潘彬雄 弓晟 張鵬 劉子葉 皮彭健 陳旺 黃文強(qiáng) 王保舉? 詹求強(qiáng)?

1)(華南師范大學(xué),華南先進(jìn)光電子研究院,廣州 510006)

2)(華南師范大學(xué)物理學(xué)院,廣州 510006)

激光點掃描熒光顯微鏡憑借高分辨率、高靈敏度、高特異性、可光學(xué)層切三維成像和動態(tài)成像等優(yōu)勢,已成為生命科學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的重要工具.隨著研究者對生命科學(xué)研究的逐漸深入,由于受光學(xué)衍射極限影響和逐點掃描探測的限制,傳統(tǒng)點掃描共聚焦顯微鏡的時空分辨率已無法完全滿足相關(guān)研究需求,在實際應(yīng)用中面臨諸多挑戰(zhàn).近二十年來,超分辨熒光顯微成像技術(shù)取得了重要進(jìn)展,研究人員發(fā)展了多種高空間分辨率、高時間分辨率的點掃描熒光顯微成像技術(shù),對于生物成像等具有重要意義.然而,有關(guān)該領(lǐng)域最新進(jìn)展的綜述論文較少,系統(tǒng)地討論、總結(jié)基于點掃描的高時空分辨熒光顯微成像技術(shù)的研究進(jìn)展,對于其未來研究發(fā)展極為重要.本文主要從時間分辨率與空間分辨率兩個維度分別介紹了各類點掃描熒光顯微成像技術(shù)的基本原理及相關(guān)進(jìn)展,并介紹了高時空分辨顯微成像技術(shù)及應(yīng)用,最后討論展望了高時空分辨點掃描熒光顯微鏡的未來發(fā)展趨勢和挑戰(zhàn).

1 引言

光學(xué)顯微鏡將人類視野從宏觀拓展到了微觀領(lǐng)域,為探究物質(zhì)構(gòu)成與生命起源發(fā)揮了重要作用.1873年,德國科學(xué)家Abbe 提出傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率由波長和物鏡數(shù)值孔徑?jīng)Q定,其理論公式為橫向分辨率dminλ0/(2NAobj),軸向分辨率Zmin2λ0/(NAobj)2[1,2].其中,dmin是橫向分辨最小距離;Zmin是軸向分辨最小距離;λ0是光波長;NAobj是物鏡數(shù)值孔徑.因此,在可見光波段,傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡分辨率,橫向約200 nm,軸向約500 nm.

然而,為進(jìn)一步揭示蛋白分子相互作用,亞細(xì)胞器動態(tài)變化等機(jī)理,光學(xué)顯微鏡分辨率需要由百納米量級跨越至幾十納米甚至幾納米量級.為實現(xiàn)上述目標(biāo),研究者提出多種突破衍射極限的遠(yuǎn)場光學(xué)顯微超分辨成像技術(shù),其中代表性技術(shù)有:基于單分子定位顯微鏡(single-molecule localization microscopy,SMLM)的光激活定位顯微鏡(photoactivated localization microscopy,PALM)[3]和隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微鏡(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM)[4],基于頻域擴(kuò)展的結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡(structured illumination microscopy,SIM)[5],以及基于點掃描成像的受激輻射損耗顯微鏡(stimulated emission depletion,STED)[6].這些代表性技術(shù)在空間分辨率與時間分辨率方面各具優(yōu)勢.例如,單分子定位顯微鏡(SMLM)核心思想為“閃爍”、“定位”與“重構(gòu)”[7-9],通過每次激發(fā)少量探針以達(dá)到高定位精度,橫向分辨率最高可達(dá)10 nm,但需要大量原始圖像進(jìn)行重構(gòu)計算,因此時間分辨率通常在分鐘量級,難以實現(xiàn)活細(xì)胞快速動態(tài)成像.SIM 技術(shù)采用結(jié)構(gòu)光照明方式,提取目標(biāo)圖像的高頻信息,需5—9 張原始圖像重構(gòu)計算出高分辨圖像[10,11],其時間分辨率相對較高,但空間分辨率有限,僅比寬場顯微鏡提高2 倍.相較于上述兩類技術(shù),STED 技術(shù)的空間分辨率顯著高于SIM,一般為20—50 nm[6,12,13],時間分辨率也明顯高于SMLM,因此在兼具高時空分辨率方面具有優(yōu)勢(表1).

表1 SMLM,SIM,STED 超分辨技術(shù)的關(guān)鍵性能指標(biāo)對比Table 1.Technical comparison of SMLM,SIM,STED super-resolution microscopy.

為應(yīng)對當(dāng)前科學(xué)研究需求,研究者對現(xiàn)代顯微技術(shù)的時空分辨率均提出了更高要求,實現(xiàn)高時空分辨率顯微成像技術(shù)已成為顯微成像領(lǐng)域的重要研究方向.本文主要介紹了多種基于點掃描成像的技術(shù)原理及相關(guān)進(jìn)展,從時間分辨率與空間分辨率兩個維度分別討論了各類技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用,總結(jié)了基于點掃描的高時空分辨顯微成像技術(shù)進(jìn)展及應(yīng)用,最后分析討論了高時空分辨點掃描熒光顯微鏡的未來發(fā)展趨勢和挑戰(zhàn).

2 傳統(tǒng)點掃描共聚焦顯微成像

早期,傳統(tǒng)光學(xué)顯微成像系統(tǒng)以寬場顯微鏡為主,即整個樣品被同時激發(fā),所產(chǎn)生的熒光信號被相機(jī)收集的同時,也包括了未聚焦的背景信號(圖1(a)和圖1(b)).因此,寬場顯微鏡的軸向分辨率很差,無法實現(xiàn)清晰的三維成像(圖1(e)和圖1(f)).共聚焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy,CLSM)通過空間針孔阻擋了離焦光,進(jìn)而提高了分辨率和對比度,使其具備光學(xué)切片的能力,能夠?qū)崿F(xiàn)清晰的三維成像(圖1(c)—(f))[14,15].因此,共聚焦激光掃描顯微鏡憑借具有非接觸、非侵入性、操作簡便等優(yōu)勢,得到了廣泛應(yīng)用,且已實現(xiàn)了商業(yè)化[16,17].

圖1 寬場和共聚焦顯微成像技術(shù)對比(a) 寬場顯微鏡系統(tǒng)簡化圖;(b) 寬場顯微鏡熒光信號采集方式[18];(c) 共聚焦顯微鏡系統(tǒng)簡化圖;(d) 共聚焦顯微鏡熒光信號采集方式[18];(e) 二維切面圖對比[18];(f) 三維重構(gòu)圖對比[18]Fig.1.Comparison of wide-field and confocal microscopy:(a) Simplified system schematic of wide-field microscopy;(b) fluorescent signal acquisition of wide-field microscopy[18];(c) simplified system schematic of confocal microscopy;(d) fluorescent signal acquisition of confocal microscopy[18];(e) comparison of two-dimensional section images[18];(f) comparison of three-dimensional reconstruction images[18].

為提高共聚焦顯微鏡分辨率,1988 年Sheppard[19]提出了在不犧牲信噪比的情況下,獲得兩倍分辨率提高的點掃描共聚焦成像方式,其原理為使用陣列探測器替代單像素探測器,每個像素都充當(dāng)一個針孔,用于記錄分辨率增強(qiáng)但信號低和偏移的共焦圖像,如圖2(a)所示.通過將檢測到的熒光向照明軸重新分配來校正偏移并恢復(fù)信號,如圖2(b)所示,從而減少信號損失的情況下提高了分辨率.與反卷積算法結(jié)合,橫向分辨率可以達(dá)到120 nm,該成像系統(tǒng)已有商業(yè)化產(chǎn)品,即蔡司的Airyscan 顯微鏡[20].然而,逐點串行掃描方式會導(dǎo)致時間分辨率相對較差.例如,同樣成像視野(512×512 像素),寬場成像單幀時間為20 ms,共聚焦點掃描單像素駐留時間為10 μs,整個成像視野則需2.6 s.

3 高時間分辨率點掃描成像技術(shù)

3.1 基于多焦點陣列提高成像速度

為提高共聚焦顯微鏡成像速度,2010 年Müller 和Enderlein [21]提出了基于面陣探測器(CCD)的單焦點激光掃描共聚焦顯微成像技術(shù),并將其命名為圖像掃描顯微技術(shù)(image scanning microscopy,ISM).其將傳統(tǒng)的共焦激光掃描顯微鏡與快速寬場CCD 檢測相結(jié)合,同時通過上述像素重定位方法和反卷積算法實現(xiàn)分辨率提升.在對熒光珠成像中,傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡實現(xiàn)了244 nm 分辨率,而ISM 的分辨率可至150 nm,相比于CLSM 分辨率提高了約1.63 倍(圖2(a)—(c)).為解決ISM技術(shù)單點掃描成像速度有限的問題,York 等[22]在2012 年提出了多焦點結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡(multifocal structured illumination microscopy,MSIM).該技術(shù)原理如圖2(d)所示,采用高速數(shù)字微反射鏡器件(digital micromirror device,DMD)同時實現(xiàn)多焦點結(jié)構(gòu)光的產(chǎn)生和掃描,通過數(shù)字像素重定位和反卷積技術(shù)進(jìn)行圖像重構(gòu),在45.6 μm×45.6 μm的超大視野成像中獲得了1 Hz 時間分辨率,并以此實現(xiàn)三維層切成像,其中成像深度可達(dá)48 μm,同時具有橫向約145 nm、軸向約400 nm 的空間分辨率,如圖2(e)和圖2(f) 所示.該技術(shù)相比單點掃描ISM 技術(shù)不僅具有高時間分辨率,還同時具有深層三維成像能力,為活體厚樣品的三維成像提供了強(qiáng)有力的工具.為進(jìn)一步提高M(jìn)SIM 成像深度,2014年,Ingaramo 等[23]引入近紅外脈沖光實現(xiàn)了多光子激發(fā)的MSIM 技術(shù),將成像深度提高至100 μm,同時兼顧了高時間分辨率與高空間分辨率的優(yōu)勢.

3.2 基于微透鏡陣列提高成像速度

由于多焦點光場的光強(qiáng)嚴(yán)重受限于數(shù)字微鏡陣列和空間光調(diào)制器的反射效率.為生成高效率多焦點光場,有研究者提出利用微透鏡陣列產(chǎn)生并行多焦點聚焦光斑.轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡(spinning disk confocal microscopy,SDCM)正是利用此概念,如圖3(a)所示,該系統(tǒng)核心器件由兩個分別帶有微透鏡陣列和針孔陣列的轉(zhuǎn)盤組成.當(dāng)用準(zhǔn)直光照射時,每個微透鏡都會產(chǎn)生一個聚焦光點,微透鏡陣列產(chǎn)生約1000 個焦點對樣品進(jìn)行實時掃描成像[26,27].在相同信噪比下,轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡的成像速度是傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡的10—100 倍[28].此外,轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡還具有降低光漂白,細(xì)胞光毒性低,可長時程活細(xì)胞成像的優(yōu)勢[29-31].轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡雖然借助微透鏡陣列提高了成像速度,但其分辨率相較于傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡并未改善.

圖3 基于微透鏡陣列的快速成像技術(shù)示意圖(a) 轉(zhuǎn)盤共聚焦系統(tǒng)簡化圖;(b) 實現(xiàn)Instant-SIM 的關(guān)鍵步驟[32];(c) Instant-SIM和轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡的活細(xì)胞雙色成像對比[32]Fig.3.Schematic diagram of fast imaging technology based on microlens array:(a) Simplified schematic of the spinning disk confocal system;(b) key steps in implementing Instant-SIM[32];(c) dual-color imaging comparison of Instant-SIM and spinning disk confocal microscope on live-cell[32].

為了提高轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡分辨率,同時兼顧其高速成像的優(yōu)勢,York 等[32]在2013 年提出了一種基于微透鏡陣列的實時多焦點結(jié)構(gòu)光超分辨技術(shù)(instantaneous structured illumination microscope,Instant-SIM),其原理為:首先利用微透鏡陣列生成多焦點激發(fā)模式,與之相匹配的針孔陣列在共焦面抑制離焦熒光信號,再利用一個共軛且匹配的微透鏡陣列局部縮小每個透過針孔的熒光焦點至原來尺寸的1/2,通過硬件實現(xiàn)像素重定位效果,最后再由振鏡控制激發(fā)點陣掃描整個視場,并將縮小后的熒光點陣反射到CCD 對應(yīng)的位置,疊加形成實時超分辨圖像(圖3(b)).Instant-SIM 將MSIM 需要后處理的步驟完全在硬件中實現(xiàn),使其具備了對活體樣品進(jìn)行高分辨率實時觀測的能力.同時,Instant-SIM 的橫向和軸向的分辨率分別為145 nm 和350 nm,采集速度高達(dá)100 Hz,并在活體肺成纖維細(xì)胞中以更高的三維分辨率且10 倍于轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡的成像速度獲取雙色超分辨圖像(圖3(c)).Qin 等[25,33]還通過將傳統(tǒng)轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡與ISM 的超分辨方法相結(jié)合,提出了分辨率更高的CSD-ISM 技術(shù),其顯著優(yōu)勢在于可簡單實現(xiàn),如對現(xiàn)有共聚焦旋轉(zhuǎn)盤裝置進(jìn)行光源調(diào)制,使旋轉(zhuǎn)盤與照明和成像相機(jī)同步,從而很容易地升級到ISM.

4 超高空間分辨率點掃描成像技術(shù)

4.1 點掃描超分辨成像技術(shù)

研究者提出的上述多種方案提高了成像速度,但依然面臨空間分辨率有限的問題.為實現(xiàn)共聚焦超分辨成像(＜100 nm),Hell 和Wichmann[6]在1994 年提出了受激輻射損耗顯微術(shù)(STED).該技術(shù)通過縮小有效激發(fā)光斑的尺寸來實現(xiàn)衍射極限的突破,其基本原理如圖4(a)所示,STED 超分辨成像系統(tǒng)通常由兩束激光構(gòu)成,一束為高斯光,也稱作激發(fā)光,另一束為“甜甜圈”狀的空心光,也稱作損耗光,將兩束光在空間上精準(zhǔn)耦合對齊,僅中間空心位置可發(fā)出熒光,實現(xiàn)減小激發(fā)光斑的效果,進(jìn)而獲得超分辨成像能力[34,35].STED 分辨率由公式所決定,其中d為橫向分辨最小距離,ISTED為損耗光光強(qiáng);Isat為損耗光的飽和光強(qiáng),其含義為使熒光強(qiáng)度降低為初始大小1/2 時的損耗光強(qiáng)度.由上述公式可知STED 光強(qiáng)越高,則分辨率越高(圖4(a)).因此,理論上STED 分辨率可達(dá)無限小[36].例如,有研究者利用NV 色心證實在3.7 GW/cm2的損耗光強(qiáng)下實現(xiàn)了2.4 nm 的分辨率(圖4(b))[37].傳統(tǒng)染料和熒光蛋白飽和光強(qiáng)較高,其所需損耗光光強(qiáng)通常在MW/cm2—GW/cm2量級,僅能實現(xiàn)40—60 nm 的分辨率.同時,傳統(tǒng)商業(yè)染料和熒光蛋白無法承受高光強(qiáng)損耗光,極易出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象,同時高光強(qiáng)損耗光也會對細(xì)胞造成嚴(yán)重光毒性,影響細(xì)胞活性[38].因此,在實際應(yīng)用中STED的損耗光強(qiáng)難以無限提高.

圖4 點掃描超分辨成像技術(shù)示意圖(a) STED 原理圖;(b) STED 在NV 色心上實現(xiàn)2.4 nm 分辨率[37];(c) FED 原理圖[43];(d) 單顆粒FED 成像[44];(e) RESOLFT 原理圖[45];(f)共聚焦顯微鏡和RESOLFT 的細(xì)胞成像對比[46]Fig.4.Schematic diagram of point scanning super-resolution imaging technology:(a) STED schematic;(b) STED achieves 2.4 nm resolution on NV point[37];(c) FED schematic[43];(d) UCNPs-FED single particle imaging[44];(e) RESOLFT schematic[45];(f) cell imaging comparison of confocal microscope and RESOLFT[46].

為了降低損耗光光強(qiáng),進(jìn)而減少光漂白和光毒性,研究者提出了基態(tài)損耗(ground state depletion,GSD)技術(shù)[39],該技術(shù)相較STED 大大降低了光功率,可以實現(xiàn)連續(xù)光激發(fā)與損耗.GSD 技術(shù)的損耗光強(qiáng)相比傳統(tǒng)STED 功率降低了3 個數(shù)量級[40],更適合生物組織細(xì)胞成像.同時,為了減少掃描成像過程中的無效照明,研究者探究了許多方法,如MINFIELD 成像技術(shù)[41],通過僅對提前確定的亞衍射區(qū)域照射來盡可能地減少光損傷;又如Dy-MIN 成像技術(shù)[42],使用像素停留時間的一小部分來驅(qū)動位于STED 光束的環(huán)形波峰上的熒光團(tuán)進(jìn)入暗狀態(tài).相比傳統(tǒng)STED 技術(shù),該成像技術(shù)將損耗光強(qiáng)降低了1/20.盡管已提出多種成像技術(shù)降低損耗光光強(qiáng),但是STED 技術(shù)仍然面臨著損耗光強(qiáng)高、光路難以校準(zhǔn)、成像方法復(fù)雜等問題.

為解決上述難題,Kuang 等[43]提出熒光差分技術(shù)(fluorescence emission difference microscopy,FED) 來降低空心光光強(qiáng)并降低光路復(fù)雜性.該技術(shù)分別利用實心光斑和空心光斑掃描樣品獲得兩張圖像,并將兩張圖像相減,最終得到差分超分辨圖像(圖4(c),(d)),其原理公式可表示為PSFFEDPSFsolid-rPSFdoughnut,PSFFED,PSFsolid,PSFdoughnut分別為FED、實心光斑和空心光斑的點擴(kuò)散函數(shù)(point spread function,PSF),r為相減系數(shù)[47,48].與STED類似,當(dāng)產(chǎn)生熒光非線性飽和時,FED 技術(shù)的分辨率可進(jìn)一步提高[49].相比STED 技術(shù),FED 方法具有無熒光染料限制、成像系統(tǒng)簡單、后期處理方便的優(yōu)勢.

FED 技術(shù)雖具有光強(qiáng)低的優(yōu)勢,但存在分辨率相對較低的問題,一般而言,FED 技術(shù)分辨率難以突破100 nm.為追求超高分辨率,進(jìn)一步降低損耗光強(qiáng),研究者提出了基于光開關(guān)屬性的可逆飽和光轉(zhuǎn)移熒光超分辨顯微技術(shù)(reversible saturable optical fluorescence transitions,RESOLFT)[50,51],RESOLFT 首先使用405 nm 激發(fā)光激活衍射受限光斑區(qū)域內(nèi)的蛋白分子,使其發(fā)光,再使用一束488 nm 環(huán)形光使偏離中心的蛋白分子轉(zhuǎn)化為非發(fā)射狀態(tài),最后收集熒光信號(圖4(e)).與STED 相比,在獲得相同分辨率的情況下,該技術(shù)所需要的光強(qiáng)可降低8 個數(shù)量級.然而,該技術(shù)的成像速度取決光開關(guān)轉(zhuǎn)換速率.例如,基于綠色熒光蛋白rsEGFP 實現(xiàn)RESOLFT 技術(shù),其成像的激發(fā)功率密度僅為1 kW/cm2,實現(xiàn)了約36 nm 的成像分辨率,但該技術(shù)的單像素駐留時間卻需10—20 ms.為提高RESOLFT 技術(shù)成像速度,研究者發(fā)展了綠色熒光蛋白rsEGFP2,該蛋白的光轉(zhuǎn)換速率較快,掃描速度提升25—250 倍[52].但是,RESOLFT熒光探針依然存在著成像時間長、光漂白等缺點.為進(jìn)一步提高成像分辨率與降低光毒性及光漂白等問題,有研究者提出基于最少光子數(shù)的納米尺度定位技術(shù)(minimal photon fluxes,MINFLUX)作為一種新興納米級超高分辨顯微技術(shù)[53,54],使用空心光束作為泵浦光,調(diào)節(jié)光束中心的位置,當(dāng)熒光強(qiáng)度最小時,熒光分子就被認(rèn)為在空心光束中心位置.其成像方式實現(xiàn)了1—3 nm 的超高空間分辨率.隨后研究者在MINFLUX 的基礎(chǔ)上又發(fā)展了MINSTED 技術(shù),更是讓分辨率突破納米量級,獲得0.23 nm 的定位精度[55].MINFLUX 和MINSTED技術(shù)在空間分辨率上有著巨大優(yōu)勢,但耗時很長.

為徹底解決光漂白問題,降低光毒性,實現(xiàn)超長時程的超分辨成像,本課題組提出了上轉(zhuǎn)換超分辨顯微技術(shù).上轉(zhuǎn)換熒光納米探針(upconverting nanoparticles,UCNPs)具有近紅外激發(fā)、非線性強(qiáng)、光譜豐富可調(diào)、無熒光漂白等獨特優(yōu)勢,在解決傳統(tǒng)STED 面臨的激光光強(qiáng)過高、熒光漂白快、無法長時程觀測、光毒性大、超快激光系統(tǒng)復(fù)雜等方面問題具有很大的潛力.2015年,Wu 等[56]首次實現(xiàn)了近紅外光束調(diào)控上轉(zhuǎn)換熒光損耗現(xiàn)象,獲得了30%的熒光損耗效率,為實現(xiàn)超低功率、無光漂白的上轉(zhuǎn)換超分辨開辟了新思路,提供了重要理論基礎(chǔ).2017年,為實現(xiàn)上轉(zhuǎn)換超分辨顯微技術(shù),Zhan 等[57]利用“同種離子間交叉弛豫”構(gòu)建了高效的熒光損耗機(jī)理(圖5(a)),實現(xiàn)了96%的極高損耗效率和分辨率為66 nm 的超分辨顯微成像(圖5(b)),其所需損耗光強(qiáng)相比傳統(tǒng)STED 降低了至少2 個數(shù)量級,克服了光漂白現(xiàn)象,并首次實現(xiàn)了上轉(zhuǎn)換探針標(biāo)記的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)成像.同年,Liu 等[58]報道了類似的相關(guān)現(xiàn)象和上轉(zhuǎn)換超分辨顯微技術(shù).為追求更極致的超分辨成像性能,2022年,Guo 等[59]結(jié)合上轉(zhuǎn)換發(fā)光的多光子非線性泵浦依賴特性,提出了受激輻射誘導(dǎo)激發(fā)損耗技術(shù)(stimulatedemission induced excitation depletion,STExD),可實現(xiàn)傳統(tǒng)STED 所不具有的熒光損耗非線性放大的獨特效應(yīng),逐級降低高能級熒光損耗所需要的飽和光強(qiáng),將損耗飽和光強(qiáng)陡降至42 kW/cm2量級,較傳統(tǒng)STED 技術(shù)下降3 個數(shù)量級,并獲得了～34 nm 的超分辨成像結(jié)果.同年,Pu 等[60]基于上轉(zhuǎn)換“光-物質(zhì)-能量吸收體”的熒光損耗理論,提出了表面遷移熒光損耗技術(shù)(surface-migration emission depletion,SMED),將傳統(tǒng)的損耗光引起受激輻射與激發(fā)光進(jìn)行低效率競爭,轉(zhuǎn)變?yōu)橐龑?dǎo)熒光能量向高容量能量吸收體轉(zhuǎn)移(圖5(c)),實現(xiàn)了極高效的熒光損耗,損耗效率可達(dá)95%,且飽和光強(qiáng)僅為18.3 kW/cm2量級,較傳統(tǒng)STED 技術(shù)下降3—4 個數(shù)量級.同時,僅利用毫瓦級、近紅外、連續(xù)激光實現(xiàn)了分辨率高達(dá)17 nm 的超分辨顯微成像(圖5(d)).

圖5 上轉(zhuǎn)換超分辨成像技術(shù)示意圖(a) 交叉弛豫傳能熒光損耗機(jī)制[57];(b) 上轉(zhuǎn)換STED 超分辨成像結(jié)果[57];(c) 表面遷移熒光損耗機(jī)制[60];(d) SMED 超分辨成像結(jié)果[60];(e) Yb3+/Pr3+共摻雜納米顆粒的光子雪崩機(jī)制[61];(f) 光子雪崩超分辨成像結(jié)果[61]Fig.5.Schematic diagram of up-conversion super-resolution imaging technology:(a) Cross-relaxation energy transfer fluorescence loss mechanism[57];(b) up-conversion STED super-resolution imaging results[57];(c) surface migration fluorescence loss mechanism[60];(d) SMED super-resolution imaging results[60];(e) photon avalanche mechanism of Yb3+/Pr3+ co-doped nanoparticles[61];(f) photon avalanche super-resolution Resolution imaging results[61].

上轉(zhuǎn)換熒光除了可以被低光強(qiáng)激光實現(xiàn)高效熒光損耗外,還有具有超飽和非線性(n＜ 1)效應(yīng)與超高階多光子非線性(n＞ 1)效應(yīng).基于上轉(zhuǎn)換非線性效應(yīng)也可有效調(diào)制激發(fā)光斑,進(jìn)而改變成像點擴(kuò)散函數(shù)實現(xiàn)超分辨顯微成像.Wu 等[62]提出了利用單個低功率、波長為808 nm 激光引發(fā)摻鉺上轉(zhuǎn)換探針產(chǎn)生超飽和非線性激發(fā)效應(yīng)(n=0.59),實現(xiàn)了無光漂白的熒光差分顯微技術(shù)的超飽和激發(fā)上轉(zhuǎn)換超分辨成像,分辨率達(dá)到了80 nm.同年,Chen 等[63]將該成像技術(shù)應(yīng)用深層成像,在93 μm厚的組織成像中,實現(xiàn)了50 nm 的分辨率.Huang等[44]構(gòu)建了激發(fā)正交的上轉(zhuǎn)換探針,在低光強(qiáng)、超飽和非線性激發(fā)下,實現(xiàn)了銩-藍(lán)光和鉺-綠光雙通道、無串?dāng)_的檢測,實現(xiàn)了單次掃描的熒光差分超分辨成像,分辨率高達(dá)54 nm 的超分辨成像,同時其成像時間縮短了1/2.為降低飽和熒光差分超分辨成像技術(shù)中對空心光束的依賴,僅用簡易的高斯光來實現(xiàn)超分辨成像,有研究者提出基于非線性多光子效應(yīng)提高成像分辨率,其理論為dλ0/(2NAobj),其中dmin是橫向分辨最小距離;λ0是光在真空中的波長;NAobj是物鏡數(shù)值孔徑,N為非線性多光子數(shù).然而,傳統(tǒng)高階非線性多光子(N＞1)成像技術(shù)受限于激發(fā)波長與非線性階數(shù)N彼此依賴的倍數(shù)關(guān)系,在發(fā)射波長不變的情況下,多光子激發(fā)過程階數(shù)N越高,則需要波長為N倍的高功率脈沖光激發(fā)實現(xiàn),這對于實現(xiàn)超分辨率成像存在理論上的困境.為克服這個難題,本課題組提出基于上轉(zhuǎn)換釹、鐿和銩三種摻雜的上轉(zhuǎn)換體系,實現(xiàn)了短波長激發(fā)的高階非線性多光子發(fā)光.具體地,利用30 μW,730 nm 連續(xù)光激發(fā)實現(xiàn)了超衍射極限的高階非線性四光子(n=4)熒光成像,分辨率達(dá)到了161 nm.如同非線性效應(yīng)可在二維上壓縮點擴(kuò)散函數(shù),同樣也可將該思路擴(kuò)展至三維成像.Denkova 等[64]利用980 nm 激發(fā)實現(xiàn)了非線性四光子熒光,獲得了三維高分辨成像.基于多光子激發(fā)的非線性可直接提高分辨率,是一個重要的、簡單的超分辨成像方法,但是長久以來傳統(tǒng)上轉(zhuǎn)換非線性階數(shù)并不高,一般多光子n=4—5,進(jìn)而無法實現(xiàn)100 nm 以內(nèi)的超分辨成像.近期,Lee 等[65]在銩離子上轉(zhuǎn)換體系中利用近紅外1064 nm 激發(fā)實現(xiàn)了基于納米光子雪崩效應(yīng),并據(jù)此實現(xiàn)了橫向～70 nm 的超分辨成像.但該探針熒光輻射波長為800 nm,絕大部分探測器在此波段探測效率較低,不利于成像,此外,該體系雪崩熒光響應(yīng)時間慢(608 ms),難以應(yīng)用于生物成像.同一時期,本課題組基于鐿和鐠兩種摻雜離子實現(xiàn)了非線性階數(shù)為26 階的光子雪崩非線性效應(yīng),實現(xiàn)了約62 nm 的超分辨成像(圖5(e),(f)),同時基于鐿、鐠和銩三種離子摻雜上轉(zhuǎn)換體系提出了遷移光子雪崩概念,并結(jié)合能量傳遞及級聯(lián)激發(fā)實現(xiàn)了光子雪崩效應(yīng)放大,獲得了超高46 階非線性成像,實現(xiàn)了多細(xì)胞視野的實用超分辨成像技術(shù).非線性階數(shù)的大幅度提升使多光子成像成為突破衍射極限且分辨率可達(dá)60 nm 的超分辨成像技術(shù),同時成像系統(tǒng)具有極為簡便、激光光強(qiáng)要求極低的優(yōu)勢[61].

4.2 點掃描三維超分辨成像技術(shù)

細(xì)胞結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化并不僅僅局限于二維層面,而是往往發(fā)生在三維層面.2000年,Klar 等[66]提出了利用加載了0/π 環(huán)形相位的損耗光對熒光進(jìn)行受激輻射損耗,獲得6 倍的軸向分辨率提高,實現(xiàn)了軸向分辨率為110 nm.Harke 等[67]報道的3D-STED 技術(shù)可實現(xiàn)xyz三個維度上的超分辨.通過同時引入0—2π 渦旋相位(橫向調(diào)制)以及0/π環(huán)形相位(軸向調(diào)制)兩束損耗光,對熒光PSF 進(jìn)行三維受激輻射損耗,如圖6(a),(b)所示.3D-STED實現(xiàn)了橫向43 nm 和軸向125 nm 的分辨率,如圖6(d)所示.為矯正成像像差,實現(xiàn)光束調(diào)制的靈活性,耶魯大學(xué)科研團(tuán)隊提出利用兩個空間光調(diào)制器分別替代0—2π 渦旋相位以及0/π 環(huán)形相位板,實現(xiàn)了具有自適應(yīng)光學(xué)(adaptive optics,AO)優(yōu)化像差能力的AO-3DSTED,獲得了更高的成像質(zhì)量,提高了3DSTED 深度成像的能力[68].為減少空間光調(diào)制器的使用,Lenz 等[69]更是通過巧妙的光路設(shè)計,僅利用一個SLM 實現(xiàn)了AO-3DSTED,如圖6(c)所示.

盡管3D-STED 能實現(xiàn)三維超分辨,但橫向和軸向的分辨率通常相差2—3 倍.為解決此難題,2008年,Schmidt 等[70]結(jié)合3D-STED 以及4π 顯微鏡的技術(shù)優(yōu)勢,提出了isoSTED,可獲得40—45 nm的各項同性分辨率.隨后,Chmyrov 等[71]將自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)加入isoSTED中,實現(xiàn)了AO-isoSTED技術(shù).如圖6(e)所示,損耗光的調(diào)制采用了單SLM方法,SLM 上分別加載了調(diào)制STEDxy的0—2π渦旋相位以及STEDz的離焦相位,圖6(e)右上方插圖分別展示了STEDxy,STEDz以及STEDtotal雙物鏡干涉的PSF.由于自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)的引入,使得AO-isoSTED 技術(shù)在實驗中從整個30—35 μm厚生物樣品內(nèi)穩(wěn)定獲取了三維各向同性亞50 nm分辨率,并藉此對一系列亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行了精細(xì)的三維超分辨成像,如圖6(f)所示.此外,B?hm 等[72]基于更低損耗光強(qiáng)的RESOLFT 提出了4Pi-RESOLFT 技術(shù),實現(xiàn)了30—50 nm 的三維超分辨成像.然而,由于RESOLFT 可逆光開關(guān)熒光蛋白的轉(zhuǎn)換速率較慢,如對400 μm3體積進(jìn)行三維成像需要160 min 之久,這極大地限制了RESOLFT 技術(shù)在三維動態(tài)成像中的應(yīng)用.

5 超高時空分辨率點掃描成像技術(shù)

5.1 智能掃描超分辨成像技術(shù)

上述點掃描成像技術(shù)在空間分辨率方面展示了優(yōu)越的性能,可實現(xiàn)20—40 nm 分辨率,可清晰觀測亞細(xì)胞細(xì)微結(jié)構(gòu).但是,由于點掃描超分辨技術(shù)探測體積的縮小,所能探測的熒光光子數(shù)相應(yīng)減少,為保證相同的成像信噪比,一般會增加單像素掃描時間.同時為滿足奈奎斯特采樣定理,同一視野下超分辨所需像素數(shù)更多,最終導(dǎo)致點掃描超分辨技術(shù)時間分辨率較差.為進(jìn)一步提高時間分辨率,有研究者提出了可總結(jié)為目標(biāo)引導(dǎo)的智能掃描超分辨成像技術(shù),其原理為控制掃描振鏡跳過視野內(nèi)沒有樣品的區(qū)域.基于目標(biāo)引導(dǎo)的智能掃描方式已有多項代表性技術(shù)被報道,如Staudt 等[74]在2011 年提出減少熒光“開關(guān)”狀態(tài)切換周期的智能點掃描技術(shù).如圖7(a)所示,在決策時間dT內(nèi),接收的光子數(shù)達(dá)到第1 閾值時激光器才會被接通,如果達(dá)到第2 閾值且讀出時間小于駐留時間,在剩余駐留時間中激光器會被關(guān)閉.該方法減少了激發(fā)光強(qiáng),且在保留空間分辨率的同時,提高了成像速度,并且減低了高達(dá)8 倍的光漂白現(xiàn)象.另外,Dreier 等[75]于2019 年將智能掃描的概念應(yīng)用于RESOLFT 顯微術(shù).這種智能掃描點掃描的方法將RESOLFT 成像速度提高了6倍,并將體內(nèi)成像的光劑量降低70%—90%.

圖7 智能掃描超分辨成像技術(shù)示意圖(a) 智能RESOLFT 掃描機(jī)制[75];(b) etSTED 實驗方案[76]Fig.7.Schematic diagram of intelligent scanning super-resolution imaging technology:(a) Smart RESOLFT scanning mechanism[75];(b) etSTED experimental scheme[76].

通過目標(biāo)引導(dǎo)的智能掃描超分辨成像技術(shù),可提供高時間分辨率.同時,由于減少了無效照明,也有效降低了STED/RESOFLT 技術(shù)的光漂白問題,使其可實現(xiàn)長時間超時空分辨成像.然而,有些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)所發(fā)生的動態(tài)變化是快速的,可能僅在毫秒至幾秒內(nèi)變化,成像過程中難以捕捉目標(biāo)區(qū)域.為此,有研究者提出了事件觸發(fā)的智能點掃描超分辨成像技術(shù)(event-triggered STED,etSTED)[76],其基本原理如圖7(b)所示,先用寬場快速成像對事件進(jìn)行檢測和定位,當(dāng)檢測到事件發(fā)生則切換為STED 模式,在事件坐標(biāo)周圍小塊區(qū)域按照預(yù)先設(shè)定的參數(shù)進(jìn)行采集.之后繼續(xù)寬場成像,不斷重復(fù)這個過程.該技術(shù)不僅使細(xì)胞整體應(yīng)力和光損傷最小化,還能夠顯著提高時間分辨率.與手動采集整個研究樣本區(qū)域的STED 時間間隔相比,所選感興趣區(qū)域的成像速度快了100—5000 倍.

5.2 并行掃描超分辨成像技術(shù)

智能掃描超分辨技術(shù)方案依然依賴單點掃描和單點探測的成像方式,時間分辨率提升始終有限.為追求超高時間分辨率,2011年,Bingen 等[77]率先提出了四光束多點并行掃描的STED 技術(shù),該技術(shù)將成像速度提升至原來的4倍,同時增大了掃描視場.但該技術(shù)方案需要每束激發(fā)光與空心光嚴(yán)格耦合實現(xiàn)同步掃描,并依賴多個點探測器,系統(tǒng)搭建較為復(fù)雜.為此,Bingen 等[77]提出了一種能更為簡單、高效的產(chǎn)生并行空心光的方法,利用兩個正交且不相干的交叉駐波相疊加,產(chǎn)生超過10000 個空心光并行掃描的pRESOLFT 技術(shù),其原理如圖8(a)所示.與傳統(tǒng)RESOLFT 技術(shù)一樣,“ON”狀態(tài)聚焦光斑尺寸隨激發(fā)光強(qiáng)I 與飽和光強(qiáng)Is的比值增大而減小,如圖8(b)所示.由于大部分用于RESOLFT 技術(shù)的可逆蛋白RSFPs 的“開關(guān)”速率相對較慢,在～10 μm 成像視野下,傳統(tǒng)點掃描RESOLFT 技術(shù)成像時間所需為20—30 min[78,79].相比傳統(tǒng)點掃描RESOLFT 技術(shù),利用上萬個空心光并行掃描的成像方式,可在 120 μm × 100 μm的超大視野下,以＜1 s 的時間分辨率實現(xiàn)～77 nm超分辨活細(xì)胞成像,如圖8(c)所示.同樣地,Bergermann 等[80]也利用上述基本原理,將其擴(kuò)展至多色并行掃描STED 成像.

圖8 并行掃描超分辨成像技術(shù)示意圖(a) pRESOLFT 系統(tǒng)簡化圖[71];(b) pRESOLFT “ON” 狀態(tài)下不同 I/Is 的二維強(qiáng)度分布圖[71];(c) pRESOLFT 納米顯微鏡的活細(xì)胞成像[71];(d) 3D-pRESOLFT 三種模式的駐波疊加產(chǎn)生蜂窩狀照明陣列[81];(e) 3DpRESOLFT 納米顯微鏡的活細(xì)胞成像[81]Fig.8.Schematic diagram of parallel scanning super-resolution imaging technology:(a) Simplified schematic of pRESOLFT system[71];(b) 2D profiles of the on-state probability distribution for different I/Is [71];(c) live-cell imaging with pRESOLFT nanoscopy[71];(d) three patterns of standing waves are superimposed to create a honeycomb lighting array in 3D-pRESOLFT[81];(e) live-cell imaging with 3D-pRESOLFT nanoscopy[81].

上述并行掃描成像技術(shù),使其在二維上具備了超高時空分辨的性能,為實現(xiàn)各向同性的三維超高時空分辨率成像,Boden 等[81]使用3 種不同的駐波圖案的相干疊加來創(chuàng)建一個蜂窩狀的三維照明陣列,即3D-pRESOLET 技術(shù),如圖8(d)所示.在40 μm×40 μm 成像視野下,3D-pRESOLET 技術(shù)可實現(xiàn)1—2 Hz 的時間分辨率,并具有亞80 nm的三維各向同性分辨率.3D-pRESOLET 與單束點掃描成像方案相比,掃描步驟大大減少,將一個體積(40 μm×40 μm×1.6 μm)的記錄時間從4.4 h縮短到78 s,如圖8(e)所示.

為了直觀對比上述相關(guān)技術(shù),表2 從空間分辨率、時間分辨率、激光類型及波長、激發(fā)光強(qiáng)、光漂白程度、成像深度以及是否需要重構(gòu)算法等多個方面進(jìn)行了詳細(xì)闡述.例如,STED 技術(shù)雖提高了空間分辨率,但激發(fā)光強(qiáng)都需要數(shù)倍的提升,進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的光漂白,難以在活細(xì)胞成像中應(yīng)用.RESOFLT 技術(shù)基于超低激發(fā)光強(qiáng),極大程度地降低了光毒性和光漂白,但時間分辨率相對較差,難以實現(xiàn)快速動態(tài)成像.為提高成像速度,以并行掃描成像方式為主的MSIM,pRESOFLT 等技術(shù)相繼發(fā)展,但該類技術(shù)的空間分辨率提升有限.isoSTED 帶來了各向同性的超高三維空間分辨率,但也同樣面臨著高激發(fā)光強(qiáng)、光漂白嚴(yán)重的問題,同時復(fù)雜的光學(xué)系統(tǒng)對系統(tǒng)穩(wěn)定性是極大的挑戰(zhàn).基于上轉(zhuǎn)換納米探針的UCNP-STED 技術(shù)相比傳統(tǒng)STED 技術(shù)降低激發(fā)光強(qiáng)3—4 個數(shù)量級,極大程度地降低了光毒性,同時利用近紅外光激發(fā),降低了光在樣品傳播中的散射效應(yīng),可提高成像深度,并且連續(xù)光的使用,極大地簡化了系統(tǒng)復(fù)雜性,此外完全無光漂白的獨特優(yōu)勢,可使其在超分辨領(lǐng)域有著很大的潛力.MINFLUX 和MINSTED 雖在嚴(yán)格意義上不屬于點掃描成像技術(shù),但其創(chuàng)新性地將STED 技術(shù)以及單分子定位技術(shù)相結(jié)合,實現(xiàn)了超高的空間分辨率,使光學(xué)顯微鏡分辨率實現(xiàn)了單納米尺度的突破,但時間分辨率相當(dāng)較慢,通常為分鐘量級,難以實現(xiàn)快速動態(tài)成像.

表2 不同點掃描超分辨成像技術(shù)的關(guān)鍵性能指標(biāo)對比Table 2.Overview of point-scanning super-resolution fluorescence microscopy techniques.

5.3 深度學(xué)習(xí)助力超高時空分辨率成像

深度學(xué)習(xí)在圖像識別和圖像重建等方面具有優(yōu)越性能,已被應(yīng)用于點掃描熒光顯微成像技術(shù)中.深度學(xué)習(xí)與STED 結(jié)合,可以有效克服STED技術(shù)中光漂白嚴(yán)重,光毒性高及系統(tǒng)復(fù)雜等問題,并獲得超高時空分辨率(圖9(a)),使STED 技術(shù)更有利于應(yīng)用于活細(xì)胞成像.2019年,Wang 等[82]基于生成對抗網(wǎng)絡(luò)(generative adversarial network,GAN)實現(xiàn)了跨模態(tài)超分辨成像技術(shù).如利用20 nm熒光珠的共聚焦圖像作為輸入數(shù)據(jù),通過GAN 網(wǎng)絡(luò)輸出了與STED 圖像極為接近的結(jié)果,成功分辨間距為130 nm 的兩個小球,如圖9(b)所示.2020年,Li 等[83]基于GAN 架構(gòu),提出了SRGAN方法,使用STED 點擴(kuò)展函數(shù)的先驗知識和單元格的結(jié)構(gòu)信息來生成用于網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練的模擬標(biāo)記數(shù)據(jù)對,該方法可以將60 nm 分辨率的STED 圖像提高到30 nm 分辨率.同年,Chen 等[84]改良的殘差通道注意力網(wǎng)絡(luò)(residual channel attention networks,RCAN)模型用來對3D 時延圖像進(jìn)行超分辨率的重構(gòu)或者去噪,使用RCAN 在共聚焦顯微鏡中實現(xiàn)去噪和分辨率的提高,在STED 顯微成像中實現(xiàn)約2.5 倍的橫向分辨率增強(qiáng),如圖9(c)所示.2023年,Ebrahimi 等[85]用深度學(xué)習(xí)對STED圖像進(jìn)行去噪,通過減少像素停留時間來減輕光漂白和光損傷.使用20 個圖像數(shù)據(jù)集,將短像素停留時間的低信噪比STED 圖像和長像素停留時間的高信噪比STED 圖像作為輸入圖像對來訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò).將STED 顯微鏡的像素停留時間縮短1/40 以上,同時提高了預(yù)測精度,保持了去相關(guān)分析評估的STED 圖像的橫向分辨率,如圖9(d)所示.深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)模型的建立可以助力于點掃描成像技術(shù)中空間分辨率和時間分辨率的提高,使得傳統(tǒng)點掃描超分辨成像技術(shù)具有超高時空分辨成像性能,更有利于實現(xiàn)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的快速動態(tài)成像.

圖9 深度學(xué)習(xí)助力超高時空分辨率成像示意圖(a) 深度學(xué)習(xí)提高圖像分辨率;(b) GAN 網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練結(jié)果[82];(c) RCAN 網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練結(jié)果[84];(d) Unet-RCAN 網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練結(jié)果[85]Fig.9.Schematic diagram of deep learning-assisted ultra-high spatial-temporal resolution imaging:(a) Deep learning improves image resolution;(b) GAN network training results[82];(c) RCAN network training results[84];(d) Unet-RCAN network training results[85]

6 總結(jié)與展望

本文主要介紹了多種激光點掃描顯微成像技術(shù)的基本原理和最新研究進(jìn)展.傳統(tǒng)點掃描顯微鏡具有分辨率高、信噪比高、可光學(xué)層切和動態(tài)成像等優(yōu)勢,已成為科學(xué)研究中的重要工具.但基于點掃描成像技術(shù)還有諸多方面需要進(jìn)一步探究.1) 在空間分辨率方面,傳統(tǒng)點掃描顯微鏡仍未突破衍射極限,無法觀察到亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及蛋白分子的相互作用.同時傳統(tǒng)點掃描顯微鏡由于采用高能量密度的聚焦光斑進(jìn)行掃描成像,通常會導(dǎo)致的光漂白和光毒性問題,在長時間活細(xì)胞觀測的應(yīng)用中面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn).2) 在時間分辨率方面,傳統(tǒng)點掃描顯微鏡基于串行光柵掃描成像模式極大地限制了成像速度.尤其針對樣品進(jìn)行大視野(高像素)成像時,點掃描顯微鏡需要重復(fù)數(shù)百萬次掃描才能遍歷整個樣品區(qū)域,這無疑限制了其在快速獲取大量數(shù)據(jù)或觀察快速動態(tài)過程的應(yīng)用.

為解決上述問題,在提高空間分辨率方面,研究人員做出諸多努力,發(fā)展了諸如受激輻射損耗顯微鏡等突破衍射極限的超分辨率點掃描成像技術(shù).在提高時間分辨率方面,研究人員陸續(xù)開發(fā)出并行掃描的高時間分辨率顯微成像技術(shù).目前,所報道的多種點掃描成像技術(shù)分別在時間分辨率或者空間分辨率方面各有優(yōu)勢,但如何將二者有機(jī)的融合在一起,發(fā)展新一代具備超高時空分辨率的點掃描成像技術(shù)是未來研究的重要趨勢.例如,諸多研究者也在開發(fā)并探索新型超分辨技術(shù),如在超高空間分辨率上,利用MINFLUX 技術(shù)和MINSTED 技術(shù)可實現(xiàn)納米級分辨率,以及毫秒級蛋白追蹤.在超時間分辨率上,泵浦-探測(pump-probe)顯微鏡結(jié)合了超快激光領(lǐng)域的泵浦-探測技術(shù)以及顯微成像技術(shù),其時間分辨率達(dá)到皮秒甚至飛秒量級,在生物和化學(xué)領(lǐng)域具有重要意義[86-88],該技術(shù)與現(xiàn)有超分辨技術(shù)相結(jié)合有望發(fā)展為兼顧高時空分辨率的成像技術(shù)[89].

總之,激光點掃描顯微鏡在空間分辨率、時間分辨率以及技術(shù)融合等方面仍面臨著很多挑戰(zhàn),同時也蘊藏著巨大的發(fā)展?jié)摿?隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新發(fā)展,兼具超高時空分辨率的點掃描熒光顯微鏡將持續(xù)為生命科學(xué)等領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和技術(shù)進(jìn)步提供重要的工具,為人類對生物體的理解和認(rèn)識帶來新的突破.