柴胡疏肝散對(duì)功能性消化不良大鼠AMPK/SIRT3信號(hào)通路的影響

王煜姣，王香香，楊珂鳴，葉麗亞·葉爾太，凌江紅

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院消化內(nèi)科（上海 201203）

功能性消化不良（functional dyspepsia，F(xiàn)D）是臨床常見(jiàn)的功能性胃腸病，癥狀持續(xù)、反復(fù)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，我國(guó)FD 的患病率為3.1%～15.6%［1-2］。胃動(dòng)力障礙是本病的主要發(fā)病機(jī)制之一，Cajal 間質(zhì)細(xì)胞（ICCs）決定著胃腸道平滑肌收縮的節(jié)律［3-4］。柴胡疏肝散出自《景岳全書(shū)》，是疏肝理氣的經(jīng)典名方。課題組前期研究［5］發(fā)現(xiàn)，柴胡疏肝散可降低FD 模型大鼠胃組織線粒體活性氧（ROS）含量，從而減輕胃組織線粒體氧化應(yīng)激，進(jìn)而抑制ICCs線粒體自噬，促進(jìn)胃動(dòng)力。腺苷一磷酸（AMP）活化蛋白激酶（AMPK）/沉默信息調(diào)節(jié)因子3（SIRT3）是氧化應(yīng)激相關(guān)通路之一。為進(jìn)一步探討柴胡疏肝散治療FD 的作用機(jī)制，我們觀察了該方對(duì)FD 模型大鼠氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)及AMPK/SIRT3信號(hào)通路的影響，以期為FD的臨床診療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性SD 大鼠32 只，體質(zhì)量180 g 左右，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。動(dòng)物使用合格證號(hào)：20170005059985。所有大鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫22～25 ℃，相對(duì)濕度（55±10）%，光照、黑暗時(shí)間各12 h 交替。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)號(hào)：PZSHUTCM210926008）。

1.1.2 藥物與試劑 多潘立酮片，西安楊森制藥有限公司（批號(hào)：KDJ3YSP），研磨后用蒸餾水配制成濃度為0.45 g/L 的混懸液。柴胡（批號(hào)：210526）、白芍（批號(hào)：210128）、川芎（批號(hào)：210206）、枳實(shí)（批號(hào)：210630）、陳皮（批號(hào)：210711）、香附（批號(hào)：210617）、炙甘草（批號(hào)：210417），均購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院中藥房。按原方藥物配伍比例稱取藥物并加入沒(méi)過(guò)中藥2～3 cm 的蒸餾水浸泡30 min，武火煮沸后轉(zhuǎn)文火繼續(xù)煎煮15～20 min，留取藥液；復(fù)煮1次，將兩次藥液合并后按照課題組前期確定的柴胡疏肝散的最佳給藥劑量［6］，配制成生藥濃度為0.48 g/mL的水煎液。

蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、ROS 檢測(cè)試劑盒、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒、過(guò)氧化氫酶（CAT）檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）檢測(cè)試劑盒、放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）配制試劑盒，上海威奧生物有限公司（批號(hào)分別為C0105S、ER9407M、ER9405M、ER9406M、ER9404M、ER9402M、WB0101、WB0130）；SIRT3 兔多克隆抗體，美國(guó)Abcam 公司（批號(hào)：ab246522）；AMPK 抗體、微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）抗體、錳超氧化物歧化酶（MnSOD）抗體、泛素結(jié)合蛋白P62 抗體，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司（批號(hào)分別為18167-1-ap、18725-1-ap、24127-1-ap、18420-1-ap）；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗兔二抗、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體，上海威奧生物有限公司（批號(hào)分別為WB0177、WB0196）；氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（批號(hào)分別為20181221、T20090115、20210512）；總RNA 提取試劑盒，日本TaKaRa株式會(huì)社（批號(hào)：AI91731A）。

1.1.3 主要儀器 組織勻漿器，北京鼎昊源公司（型號(hào)：TL-2010S）；離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司（型號(hào)：Fresco21）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司（型號(hào)：MutiskanTMGO）；伯樂(lè)電泳儀，美國(guó)Bio-Rad 公司（型號(hào)：BIO RAD POWER PAC 3000）；熒光定量PCR 儀，瑞士Roche 公司（型號(hào)：Roche480Ⅱ）；透射電子顯微鏡，捷克FEI 有限公司（型號(hào)：Tecnai G2 spirt）；倒置顯微鏡，德國(guó)Leica 公司（型號(hào)：DMI3000B）；超薄切片機(jī)，德國(guó)Leica 公司（型號(hào)：705902）。

1.2 分組與造模 32 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，隨機(jī)分為正常組、模型組、柴胡疏肝散組、多潘立酮組，每組8只。除正常組以外，其余各組大鼠均采用改良夾尾刺激法［7］造模。用紗布包裹長(zhǎng)持物鉗的前端，鉗夾大鼠尾巴后1/3 處，大鼠掙扎或尖叫時(shí)再予松開(kāi)；每次30 min，2 次/d，持續(xù)4 周。造模4 周后，大鼠胃排空率明顯降低，且胃竇組織未發(fā)生糜爛、潰瘍等器質(zhì)性病理改變，則為造模成功［8］。

1.3 干預(yù)方法 正常組、模型組予質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液灌胃，柴胡疏肝散組和多潘立酮組分別予柴胡疏肝散水煎液（0.48 g/mL）及多潘立酮混懸液（0.45 g/L）灌胃［9］。上述均為10 mL/kg，2次/d（夾尾刺激完成后操作），連續(xù)干預(yù)4周。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.4.1 胃排空率 末次給藥后，參照文獻(xiàn)［10］中的方法配制300 mL（約300 g）營(yíng)養(yǎng)性半固體糊，按3 mL/只的劑量灌胃。30 min 后用2 %戊巴比妥鈉（2.25 mL/kg）麻醉大鼠，暴露全胃后將大鼠賁門(mén)及幽門(mén)部結(jié)扎，取胃組織，稱取全胃質(zhì)量。沿胃大彎將胃組織剪開(kāi)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液沖洗胃內(nèi)容物，濾紙拭干，稱取空胃質(zhì)量。胃排空率（%）=［1-（全胃質(zhì)量-空胃質(zhì)量）/半固體糊質(zhì)量］×100%。

1.4.2 胃組織病理 取適量胃竇組織，切片脫蠟后予蘇木精染色2 min，伊紅染色90 s，60 ℃烘箱處理30 min，光學(xué)顯微鏡下觀察胃組織病理變化。

1.4.3 ICCs 線粒體超微結(jié)構(gòu) 取適量胃竇組織，2.5%戊二醛固定2 h，1%鋨酸固定液固定2 h，乙醇梯度脫水，環(huán)氧丙烷置換，純環(huán)氧樹(shù)脂（Epon）812包埋，半薄切片定位到肌層ICCs，切片后予枸櫞酸鉛電子染色，透射電子顯微鏡觀察ICCs線粒體超微結(jié)構(gòu)。

1.4.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)水平 抽取大鼠腹主動(dòng)脈血5 mL，3 000 r/mim離心10 min，提取血清后凍存于-80 ℃冰箱。取適量血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)依次加入待測(cè)樣本，檢測(cè)各組大鼠血清ROS、MDA、SOD、CAT、GSH-Px水平。

1.4.5 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）法檢測(cè)大鼠胃組織AMPK、SIRT3、MnSODmRNA 表達(dá)水平 取適量大鼠胃組織，用TRIzol 法提取胃組織總RNA，測(cè)定濃度及純度后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，體系為20 μL、42 ℃、60 min。以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增以檢測(cè)各組大鼠胃組織中AMPK、SIRT3、MnSODmRNA 的表達(dá)水平。反應(yīng)條件：95 ℃、2 min，95 ℃、5 s，60 ℃、10 s；45個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.4.6 Western blot 法檢測(cè)大鼠胃組織p-AMPK、AMPK、SIRT3、MnSOD、LC3、P62 蛋白表達(dá)水平 取適量胃組織打碎離心，加入RIPA 細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min 后離心收集上清，提取細(xì)胞蛋白。二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)定細(xì)胞總蛋白濃度。各孔取10 mg 的蛋白上樣，于10%SDS-PAGE電泳進(jìn)行蛋白分離（濃縮膠5%，電壓80 V，30 min；分離膠10%，電壓120 V，60 min）。將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移（300 mA 電流，60 min）至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。加入5%脫脂牛奶封閉液于搖床上室溫封閉1 h。用等滲緩沖鹽溶液（TBST）洗膜3 次，每次10 min，分別加入p-AMPK、AMPK、SIRT3、MnSOD、LC3、P62 抗體（體積稀釋比例均為1∶1 000），β-actin（1∶5 000），4 ℃反應(yīng)過(guò)夜。次日先以TBST洗膜3次，每次10 min。加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶2 000），室溫反應(yīng)1 h。再用TBST 洗膜3 次，每次10 min。按化學(xué)發(fā)光底物（ECL）試劑盒說(shuō)明進(jìn)行顯影。采用ImageJ圖像分析管理系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 27.0 軟件進(jìn)行處理與分析。計(jì)量資料以表示，組間比較用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)大鼠胃排空率的影響 與正常組比較，模型組大鼠胃排空率降低（P＜0.05）；與模型組比較，柴胡疏肝散組、多潘立酮組大鼠胃排空率升高（P＜0.05）；與多潘立酮組比較，柴胡疏肝散組大鼠胃排空率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠胃排空率比較（n=8，±s，%）

表2 各組大鼠胃排空率比較（n=8，±s，%）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別正常組模型組多潘立酮組柴胡疏肝散組胃排空率62.50±8.31 43.33±7.56*55.42±6.41#56.25±6.53#

2.2 對(duì)大鼠胃組織病理的影響 各組大鼠胃竇組織黏膜紅潤(rùn)，結(jié)構(gòu)清晰，上皮柱狀細(xì)胞排列整齊，腺體完整；模型組、柴胡疏肝散組、多潘立酮組大鼠黏膜見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞，未見(jiàn)糜爛、潰瘍等病理改變。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠胃組織病理形態(tài)（蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡，×100）

2.3 對(duì)大鼠胃組織ICCs 線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響 正常組大鼠ICCs結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，胞質(zhì)內(nèi)有較多線粒體，線粒體呈橢圓形；模型組大鼠ICCs內(nèi)線粒體腫脹、形態(tài)欠規(guī)則，分支較多，呈空泡化改變，見(jiàn)自噬小體；柴胡疏肝散組、多潘立酮組大鼠ICCs內(nèi)線粒體核膜基本完整，結(jié)構(gòu)尚清楚。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠胃組織Cajal間質(zhì)細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)（枸櫞酸鉛電子染色，透射電鏡，×6 000）

2.4 對(duì)大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清ROS、MDA 水平升高（P＜0.05），SOD、CAT、GSH-Px 水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，柴胡疏肝散組、多潘立酮組大鼠血清ROS、MDA水平降低（P＜0.05），SOD、CAT、GSH-Px 水平升高（P＜0.05）；與多潘立酮組比較，柴胡疏肝散組大鼠血清ROS、MDA、SOD、CAT、GSH-Px 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清ROS、MDA、SOD、CAT、GSH-Px水平比較（n=8，±s）

表3 各組大鼠血清ROS、MDA、SOD、CAT、GSH-Px水平比較（n=8，±s）

注：ROS為活性氧，MDA為丙二醛，SOD為超氧化物歧化酶，CAT為過(guò)氧化氫酶，GSH-Px為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶。與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

GSH-Px/（μg·L-1）3.47±0.86 1.42±0.37*3.19±0.44#3.08±0.93#組別正常組模型組多潘立酮組柴胡疏肝散組ROS/（mol·L-1）2.37±1.14 5.60±1.48*2.61±1.01#2.72±1.27#MDA/（μmol·L-1）2.64±1.29 6.06±1.53*3.01±0.94#3.24±1.12#SOD/（U·L-1）8 539.98±2 152.26 4 098.30±1 161.57*7 618.62±1 020.55#7 507.79±1 005.43#CAT/（μg·L-1）6.95±0.72 3.26±1.43*6.51±1.33#6.18±1.29#

2.5 對(duì)大鼠胃組織AMPK、SIRT3、MnSODmRNA 水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠胃組織AMPK、SIRT3、MnSODmRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，柴胡疏肝散組、多潘立酮組大鼠胃組織AMPK、SIRT3、MnSODmRNA 表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與多潘立酮組比較，柴胡疏肝散組大鼠胃組織AMPK、SIRT3、MnSODmRNA 表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠胃組織AMPK、SIRT3、MnSOD mRNA表達(dá)情況

2.6 對(duì)大鼠胃組織p-AMPK、AMPK、SIRT3、MnSOD、LC3、P62 蛋白水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠胃組織LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），SIRT3、MnSOD、P62 蛋白表達(dá)水平及p-AMPK/AMPK 值降低（P＜0.05）；與模型組比較，柴胡疏肝散組、多潘立酮組大鼠胃組織LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），SIRT3、MnSOD、P62 蛋白表達(dá)水平及p-AMPK/AMPK 值升高（P＜0.05）；與多潘立酮組比較，柴胡疏肝散組大鼠胃組織LC3Ⅱ、SIRT3、MnSOD、P62 蛋白表達(dá)水平及p-AMPK/AMPK 值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖4、圖5。

圖4 各組大鼠胃組織p-AMPK、AMPK、SIRT3、MnSOD、LC3、P62蛋白電泳圖

圖5 各組大鼠胃組織SIRT3、MnSOD蛋白水平及p-AMPK/AMPK值比較

3 討論

根據(jù)臨床表現(xiàn)，F(xiàn)D 可歸屬于中醫(yī)學(xué)“痞滿”“胃脘痛”“納呆”“呃逆”等范疇?！堆C論·臟腑病機(jī)論》載：“木之性主乎疏泄。食氣入胃，全賴肝木之氣以疏泄之，則水谷乃化?！备斡舨皇?，橫逆克脾犯胃，中焦氣機(jī)逆亂，則致FD，當(dāng)以疏肝理氣為治。柴胡疏肝散是臨床治療FD 的經(jīng)典方劑，能有效改善FD 患者消化不良癥狀及焦慮、抑郁情緒，療效確切［11-12］。

氧化應(yīng)激是FD 發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其與ICCs形態(tài)及功能密切相關(guān)，ICCs 又參與調(diào)節(jié)胃腸道平滑肌收縮節(jié)律［13-14］。線粒體是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS 的主要場(chǎng)所和氧化應(yīng)激損傷的靶細(xì)胞器。氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，線粒體內(nèi)ROS、MDA 水平急劇升高，膜通透性增加，三磷酸腺苷（ATP）和鈣離子減少，導(dǎo)致線粒體功能異常，機(jī)體氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡［15-18］。

AMPK/SIRT3 通路與線粒體氧化應(yīng)激關(guān)系密切，AMPK 是AMP 活化的蛋白激酶，可調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白磷酸化，進(jìn)而在自噬不同階段中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［19-20］。SIRT3 是主要的線粒體去乙酰化酶，參與氧化應(yīng)激、線粒體代謝、細(xì)胞死亡等多種生理過(guò)程［21］。發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，SIRT3可通過(guò)對(duì)線粒體及氨基酸代謝中相關(guān)蛋白去乙?；揎?、增強(qiáng)氧化呼吸電子傳遞鏈上相關(guān)酶的活性等途徑，增加線粒體功能穩(wěn)定性，還可以提高M(jìn)nSOD、CAT 等抗氧化酶的活性，進(jìn)而增加ROS 清除率［22-24］。MnSOD 是線粒體的主要抗氧劑，可直接降低細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，AMPK 可通過(guò)激活SIRT3 增加MnSOD 表達(dá)量，進(jìn)而提高機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力［25-26］。此外，CAT、GSH-Px 可以清除氧化應(yīng)激產(chǎn)生的過(guò)氧化氫，進(jìn)而阻止高毒性羥基自由基的產(chǎn)生，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化的毒性［27-28］。LC3 是自噬體膜的標(biāo)記蛋白，形成LC3Ⅱ后參與自噬體膜的延伸［29］。P62 是自噬特異性的底物，發(fā)生自噬時(shí)可被降解［30］。因此，LC3Ⅱ、P62 可作為自噬的觀察指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠胃排空率降低（P＜0.05），且胃竇組織沒(méi)有出現(xiàn)糜爛潰瘍等病理改變，提示FD 模型復(fù)制成功；透射電鏡觀察結(jié)果顯示，模型組ICCs線粒體腫脹明顯，同時(shí)有自噬小體形成，提示FD 大鼠胃組織發(fā)生ICCs 自噬。與正常組比較，模型組大鼠血清ROS、MDA 水平升高（P＜0.05），SOD、CAT、GSH-Px 水平降低（P＜0.05），柴胡疏肝散組、多潘立酮組大鼠血清上述氧化應(yīng)激指標(biāo)較模型組明顯改善（P＜0.05）。與正常組比較，模型組大鼠胃組織AMPK、SIRT3、MnSODmRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05），LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），SIRT3、MnSOD、P62蛋白表達(dá)水平及p-AMPK/AMPK 值降低（P＜0.05）；與模型組比較，柴胡疏肝散組、多潘立酮組大鼠胃組織上述指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

綜上，柴胡疏肝散可有效促進(jìn)功能性消化不良大鼠胃動(dòng)力，其作用機(jī)制可能與激活A(yù)MPK/SIRT3通路、減輕線粒體氧化應(yīng)激、抑制ICCs自噬有關(guān)。