯著高于其他4個品種(P<0.01);4 ℃和-30 ℃條件下,北陸、藍豐均顯著高于密斯梯、精華(P<0.05),北陸和藍豐差異達顯著水平(P<0.05),密斯梯、精華差異不顯著;-40 ℃條件下,北陸、藍豐顯著高于精華(P<0.05),北陸、藍豐和密斯梯及密斯梯和精華間差異不顯著。

2.4 低溫脅迫對5個藍莓品種枝條過氧化氫酶(CAT)活性的影響

由圖4可知,5個品種在試驗溫度范圍內(nèi)均成單峰變化趨勢,但出峰溫度有所不同。密斯梯、精華2個品種在-25 ℃時,CAT活性達最高,均極顯著高于其他溫度(P<0.01);美登、北陸和藍豐3個品種在-30 ℃時,CAT活性達最高,均極顯著高于其他溫度(P<0.01);4 ℃時,藍豐、精華2個品種極顯著低于其他溫度(P<0.01)。美登品種與 -15 ℃ 差異未達顯著水平,但極顯著低于其他溫度(P<0.01)。北陸顯著低于-15 ℃(P<0.05),極顯著低于其他溫度(P<0.01)。密斯梯品種與 -15、-40 ℃ 差異未達顯著水平,極顯著低于其他溫度(數(shù)據(jù)未顯示)。

在-25 ℃條件下,美登CAT活性極顯著高于其他4個品種(P<0.01),其他品種間差異未達顯著水平;在-30 ℃條件下,美登CAT活性極顯著高于其他4個品種(P<0.01)。北陸、藍豐極顯著高于密斯梯、精華(P<0.01),精華顯著高于密斯梯(P<0.05);-40 ℃時,北陸與美登未達顯著水平,極顯著高于其他3個品種(P<0.01)。美登與藍豐差異未達顯著水平,均極顯著高于密斯梯、精華(P<0.01)。

2.5 低溫脅迫對5個藍莓品種枝條超氧化物酶(SOD)活性的影響

由圖5可知,5個品種在試驗溫度范圍內(nèi)均成單峰變化趨勢,但出峰溫度有所不同。北陸、密斯梯和精華3品種在-25 ℃時,SOD活性達最高,北陸品種與-30 ℃差異不顯著,但極顯著高于其他溫度(P<0.01)。密斯梯品種顯著高于4、-40 ℃(P<0.05),與其他溫度差異不顯著;精華品種極顯著高于其他溫度(P<0.05)。美登、藍豐2個品種在-30 ℃時,SOD活性達最高。美登品種與 -25 ℃ 差異未達顯著水平,顯著高于其他溫度(P<0.05);藍豐品種極顯著高于其他溫度。4 ℃時,各品種均表現(xiàn)為極顯著低于其他溫度(數(shù)據(jù)未顯示)。

4 ℃條件下,美登、北陸和藍豐SOD活性顯著高于密斯梯,北陸和藍豐顯著高于精華(P<0.05),美登、北陸、藍豐,美登、精華間及密斯梯、精華間差異不顯著;-25 ℃條件下,北陸顯著高于其他4個品種(P<0.05),精華與密斯梯差異未達顯著水平,但顯著低于另外3個品種(P<0.05)。美登顯著高于密斯梯(P<0.05),但與藍豐差異不顯著;-30、-35、-40 ℃ 條件下,美登、北陸和藍豐顯著高于密斯梯、精華(P<0.05),美登、北陸、藍豐間差異不顯著,精華顯著高于密斯梯(P<0.05)。

2.6 低溫脅迫對5個藍莓品種枝條滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

由圖6可知,5個品種在試驗低溫范圍內(nèi),游離脯氨酸含量隨處理溫度的降低呈逐漸上升的變化趨勢。美、北陸、藍豐、密斯梯4個品種游離脯氨酸含量隨溫度升高含量極顯著升高,精華品種除 -20 ℃ 和-25 ℃差異未達顯著水平外,其他溫度間差異均達顯著水平(數(shù)據(jù)未顯示)。

4 ℃條件下,美登游離脯氨酸含量極顯著高于其他4個品種(P<0.01),密斯梯極顯著低于其他4個品種(P<0.05);-25 ℃和-40 ℃時,美登、北陸、藍豐3個品種差異達極顯著水平(P<0.01),且均極顯著高于密斯梯、精華(P<0.01);-30 ℃時,5個品種由高到低依次為美登、北陸、藍豐、精華、密斯梯,品種間差異均達顯著水平(P<0.05)。

由表1可知,北陸可溶性總糖含量極顯著高于其他4個品種(P<0.01)。美登與藍豐差異不顯著,極顯著高于密斯梯和精華(P<0.01);藍豐顯著高于密斯梯(P<0.05),與精華差異不顯著。北陸還原糖含量極顯著高于其他4個品種,美登極顯著高于其他3個品種(P<0.01),藍豐顯著高于密斯梯(P<0.05),精華分別與藍豐和密斯梯差異均不顯著。北陸、美登、藍豐3品種的淀粉含量極顯著高于密斯梯和精華,北陸、美登、藍豐間差異達極顯著水平(P<0.01);精華顯著高于密斯梯(P<0.05)。北陸、美登、藍豐3品種的蛋白質(zhì)含量顯著高于密斯梯和精華,北陸、美登、藍豐間差異達到顯著水平(P<0.05);密斯梯與精華間差異未顯著水平。北陸果糖含量極顯著高于其他4個品種,美登極顯著高于其他3個品種(P<0.01);藍豐與精華差異不顯著,但極顯著高于密斯梯,精華(P<0.01),顯著高于密斯梯(P<0.05)。美登、北陸2個品種的葡萄糖含量差異未達顯著水平,但均極顯著高于藍豐、密斯梯和精華(P<0.01),藍豐、精華間差異未達顯著水平,均顯著高于密斯梯(P<0.05)。北陸蔗糖含量極顯著高于其他4個品種,美登極顯著高于其他3個品種(P<0.01);藍豐與精華差異不顯著,但均極顯著高于密斯梯(部分數(shù)據(jù)未顯示)。

表1 5個藍莓品種枝條滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及纖維素含量差異

2.7 5個藍莓品種枝條纖維素含量的差異

北陸纖維素含量顯著高于美登,極顯著高于其他3個品種(P<0.01);美登與藍豐差異不顯著,極顯著高于密斯梯和精華(P<0.01);藍豐顯著高于精華,與密斯梯差異不顯著;密斯梯與精華間差異不顯著(部分數(shù)據(jù)未顯示)。

2.8 5個藍莓品種枝條含水量的差異

由圖7可知,密斯梯品種枝條總含水量顯著高于藍豐,極顯著高于另3個品種(P<0.01)。藍豐、精華極顯著高于北陸和美登(P<0.01);藍豐、密斯梯、精華3個品種枝條自由水含量極顯著高于美登、北陸(P<0.01),藍豐、密斯梯和精華及美登和北陸之間差異不顯著;5個品種束縛水含量差異未達顯著水平;藍豐、密斯梯自由水含量/束縛水含量極顯著高于美登(P<0.01),顯著高于北陸(P<0.05),與精華差異不顯著。精華顯著高于美登(P<0.05),與北陸間差異未達顯著水平。

2.9 5個藍莓品種枝條低溫處理后的恢復情況

由圖8可知,5個品種在試驗低溫范圍內(nèi),萌芽率隨處理溫度的降低呈逐漸下降的變化趨勢。4 ℃條件下,美登、北陸、藍豐、密斯梯和精華枝條萌芽率分別為74.33%、75.29%、79.37%、72.30%和81.90%;-15 ℃條件下,5個品種枝條萌芽率分別下降了6.60%、1.61%、4.15%、4.54%和7.95%;密斯梯在-20 ℃條件下,枝條萌芽率為0,精華在 -30 ℃ 條件下枝條萌芽率為0,美登、北陸、藍豐在-35 ℃條件下枝條萌芽率為0。

由圖9可知,5個品種在試驗低溫范圍內(nèi),枝條褐變程度隨處理溫度的降低呈逐漸上升的變化趨勢。4 ℃條件下,美登、北陸、藍豐、密斯梯和精華枝條褐變率均為0;-15 ℃條件下,5個品種枝條萌芽率分別為0、0、0、50%和15%;密斯梯在-20 ℃條件下,枝條褐變率為100%,精華在-30 ℃條件下枝條褐變率為100%,美登、北陸、藍豐在-35 ℃條件下枝條褐變率為100%。

2.10 5個藍莓品種抗寒性的主成分分析

由表2、表3可知,對5個藍莓品種1年生枝條MDA含量、POD、SOD活性等18個抗寒生理指標進行主成分分析,依據(jù)特征值>1的原則,提取了3個主成分,累計方差貢獻率94.979%,表明前3個主成分可反映5個品種抗寒生理指標的大多數(shù)信息。其中,第1主成分的代表指標為葡萄糖含量(0.989)、蛋白質(zhì)含量(0.976)、淀粉含量(0.940)、蔗糖含量(0.937),特征值為13.515,方差貢獻率75.085%;第2主成分的代表指標為POD活性(-0.685)、游離脯氨酸含量(-0.480),特征值為1.95,貢獻率為10.836%;第3主成分的代表指標為束縛水含量(0.895)、自由水含量/束縛水含量(0.485)、MDA含量(0.485),特征值為1.630,貢獻率為9.058%。

表2 5個藍莓品種抗寒生理指標的主成分分析

表3 5個藍莓品種抗寒生理指標主成分載荷矩陣

由表4可知,3個主成分的特征值比所提取的主成分總特征值之和作為權重計算主成分分值,具體如下：

表4 5個藍莓品種主成分得分及綜合評價

主成分值1：F1=-0.214x1+0.177x2+0.214x3+0.228x4-0.245x5+0.228x6+0.265x7+0.256x8+0.249x9+0.242x10+0.250x11+0.253x12+0.269x13+0.255x14-0.254x15-0.249x16-0.098x17-0.238x18;

主成分值2：F2=0.273x1-0.490x2+0.108x3-0.344x4+0.009x5-0.369x6+0.128x7+0.239x8+0.215x9+0.319x10+0.258x11+0.221x12-0.013x13+0.132x14+0.13x15+0.095x16+0.185x17+0.063x18;

主成分值3：F3=0.38x1+0.255x2-0.003x3-0.097x4-0.296x5+0.093x6+0.095x7-0.034x8+0.031x9+0.009x10-0.115x11-0.117x12+0.06x13-0.222x14+0.002x15-0.168x16+0.701x17-0.275x18;

以所選取的第1～3主成分的特征值和主成分值構(gòu)建綜合評價模型：F=(13.515F1+1.951F2+1.630F3)/(13.515+1.951+1.630),其中,F為綜合得分值,利用主成分分析綜合得分值評價5個品種抗寒性強弱,得分值越高則抗寒性越強。因此,5個藍莓品種的抗寒性由強到弱依次為美登>北陸>藍豐>精華>密斯梯。

3 討論

溫度是影響植物生存、分布、生長發(fā)育的重要因素[18-19]。植物在低溫脅迫過程中,發(fā)生了一系列涉及生物膜性質(zhì)變化、代謝酶活性降低及活性氧、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和脅迫響應蛋白積累的生理生化和基因的變化以適應低溫環(huán)境[20]。細胞膜系統(tǒng)是植物受低溫傷害的原發(fā)部位,低溫脅迫可引起胞內(nèi)電解質(zhì)外滲,相對電導率增大,MDA含量升高,因此,細胞膜破壞程度通過作為鑒定植物抗寒性強弱的重要參考指標[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn),在試驗低溫范圍內(nèi),5個品種枝條相對電導率和MDA含量隨處理溫度的降低而升高,但變化的速率有所不同。美登、北陸和藍豐相對電導率和MDA含量升高的速率相對平緩,而密斯梯和精華明顯升高,受害程度較高。

植物在低溫脅迫條件下,可通過提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的質(zhì)量分數(shù),降低細胞液滲透勢、水分含量和冰點,從而提高抗寒性[27-28]。游離脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖是植物重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[29]。低溫脅迫下,它們的積累不但可提高細胞的保水能力,還能防止活性氧對蛋白質(zhì)和膜脂的過氧化,緩解或抵御低溫傷害的發(fā)生,其含量可作為抗寒性鑒定的生理指標[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn),美登、北陸和藍豐3個品種具有較高的游離脯氨酸、可溶性總糖、還原糖、淀粉、可溶性蛋白、果糖、葡萄糖、蔗糖和纖維素含量。美登、北陸2個品種具有較低的總含水量、自由水含量和自由水含量/總束縛水含量。當?shù)蜏啬婢硜砼R時,美登、北陸2個品種能夠快速調(diào)節(jié)自身的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量來應對逆境低溫傷害?；謴蜕L法是評價植物抗寒性的最直觀和可靠的方法,枝條遭受低溫傷害的程度,主要通過芽對低溫的敏感性反映出來,通過統(tǒng)計低溫脅迫后枝條的萌芽率和褐變程度,可以直接確定枝條抗寒性強弱[32]。-30 ℃ 條件下,美登、北陸、藍豐3個品種枝條仍達49%以上的萌芽率,同時部分枝條未受低溫傷害而褐變。

4 結(jié)論

通過人工模擬低溫環(huán)境的方法,測定、計算5個藍莓品種1年生枝條的18個與抗寒性相關的生理指標,同時結(jié)合主成分分析,結(jié)果顯示,供試5個藍莓品種的抗寒性由強到弱依次為：美登、北陸、藍豐、精華和密斯梯。美登抗寒性較強的原因是具有較高的POD、SOD、CAT活性,可溶性總糖、淀粉、纖維素和可溶性蛋白含量及較低的枝條總含水量和自由水含量。