馮 敏,幸宏偉,尤琳烽,劉小娟

1.重慶工商大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院,重慶 400067 2.重慶市特色農(nóng)產(chǎn)品加工儲運(yùn)工程技術(shù)研究中心,重慶 400067

1 引 言

洛神花(Roselle),學(xué)名玫瑰茄(HibiscussabdariffaLinn.),又名芙蓉茄、山茄等,是錦葵科一年生的草本植物[1],其花萼有豐富的碳水化合物、維生素、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)等,還含有還原糖、花青素,是天然的抗氧化劑[2]。

洛神花及提取物有很多功能作用,如洛神花多糖提取物對急性肝損傷大鼠具有良好的干預(yù)治療作用[3],洛神花有利尿、清除氧自由基、加快脂肪代謝[4]、降血脂以及抗腫瘤[5]等作用。也有將洛神花開發(fā)成具有保健功能的食品,如王建化等[6]將菊花、洛神花復(fù)合研制果醬,何菁等[7]用玫瑰花和洛神花制作復(fù)合保健飲料等。對洛神花花青素提取及抗氧化活性也有少量報道,如張輝青花等[8]采用果膠酶協(xié)助微波提取,提高了花青素的得率;廖禹東等[9]對不同產(chǎn)地的洛神花花青素進(jìn)行了體外抗氧化研究,但未見有體內(nèi)抗氧化活性的研究報道,而本文是采用超聲波輔助的方法優(yōu)化提取洛神花花青素的工藝,并進(jìn)行體內(nèi)、體外抗氧化活性研究,為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論支持。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

洛神花干花萼(云南大理,購于重慶南坪);斑馬魚(重慶江北三禾水族館);無水乙醇、氯化鉀、冰乙酸、醋酸鈉、鹽酸(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司); 維生素C(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司);DPPH自由基清除能力試劑盒、總抗氧化能力試劑盒、羥自由基測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);DPPP(梯希愛上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司)、AAPH(山東西亞化工有限公司)、AO(Gen-View科學(xué)公司)、魚飼料(泰港科技有限公司);DCFH-DA(Sigma 公司);三卡因(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司)。

2.2 儀器與設(shè)備

SQP電子天平(賽多利科學(xué)儀器(北京)有限公司)、雙頻數(shù)控超聲波清洗儀(KQ-500VDE,昆山市超聲儀器有限公司)、pH計(梅特勒—托利多國際有限公司)、小鋼磨(永康市鉑歐五金制品有限公司)、高速離心機(jī)(TD-420,四川蜀科儀器有限公司)、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、酶標(biāo)儀(infiniteM200瑞士Tecan)、電熱恒溫干燥箱(GZX-DH 500-S-Ⅱ,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);尼康ECLIPSE Ci-L正置熒光顯微鏡(NIKON儀器(上海)有限公司)。

2.3 洛神花花青素的提取

將洛神花花萼于60 ℃烘干后粉碎成粉末,過80目篩,避光密封保存?zhèn)溆?。稱取1 g洛神花干花萼粉,加蒸餾水后進(jìn)行超聲處理,離心取上清液為提取液。提取液通過真空濃縮得濃縮液,4 ℃保存?zhèn)溆?。通過pH示差法[10]算得洛神花花青素的含量和得率。簡述為將2份1 mL的洛神花提取液,分別用pH 1.0和pH 4.5緩沖溶液定容至50 mL,室溫下平衡40 min,在520 nm和700 nm波長下測定提取液的吸光度,根據(jù)公式可以計算出洛神花花青素的含量:

其中:C為花青素含量(g/mL),MW為矢車菊素-3-葡萄糖苷(449.2 g/mol)的分子量;DF為稀釋因子;ε為摩爾吸光系數(shù)26 900(L/mol·cm),L為光長度(1 cm)。

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

分別稱取1 g洛神花干花萼粉5份置于三角瓶中,加入蒸餾水40 mL,此時料液比為1∶40,將工藝參數(shù)設(shè)置為超聲時間為30 min、提取溫度為20 ℃、超聲功率分別為200、250、300、350、400 W,在此條件下提取,并按照2.3的方法計算洛神花花青素得率。在最佳超聲功率條件下,檢測超聲時間、提取溫度、料液比對洛神花花青素得率對影響。超聲時間分別為 20、30、40、50、60 min 五個水平;提取溫度分別為20、30、40、50、60 ℃ 五個水平;液料比蒸餾水用量(mL)∶洛神花質(zhì)量(g)分別為10∶1、20∶1、40∶1、80∶1、160∶1 五個水平。各個水平分別做三組平行實(shí)驗(yàn)。

2.5 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,運(yùn)用正交表L9(34)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),優(yōu)化洛神花花青素的最佳工藝條件。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Orthogonal experiment factors and levels

2.6 洛神花花青素體外抗氧化性的研究

體外抗氧化實(shí)驗(yàn)參考王勝男[11]的方法,并結(jié)合試劑盒的使用說明配置各工作液,分別作DPPH自由基(DPPH·),ABTS自由基(ABTS+·)標(biāo)準(zhǔn)曲線,并根據(jù)各個指標(biāo)的公式計算。

具體如下:將0.5 mg/mL Trolox(維生素E類似物)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液用甲醇分別稀釋成質(zhì)量濃度5、10、15、20、25 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液各400 μL,依次加入600 μL工作液,混合均勻,在25 ℃的條件下,避光靜置三十鐘,在517 nm波長處,用酶標(biāo)儀測定各管吸光度值,繪制DPPH自由基標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)公式計算:

取10 mM Trolox標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋成:0.1 mM、0.2 mM、0.4 mM、0.8 mM、1.0 mM,按照比例加入蒸餾水、待測樣本、ABTS工作液、顯色劑,室溫反應(yīng)6 min,在405 nm的波長條件下,用酶標(biāo)儀測定各管吸光度值,以不同的Trolox濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),來繪制ABTS自由基標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照公式計算:

按照比例加入蒸餾水、0.03% H2O2標(biāo)準(zhǔn)品底物應(yīng)用液、樣本混合后,在37 ℃水浴條件下,準(zhǔn)確反應(yīng)1 min,立即加入2mL顯色劑,混合均勻之后,室溫下放置20 min,在550 nm波長處用酶標(biāo)儀測定各管的吸光度值。按照公式計算:

2.7 斑馬魚ROS的測定

實(shí)驗(yàn)過程參考Kim E A 等[12]所報道的方法并加以調(diào)整。簡述為購買處于繁殖期的成年斑馬魚,適應(yīng)性喂養(yǎng)后進(jìn)行親代的繁殖,溫度控制在28.5±1 ℃,并收集斑馬魚胚胎,挑選狀態(tài)良好的胚胎進(jìn)行試驗(yàn)。胚胎(n=8)放入含1 mL胚胎介質(zhì)(充氧過夜的濃度為0.25 mg/mL的海水晶溶液)的24孔板的孔中,分為正常組(NC),模型組(Model),維生素C組(VC),洛神花花青素低劑量組(Anth.L)、中劑量組(Anth.M)、高劑量組(Anth.H)。胚胎受精后的6-7小時,除正常組和模型組外,其他組分別加入相應(yīng)的維生素C或花青素,使維生素C的濃度為2.9 μg/mL,低、中、高劑量組洛神花花青素濃度為2.9 μg/mL、5.8 μg/mL和11.6 μg/mL。孵育到胚胎受精后12 h,所有組都加入12 mM 2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(AAPH)進(jìn)行共處理,直到胚胎受精后24 h。最后,停止使用AAPH誘導(dǎo)胚胎氧化損傷,正常組和模型組放入正常胚胎介質(zhì)中,其余各組則放入含有相應(yīng)組別維生素C或洛神花提取液的介質(zhì)中。2 d后,所有組別全部更換為正常胚胎介質(zhì),并對各組進(jìn)行所有指標(biāo)的測試。

斑馬魚胚胎中的ROS產(chǎn)物參考Bass D A等[13]方法檢測;脂質(zhì)過氧化物參考Okimoto Y[14]的方法測定。細(xì)胞死亡程度參考Kang M C等[15]的方法測定。簡述為在2 dpf時,測ROS用DCFH-DA 溶液(20 μg/mL)處理斑馬魚胚胎, 并于黑暗中孵育1h;測DPPH用DPPP 溶液(25 μg/mL)處理斑馬魚胚胎, 并于黑暗中孵育1 h;測細(xì)胞死亡程度用吖啶橙溶液(AO)(7 μg/mL)處理斑馬魚胚胎, 并于黑暗中孵育30 min。熒光染料孵育后,用新鮮的培養(yǎng)介質(zhì)清洗斑馬魚胚胎數(shù)次,并在觀察前用三卡因(0.2 mg/mL)對其進(jìn)行麻醉。在熒光顯微鏡下拍攝斑馬魚胚胎的熒光圖片,根據(jù)熒光強(qiáng)度相對比值計算抗氧化活性。

2.8 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果與討論

3.1 洛神花花青素提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過單因素的變化,考察超聲功率、超聲時間、提取溫度和提取時間對洛神花花青素得率的影響,結(jié)果如圖1所示。在超聲時間30 min、料液比1∶40、提取溫度20 ℃的條件下,超聲功率對洛神花花青素得率的影響見圖1(a),花青素得率隨著超聲功率呈現(xiàn)出先升高后降低,在300 W時得率達(dá)到最高,為2.14 mg/g;超聲功率在300 W之后,超聲波功率逐漸增大,提取效果反而不斷下降。

(a) 超聲功率對花青素得率的影響

(b) 超聲時間對花青素得率的影響

(c) 提取溫度對花青素得率的影響

(d) 料液比對花青素得率的影響

在提取溫度20 ℃、料液比1∶40、超聲波功率200 W的條件下,超聲提取時間對洛神花花青素得率的影響見圖1(b),超聲時間在30—120 min時,得率隨著超聲時間的增加而不斷升高,120 min之后花青素得率下降明顯,可能由于長時間暴露于超聲波振蕩的環(huán)境中,使提取出的花青素容易分解,分解的速率在120 min分鐘后高于從洛神花中提取的速率。因而超聲時間過長,反而不利于對色素的提取,使花青素得率下降。

超聲時間30 min、料液比1∶40、超聲功率250 W的條件下,提取溫度對洛神花花青素得率的影響見圖1(c),提取溫度對洛神花花青素得率有一定的影響。隨著提取溫度的升高,花青素得率呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢,在30 ℃時花青素得率最大,為1.93 mg/g,溫度繼續(xù)升高,提取率降低,這可能是由于在溫度較高的情況下,洛神花花青素素的結(jié)構(gòu)由于超聲波的剪切作用的增強(qiáng)而被破壞,最終導(dǎo)致花青素提取效果不佳[16]。

在超聲時間30 min、超聲功率250 W、提取溫度20 ℃的條件下,料液比對洛神花花青素得率的影響見圖1D。料液比的不斷增加,得率先增大后減小。料液比在1∶10—1∶40時,洛神花花青素得率與料液比成正比,當(dāng)料液比為1∶40時,達(dá)到最大得率,為2.10 mg/g,在1∶40之后,料液比的大小與花青素得率成反比。

綜上所述,確定最佳的超聲功率為300 W,超聲提取時間為120 min,提取溫度為30 ℃,料液比為1∶40,進(jìn)一步展開正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

3.2 洛神花花青素提取正交優(yōu)化結(jié)果

超聲波輔助提取洛神花花青素正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示,通過正交優(yōu)化后,花青素提取最佳條件為:超聲時間90 min、提取溫度30 ℃、超聲功率300 W、料液比1∶40;花青素得率最高,達(dá)2.94 mg/g,比單因素實(shí)驗(yàn)時最高得率2.14 mg/g提高了37%。四個因素對洛神花花青素得率的影響從大到小依次為超聲功率、超聲時間、提取溫度和料液比,且超聲功率對花青素得率的影響有顯著性差異(P<0.05)。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

3.3 洛神花花青素體外抗氧化活性

由圖2 可知,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),洛神花花青素抗氧化能力和濃度呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系,即隨著花青素濃度的增大,其抗氧化效果也而逐步增強(qiáng)。當(dāng)洛神花花青素濃度達(dá)5.8 mg/mL 時(圖2(a)),對DPPH 自由基清除率達(dá)到 83.15%,但低于 1 mg/mL 的 VC 清除率(87.9 %);當(dāng)洛神花花青素濃度從0.37 mg/mL等倍增加到 5.8 mg/m L時,對羥自由基清除率從32.5 % 增加到74.4 %(圖2(b)),但也低于 1 mg/mL 的 VC 清除率(78.1 %);洛神花花青素對于 ABTS 自由基的清除能力較弱,當(dāng)花青素濃度達(dá)5.8 mg/m L 時,其ABTS 自由基的清除率為 63.32 %(圖2(c)),遠(yuǎn)低于 1 mg/mL的 VC 抗氧化能力(91.6 %)。總體來說,洛神花花青素具有抗氧化能力,但同濃度的抗氧化能力低于VC。

(a) 洛神花花青素對DPPH自由基的影響

(b) 洛神花花青素對羥自由基的影響

(c) 洛神花花青素對ABTS自由基的影響圖2 洛神花花青素體外抗氧化活性Fig.2 Antioxidant capacity of anthocyanin from Roselle注:與洛神花花青素低濃度0.37 mg/mL 組對比時, *p <0.05, **p <0.01.

3.4 洛神花花青素對斑馬魚胚胎氧化應(yīng)激的影響

AAPH可誘導(dǎo)斑馬魚胚胎產(chǎn)生氧化損傷,生成過量ROS,造成大量細(xì)胞死亡[11],通過檢測斑馬魚體內(nèi)ROS 生成水平、脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生率和細(xì)胞死亡率進(jìn)行評價,結(jié)果如下:

從圖3斑馬魚胚胎的熒光圖可見,正常組熒光強(qiáng)度弱而模型組熒光強(qiáng)度強(qiáng),在誘導(dǎo)劑AAPH 刺激下,ROS在斑馬魚中大量積累,模型組的ROS產(chǎn)物量是正常組的197%,獲得氧化應(yīng)激模型,VC和洛神花花青素的干預(yù)使ROS不同程度地降低。洛神花花青素低劑量組顯著降低ROS(164.8 ± 8.3%、170.1 ± 9.2%)產(chǎn)生,VC組和中、高劑量洛神花花青素組顯著地降低了ROS(121.7 ± 10.4%、153.2 ± 9.1%、128.1±6.8%)的產(chǎn)生。洛神花花青素高劑量組(11.6 μg/ mL)對抑制ROS的產(chǎn)生能力和2.9 μg/mL的VC組接近。

圖3 洛神花花青素對斑馬魚胚胎的ROS清除活性Fig.3 Intracellular ROS scavenging activity of anthocyanin from Roselle in zebrafish embryos注:##p <0.01 vs. NC; *p< 0.05 and ** p<0.01 vs. Model

活細(xì)胞膜中的氫過氧化物的含量與熒光強(qiáng)度相關(guān)[17],通過其熒光強(qiáng)度檢測胚胎活細(xì)胞的過氧化物的產(chǎn)生情況。由圖4可見,脂質(zhì)過氧化物在AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚中大量產(chǎn)生,與正常組相比,模型組的脂質(zhì)過氧化顯著升高,約為正常組的1.87倍,而洛神花花青素低劑量和中劑量組與模型組對比均呈現(xiàn)顯著的降低,降低水平分別為15.7 %和19.3%;VC組和洛神花花青素高劑量組與模型組對比均呈現(xiàn)極顯著降低,降低水平分別為36.7 %和34.5%。洛神花花青素干預(yù)能降低氧化應(yīng)激狀態(tài)的斑馬魚胚胎脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生,并具有劑量依賴性。

圖4 洛神花花青素對斑馬魚胚胎脂質(zhì)過氧化抑制 活性Fig.4 Lipid peroxidation inhibitory activity of anthocyanin from Roselle in zebrafish embryos注:##p <0.01 vs. NC; *p< 0.05 and **p<0.01 vs. Model

通過測試由AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎活體的細(xì)胞死亡情況進(jìn)一步評估了洛神花花青素對氧化損傷的保護(hù)作用,由圖5所示,機(jī)體的持續(xù)性氧化應(yīng)激損傷將導(dǎo)致細(xì)胞死亡,產(chǎn)生較高的熒光強(qiáng)度,模型組細(xì)胞死亡率是正常組的2.1倍,而VC組、洛神花花青素低、中、高劑量組均不同程度地抑制細(xì)胞死亡(117.1 ± 0.9 %、154.4 ± 4.2 %、145.6 ± 4.3 %、121.2 ± 5.8 %),高劑量組(11.6 μg/ mL)的洛神花花青素抵抗細(xì)胞死亡水平與VC組(2.9 μg/ mL)相近。

圖5 洛神花花青素保護(hù)斑馬魚胚胎抵抗細(xì)胞死亡Fig.5 Protective effect of anthocyanin from Roselle against cell death in zebrafish embryos注:##p <0.01 vs. NC; *p< 0.05 and ** p<0.01 vs. Model

4 結(jié) 論

將超聲波輔助應(yīng)用到洛神花花青素的提取中,利用正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得出其最佳提取工藝條件:提取溫度為30 ℃、超聲功率300 W、料液比1∶40(g/mL)、超聲時間90 min,能有效提高洛神花花青素得率,此時得率為2.94 mg/g。體外抗氧化活性表明,5.8 mg/mL洛神花花青素對DPPH 自由基清除率、ABTS 自由基清除率和羥自由基清除率分別為 83.15 %、 63.32 %和74.4 %。通過洛神花花青素對斑馬魚胚胎氧化應(yīng)激的干預(yù),洛神花花青素能夠有效保護(hù)由AAPH誘導(dǎo)的氧化損傷,11.6 μg/ mL劑量組的洛神花花青素極顯著降低ROS的產(chǎn)生,抑制脂質(zhì)過氧化物的生成和降低胚胎細(xì)胞死亡率(P<0.01)。該研究結(jié)果可為進(jìn)一步開發(fā)利用洛神花提供理論依據(jù)。