張馨方 胡原彰 陳薇薇

(安順學院農(nóng)學院，貴州 安順 561000)

1 引言

1.1 雪膽概況

雪膽是西南民間的常用藥，基源為葫蘆科(Cucurbitaceae)翅子瓜族(Subtrib.ZanoninaePax)雪膽屬(Hemsleya)多種植物的塊莖[1]。多年生攀援草本。莖和小枝纖細，疏被短柔毛。趾狀復葉由5-9小葉組成，多數(shù)為7小葉，復葉柄長7-8厘米?；ù菩郛愔?。雄花：疏散聚傘總狀花序或圓錐花序。種子黑褐色，近圓形，長1-1.2厘米，寬1厘米?；ㄆ?-9月，果期9-11月。根據(jù)形態(tài)特征可分為四個組：雪膽組(Sect.Hemsleya)、曲蓮組(Sect.Amabiles)、馬銅鈴組(Sect.Graciliflorae)和肉花雪膽組(Sect.Carnosiflorae)。

根據(jù)《中國植物志》的記錄，這個屬共有31種植物，主要分布在亞洲亞熱帶到溫帶地區(qū)。該屬植物的主要分布區(qū)域是云南貴州高原到四川中部盆地邊緣的山地區(qū)域，在中國的西南地區(qū)廣泛分布，包括云南省、貴州省和四川省，三省擁有全屬植物的92%，其中在貴州省分布約6種。經(jīng)過人們對雪膽屬植物化學成分的深入研究，發(fā)現(xiàn)由于生長條件、產(chǎn)地和物種等諸多因素的影響，導致不同的雪膽屬植物所含有效成分的含量存在一定的差異。到現(xiàn)在為止，已經(jīng)用化學研究的方法，對100多種化合物進行了分離識別，其中大部分是三萜類化合物[2]。雪膽屬植物的有效成分包括兩類三萜皂苷-葫蘆素和齊墩果烷，這些成分賦予了雪膽在抗炎、抗癌等方面的活性作用[3]。雪膽具有抗菌消炎、清熱解毒等功效，在臨床上治療冠心病、腸炎、氣管炎等多種疾病時也用到了此藥材，并對保肝、抗癌也發(fā)揮極大的作用[4-5]。

1.2 雪膽研究現(xiàn)狀

報道稱，中藥雪膽在我國的西南省、區(qū)被廣泛地用于生藥入藥。含多種藥物的有效成分，這些成分包含了雪膽甲素、雪膽乙素和竹節(jié)參皂甙Ⅳa 等。近幾年，對雪膽的活性成分進行了研究。中藥性組分的藥理學效應研究發(fā)現(xiàn)，雪膽乙素對其有顯著的抑制作用，在降低與炎性有關(guān)的細胞因子的情況下，激活和增殖小鼠的淋巴細胞基因的表達，調(diào)節(jié)獲得性免疫，起到抗炎作用[6]。雪膽甲素可有效抑制非小細胞肺癌細胞系NCI-H460和A549的生長，因此可以用作抗非小細胞肺癌的化合物，有望成為相關(guān)研究的重要組成部分[7]。在臨床上，將雪膽甲素與雪膽乙素進行組合，就可以制成雪膽素片，這種藥物對由甲苯造成的小鼠耳腫脹和大鼠足趾角叉菜膠能在某種程度上阻止紅細胞的膨脹，并能有效地緩解因氨所致的咳嗽[8]。

在四川和云南分別以“金龜蓮”和“羅鍋底”入藥，貴州地區(qū)常稱雪膽屬藥用植物為“蛇蓮”“苦金盆”，貴州為雪膽商品藥材的重要產(chǎn)地，除作為民間用藥外，在世界知名制藥公司“神奇藥業(yè)”以雪膽為主要原材料，成功研制“雪膽素片”。

1.3 研究目的及意義

雪膽作為民間常用藥，目前國內(nèi)市場對雪膽的需求量達到3000噸左右。據(jù)相關(guān)資料顯示，近年來對雪膽的需求量逐年增加，加之生長周期長，其野生資源也不斷枯竭，加強對雪膽植物的有效利用更為重要。目前雪膽藥材質(zhì)量控制標準尚不明確，不同的地方標準中入藥所用的雪膽基源種不同，致其基源混亂，難以鑒別。甚至有防己科千斤藤屬 (StephaniaLour.)多種植物的塊莖混為雪膽出售現(xiàn)象。本項目通過收集貴州省內(nèi)雪膽主產(chǎn)地的雪膽塊莖樣品，對其有效成分的含量進行檢測，進而分析其化學質(zhì)量特征，以期為藥用品質(zhì)優(yōu)良的種質(zhì)資源遴選提供依據(jù)。

2 材料和方法

2.1 材料與儀器

2.1.1 材料與指標

收集分布于貴州雪膽藥材主要產(chǎn)區(qū)的4種雪膽屬藥用植物，具體信息見表2-1。清洗所取得的雪膽塊莖，對其進行稱量、切片，將其烘干，烘干后的樣品放入粉碎機中打粉成粉末狀，過40目篩后裝于密封袋內(nèi)，用于雪膽甲素、雪膽乙素、竹節(jié)參皂甙Ⅳa、總皂甙、總多糖、含水量及醇溶性浸出物的含量檢測。

表2-1 雪膽藥材信息表

2.1.2 主要儀器

HPLC(Agilent 1260 型)，配置InertSustain C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱、自動進樣器、DAD 檢測器、柱溫箱、四元泵、超聲波清洗機、純水儀、紫外分光光度儀、電子天平、索氏提取器、離心機、粉碎機、烘箱、移液槍、移液槍槍頭、離心管、試管、試管架、玻璃棒、燒杯、燒瓶、分液漏斗、電爐等。

2.1.3 試劑與試藥

雪膽乙素、竹節(jié)參皂甙Ⅳa 和雪膽甲素標準品(HPLC≥98%)，齊墩果酸標照品，均購買于成都曼思特公司；D-葡萄糖苷標準品(KYFH-P6SJ，中國食品與藥物檢驗研究所)；無水乙醇，苯酚，冰乙酸，高氯酸，石油醚，濃硫酸，甲醇，正丁醇，香草醛等。

2.2 試驗方法

使用熱浸法對乙醇溶解浸出物進行測定；通過 HPLC方法對雪膽甲素、雪膽乙素和竹節(jié)參皂甙 IVa進行測定；采用紫外光分光光度分析方法，對總皂甙、多糖進行測定。最后采用SPSS Statistics 26.0軟件對主要活性成分進行相關(guān)性分析、主成分分析和系統(tǒng)聚類分析。

3 分析與結(jié)果

3.1 雪膽甲素、雪膽乙素、竹節(jié)參皂甙Ⅳa的測定

3.1.1 活性成分的提取

使用精密稱量器稱取1.0 g樣品粉末并放置于圓底燒瓶中，隨后精密加入25.00mL無水乙醇并再次稱重。待溶液降溫到常溫后，用無水乙醇補償損失并振動均勻。使上層清液通過孔徑為0.22um的過濾薄膜過濾，以備后用。每個試樣重復檢測三次。采用 InertSustainC18柱頭對三種組分進行了同步分析，分別考察了峰形、分離度、分析時間及體系的穩(wěn)定性。在25℃、30℃、35℃的柱子溫度下，采用漸變的淋濾。淋洗程序為0.1%磷酸水溶液-甲醇和0.1%磷酸水溶液-乙腈[9]。

3.1.2 標準曲線的制作

要確認在混合對比品溶液中，雪膽甲素、雪膽乙素和竹節(jié)參皂甙IV a的質(zhì)量濃度，就必須精確地稱量這三種對照品，并根據(jù)需要，將其配制成具有0.075 mg/mL、0.810 mg/mL、0.620 mg/mL的混合溶液。為了進一步檢驗混合對照品溶液中的成分，需要精確吸取0.5uL、1uL、5uL、10uL、20uL、30uL、50uL、70uL、100uL的混合溶液，并測定進樣量x(g)與峰面積y之間的關(guān)系。通過制備出三種成分的標準曲線，并進行回歸分析，可以找出它們之間的線性關(guān)系。

表3-1 活性成分進樣量及峰面積

表3-2 竹節(jié)參皂甙Ⅳa和雪膽素的線性方程及線性范圍

3.1.3 HPLC色譜圖

圖3-4 對照品的HPLC色譜圖

圖3-5 母豬雪膽HPLC色譜

圖3-6 文山雪膽HPLC色譜

圖3-7 羅鍋底HPLC色譜

圖3-8 肉花雪膽HPLC色譜

3.1.4 樣品溶液的測定

雪膽屬4種植物的3種主要化學成分含量檢測結(jié)果見表3-3。由圖3-9可見，3種活性成分的平均含量由高到低依次為雪膽甲素>竹節(jié)參皂甙Ⅳa>雪膽乙素，且竹節(jié)參皂甙Ⅳa與雪膽乙素含量差別極小。

圖3-9 雪膽屬植物的3種主成分比較

表3-3 雪膽屬4種植物主要化學成分的含量

從圖3-9可直觀地看到，在4種雪膽屬植物中，雪膽甲素的含量變化幅度較大，其次是竹節(jié)參皂甙IVa。雪膽甲素的含量，以肉花雪膽最高，其次依次為母豬雪膽、羅鍋底，文山雪膽最低。但竹節(jié)參皂甙IVa的含量以文山雪膽最高，其次依次為母豬雪膽、羅鍋底，肉花雪膽最低。

3.2 含水量和醇溶性浸出物含量測定

水分和醇溶性浸出物的含量測定分別參照《中國藥典》中的水分測定法下的烘干法和《中國藥典》中的醇溶性浸出物測定法項下的熱浸法進行測定[10]。

試驗以熱浸出方式進行。首先，將2g試樣與100mL70%酒精混合，置于黑暗中放置1h，再用回流萃取1h。等待冷卻后，將所得到的溶液準確地計量出來，然后用酒精補充所失去的量。之后，取25 mL的提取液，在水浴中蒸發(fā)，并在105℃下進行3h的干燥，在冷卻后，迅速地將其進行稱量，最終得到了乙醇可溶提取液的質(zhì)量分數(shù)，計算出醇溶性浸出物的含量。

在中藥貯藏過程中，水分是確保中藥品質(zhì)的一個關(guān)鍵因素，同時也是庫藏中草藥品質(zhì)改變的重要原因。醇溶性浸出物的測定主要是控制質(zhì)量，是為了體現(xiàn)藥材本身藥用價值的基本數(shù)據(jù)。由表3-4可知，S3-2樣品的含水量最高，為53.14mg/g；S4-2的含水量最低，為20.45mg/g。S4-2的醇溶性浸出物含量最高，為86.31mg/g；S3-1的醇溶性浸出物的含量最低，為55.69mg/g。

3.3 總皂甙含量的測定

3.3.1 供試液的制備

每個樣品各稱取粉末1.0g，加入70%乙醇100mL，提取2h，共提取4次。將濾液合并后揮干溶劑，用蒸餾水定容到100mL，先用20mL石油醚脫脂，脫脂完成后再用適量正丁醇萃取，待其揮干萃取液后制得供試液。

3.3.2 對照品溶液的制備

將10.5mg的齊墩果酸對照品放入燒杯中，先用適量甲醇進行溶解，溶解后再加入足量甲醇，使總體積為10mL，制成對照品溶液，于4℃冰箱保存。

3.3.3 標準曲線的制備

取6根10 mL試管并編號，在試管中分別加入比較品溶液0.0 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL。將試管置于水浴罐內(nèi)，使其散發(fā)出甲醇。在蒸干后，加入新調(diào)配好的5%的香草醛-冰醋酸0.2mL，高氯酸0.8mL。之后，將其置于60℃的熱水盆中加熱13min，然后置于冰水盆中5min。然后再添加5 mL的冰乙酸，進行搖勻，并于540 nm測量其吸收值[11]。以齊墩果酸對照品濃度為橫座標X，以吸收度為縱座標X，制作出了一條標準曲線，得出了如下的回歸公式：Y=7.925 X-0.046(R2=0.990)，顯示出在0.0403-0.1211 mg/ml之間具有較好的線性關(guān)系。

3.3.4 樣品溶液的測定

取樣品溶液0.4ml，按照標準曲線的制備方法測定樣品，總皂甙含量的計算對照標準曲線方程進行。結(jié)果見表3-5。

表3-5 總皂甙含量

用紫外分光光度法測定方法對雪膽屬藥用植物總皂苷的含量進行測定，由表3-5可知，本次所取的雪膽樣品總皂甙含量在3.99575-1.483525mg/g范圍內(nèi)，其中S4-1含量最高，為3.99575mg/g，S2-1含量最低，為1.483525mg/g。

3.4 總多糖含量測定

3.4.1 供試液的制備

每個樣品各稱取粉末1.0g，加入100mL蒸餾水，提取2.5h，共提取4次，過濾并合并濾液。取5.0mL上述過濾液于50mL離心管中，再加入20 mL無水乙醇混合均勻，然后在3000 r.min-1離心5 min后。即得供試液。

3.4.2 對照品溶液的制備

將無水葡萄糖稱取3.00mg，放入一個容量為25mL的容量瓶中。再添加適當?shù)恼麴s水使之溶于水中，充分溶于水后，用蒸餾水將其定容至刻度并進行搖動，從而獲得標準物質(zhì)的濃度為0.12mg/mL。

3.4.3 標準曲線的制作

分別吸取0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的對照品溶液，補充足夠的蒸餾水到1.0mL，然后添加5%的石碳酸溶液0.5mL，濃硫酸溶液5.0mL，經(jīng)過5min的沸騰水浴，7min的冰水浴，待其冷卻后再添加蒸餾水，將它定容至刻度；然后搖一搖，使其混合冷卻后，在490 nm處測量吸收值[12-13]。用X軸為多糖組分，Y軸為吸收率，分別畫出了各單糖組分的變化規(guī)律。

標準曲線為 Y=64.106 X+0.047 (R2=0.9997)，說明在0.00172 mg/ml—0.0214 mg/ml的范圍內(nèi)，葡萄糖具有較好的線性。

3.4.4 樣品溶液的測定

用0.4mL的樣本液，添加0.6 mL蒸餾水之后，根據(jù)標準曲線的制備方法展開測定，然后與標準曲線相結(jié)合，可以計算出樣品的總多糖含量。

使用紫外分光光度法和索氏提取法對雪膽屬藥用植物總多糖含量進行了測定。由表3-6所知，本次所取的雪膽樣品總多糖含量在27.61258-38.446494mg/g范圍內(nèi)，4種雪膽的總多糖含量平均值分別為34.68560867mg/g、35.3053mg/g、30.19818867mg/g、31.37346533 mg/g。其中S1-3的總多糖含量最高，為38.446494mg/g，S3-1的總多糖含量最低，為27.61258mg/g。

表3-6 不同地區(qū)雪膽總多糖含量

3.5 結(jié)果分析

采用SPSS Statistics 26.0軟件對樣品的主要活性成分進行相關(guān)性分析、主成分分析和系統(tǒng)聚類分析[14]。

3.5.1 相關(guān)性分析

對貴州省雪膽屬植物所測的3種主要化學成分進行相關(guān)性分析，結(jié)果如表4-1所示。3對化學成分組合中雪膽乙素與雪膽甲素這1對成分呈現(xiàn)極顯著相關(guān)(P<0.01)，且為正相關(guān)。

表4-1 各成分相關(guān)性

3.5.2 主成分分析

通過對雪膽7項質(zhì)量指數(shù)的主成分分析，得出了7項質(zhì)量指數(shù)。以各主成分的特征值和貢獻率為基礎，進行了主成分分析。本次試驗提取出了兩個主成分，累計方差貢獻率為83.253%，說明所抽取的兩個主要成分對雪膽的品質(zhì)指數(shù)有較好的說明作用。在這些因素之中，第一主成分的特征值是4.262，方差貢獻率達到了60.886%，是最為顯著的主要成分。第二個主成分的特征值是1.566，對方差的貢獻率是22.367%。雖然其重要性次于第一主成分，但仍然是一個非常重要的主成分，可以作為雪膽藥材選優(yōu)、評價的綜合指標。主成分1主要是綜合了雪膽屬植物的雪膽甲素、雪膽乙素和總皂苷含量，貢獻率分別是97%、95.6%和78.1%；主成分2主要是綜合了醇溶性浸出物、總多糖和竹節(jié)參皂甙Ⅳa含量，貢獻率分別是75%、72.5%和20%。

2個主成分的得分函數(shù)可以由矩陣系數(shù)和標準化后的數(shù)據(jù)得到。分別為：

Y1=0.224X1+0.228X2-0.145X3-0.124X4+0.183X5-0.209X6+0.137X7，

Y2=-0.019X1+0.110X2+0.128X3+0.463X4-0.330X5-0.238X6+0.479X7。

利用2個主要成分，以各主分相應的特征分量與各主分特征分量總和的比率為加權(quán)，求出了一個綜合主成分模型：

F綜合 = 0.60886Y1 + 0.22367Y2。

綜合主成分的分值越高，則綜合性狀表現(xiàn)越好。所以，可以依據(jù)這個綜合主成分模型來評估各個樣本的綜合性狀表現(xiàn)。如表4-2所示，4種雪膽的綜合得分和排序的藥材質(zhì)量品質(zhì)排序為肉花雪膽>母豬雪膽>羅鍋底>文山雪膽。

表4-2 雪膽質(zhì)量綜合評價

3.5.3 基于化學成分的聚類分析

基于各類成分含量進行系統(tǒng)聚類分析，選擇組間連接，平方歐式距離為距的測量公式，繪制聚類樹狀圖，如圖4所示，當距離為2時，可將雪膽屬4種植物聚為2類。其中，肉花雪膽獨為第I類，該種的雪膽甲素、雪膽乙素、總皂甙和醇溶性浸出物含量較高，竹節(jié)參皂甙Ⅳa和含水量較低。母豬雪膽與文山雪膽先聚為一小類后，與羅鍋底聚在一起，其中羅鍋底的雪膽乙素和含水量較高，竹節(jié)參皂甙Ⅳa含量較低。

圖4 雪膽屬植物聚類分析

圖5 不同雪膽屬的活性成分含量

4 結(jié)果與討論

4.1 試驗結(jié)果

從化學成分的含量測定結(jié)果來看，雪膽屬植物的雪膽甲素含量，除文山雪膽外，均高于其他成分，可作為含量測定的有效成分。從主成分分析的綜合評價來看，肉花雪膽的綜合質(zhì)量評價值最高，可作為雪膽藥材基源植物。此外，如果以雪膽甲素和雪膽乙素作為指標評價雪膽藥材質(zhì)量的標準，母豬雪膽和羅鍋底均可作為候選藥源。4種雪膽屬植物的竹節(jié)參皂甙Ⅳa含量與雪膽素含量呈現(xiàn)較大差異，其中文山雪膽的雪膽素含量雖然最低，但竹節(jié)參皂甙Ⅳa含量卻是最高的。因此，盡管其雪膽素含量低，但可作竹節(jié)參皂甙Ⅳa的藥源植物。

4.2 討論

雪膽是我國一種重要的藥用植物資源，市場需求量也較大。當前，在很大程度上依賴于從野生植物中獲得。但近年來，已經(jīng)有一些人工栽培的雪膽，在市面上出售。經(jīng)調(diào)查，市場上出現(xiàn)的大多是藥農(nóng)挖取野生的雪膽植株后在家種植的，大多數(shù)種植時間為3-5年。目前，雪膽資源正面臨危機，野生資源數(shù)量不斷減少。資料記錄顯示，在貴州地區(qū)，雪膽塊莖共有8種，1個原亞種和3個原變種，但本次試驗收集到的雪膽基源僅有肉花雪膽(Hemsleyacarnosiflora)、母豬雪膽(Hemsleyavillosipetala)、文山雪膽(Hemsleyawenshanensis)和羅鍋底(HemsleyaMacrosperma)4種。市場調(diào)查和走訪藥農(nóng)均表示，目前野生雪膽越來越少，且個頭較大的雪膽塊莖難尋，市面上出現(xiàn)個頭大的塊莖大多數(shù)基本都是通過后期人工種植的。野生資源的過度挖采，也制約了其藥用價值的擴大。利用組培技術(shù)，可以加快雪膽植物的選育進程，實現(xiàn)其大規(guī)模的人工種植。同時，這也是解決資源匱乏問題和有效保護雪膽屬植物的有效方法之一[15]。

在選擇藥源時，除了需要考慮有效成分的指標，還需要充分考慮資源的貯藏量。結(jié)合雪膽屬植物空間分布格局的特征，主產(chǎn)肉花雪膽的納雍、織金兩地呈集群分布，已經(jīng)有一定的規(guī)模化引種栽培，并形成了商品，因此肉花雪膽可作為首選藥源，在今后的研究中應該引起重視。

在皂苷的提取方面，除了地下部分，也可開發(fā)地上部分，趙敏彤等[16]發(fā)現(xiàn)雪膽同科植物絞股藍(Gynostemmapentaphyllum)葉的活性成分主要是皂苷類化合物，有抗腫瘤，降血脂的效果，因此可以進一步對雪膽屬植物的地上部分加以探索，提高雪膽屬植物的利用。