唐子茜，曾小峰，商桑，周茂林，曾志紅

（重慶市農業(yè)科學院，重慶 401329）

葉酸（folate、folic acid）屬維生素B9，是一類具有相似化學結構的化合物的統(tǒng)稱，由喋啶、p-對氨基苯甲酸與一個或多個L-谷氨酸共軛組成，其生物活性形式為四氫葉酸（tetrahydrogen folic acid，THFA）[1-2]。

葉酸在細胞增殖、促進人體生長發(fā)育及維護人體健康中具有重要作用。體內一碳單位代謝有了葉酸的參與后，才能進一步合成嘌呤、嘧啶等物質，從而保證蛋白質與DNA 的合成[3]。目前大量的臨床醫(yī)學研究表明，攝入足量的葉酸能夠有效預防新生兒神經管畸形、巨幼紅細胞性貧血等疾病[4]。在國務院辦公廳印發(fā)的《國民營養(yǎng)計劃（2017-2030 年）》中也將控制孕婦的葉酸缺乏率列入了重大行動及主要目標。近年來，葉酸也逐漸被證明了能夠預防和改善心血管疾病及神經系統(tǒng)性疾病[5]，而葉酸的缺乏則可能增加細胞癌變的風險，從而引發(fā)結直腸癌、胰腺癌等[6]。大多數(shù)國家的葉酸推薦攝入量為成人300 μg/d、孕婦400 μg/d，美國、歐洲、中國的葉酸推薦攝入量[7-9]見表1。

表1 不同區(qū)域的葉酸推薦攝入量Table 1 Recommended daily folate intake in different areas

由于人體自身不能合成葉酸，因而天然葉酸主要從外界食物中攝取。天然葉酸主要存在于一些豆類和綠色蔬菜中，其中葉酸含量比較高的有豆類食品及深綠葉蔬菜（菠菜）。在奶制品、肉類、雞蛋蛋黃、動物肝臟、部分水果（如柑橘、香蕉）中也含有一定量的葉酸[10]。近年來，高葉酸玉米的品種選育獲得突破，董會等[11]選育出的京科糯928 品種的葉酸含量達到了305.43 μg/100 g。

雖然部分食物中富含葉酸，但由于葉酸理化結構的不穩(wěn)定性，使其容易受到氧氣、光照、高溫及pH 值的影響而分解[12]，因此葉酸在食品加工過程中的損失十分明顯，也導致了人體通過膳食攝取的葉酸量不能充分滿足日常所需。探究葉酸與食品加工的關系及研發(fā)葉酸強化食品，對保障消費者的葉酸攝入水平，改善人群的健康狀況具有重要意義。

本文綜述食品加工工藝對食品中葉酸水平的影響，各類葉酸保護劑及國內外葉酸強化的功能性食品的研究進展，以期為富含葉酸食品的開發(fā)提供參考。

1 葉酸與食品加工工藝

天然葉酸主要存在于食物中，因此探究常規(guī)食品加工工藝（熱燙、蒸汽加熱、微波加熱、低溫儲存、發(fā)酵）對食品中葉酸含量的影響，有利于優(yōu)化餐廚與工業(yè)食品加工技術，對于維持食品中葉酸含量與有效提高人群葉酸攝入量具有重要價值。

1.1 熱燙

熱燙（煮）是一種傳統(tǒng)與常見的食品加工方式，指用100 ℃的沸水加工食品。研究表明，熱燙會導致食物中葉酸明顯流失。這主要是由于葉酸是一種水溶性的維生素，食品中的葉酸與沸水接觸后溶解在水中，并且較高的水溫也會破壞食品中葉酸的穩(wěn)定性。Bureau 等[13]分析了熱燙后4 種冷凍蔬菜中葉酸含量的變化，結果表明，切碎的菠菜熱燙15 min 后，葉酸含量由272 μg/kg減至15 μg/kg，西藍花和花菜熱燙6～7 min 后，葉酸含量由188 、170 μg/kg 分別減至76、77 μg/kg，綠豆熱燙9 min 后，葉酸含量由113 μg/kg 減至83 μg/kg。Stea等[14]分析對比熱燙與真空低溫慢煮對土豆中葉酸含量的影響，結果表明熱燙導致明顯的葉酸流失（約59%～72%），而將土豆以真空低溫慢煮的方式包裝在密封袋中，減少與水的接觸后，其葉酸沒有明顯流失。Maharaj等[15]發(fā)現(xiàn)熱燙與油煎都會影響南非的綠葉蔬菜（如辣木葉、芋頭葉、莧屬植物葉等）及非綠葉蔬菜（秋葵、四季豆）的葉酸水平，熱燙所導致的葉酸損失明顯高于油煎，且在熱燙用水中也發(fā)現(xiàn)了一定量的葉酸。

1.2 蒸汽加熱

蒸汽加熱指用100 ℃左右的蒸汽加熱食品，較高的蒸汽溫度使得食品中的葉酸受熱不穩(wěn)定而部分分解，因此蒸汽加熱會導致食品中的葉酸部分損失。Pan等[16]分析了蒸汽加熱對6 種土豆中葉酸含量的影響，試驗結果表明有2 種土豆在蒸汽加熱后葉酸含量沒有明顯變化，而其余4 種土豆在蒸汽加熱后葉酸含量均有所下降。雖然蒸汽加熱也會導致食品中的葉酸損失，但其所造成的葉酸損失率低于熱燙，這是因為蒸汽加熱減少了食品中葉酸與水的直接接觸，從而使更多的葉酸留在食品中。Delchier 等[17]利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法分析綠豆在熱燙及蒸汽加熱后的葉酸含量變化，試驗表明綠豆中的葉酸在熱燙后的損失率高于蒸汽加熱后的損失率。Bureau 等[13]對比熱燙、蒸汽加熱等對蔬菜中葉酸含量的影響，試驗發(fā)現(xiàn)綠豆中的葉酸損失率在高壓蒸汽加熱及熱燙后分別為10%、26%，菠菜中的葉酸損失率在高壓蒸汽加熱及熱燙后分別為61%、94%。

1.3 微波加熱

微波加熱指利用微波的能量特征（波長短、振動頻率高）對物體進行加熱。隨著工業(yè)化時代的快速發(fā)展，微波加熱作為一種新型的熱加工方式也成為食品加工領域的研究熱點。與蒸汽加熱相似，微波加熱也會導致食品中葉酸的損失，但其所導致的葉酸損失率低于熱燙。Islam 等[18]利用液相色譜串聯(lián)質譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLCMS）分析了熱燙、蒸汽加熱、微波加熱后玉米中的葉酸含量變化，結果表明，將脫皮的玉米棒在2 L 的沸水中煮15 min，其葉酸的損失率為45%，而微波爐加熱5 min后玉米棒中葉酸的損失率為15%，蒸汽加熱后玉米棒中葉酸的損失率為12%，因而建議利用微波加熱和蒸汽加熱對玉米進行加工，有利于減少玉米加工后的葉酸流失。Bureau 等[13]同樣發(fā)現(xiàn)相比于熱燙，13 種冷凍蔬菜在蒸汽加熱及微波加熱后的葉酸損失率更低。

1.4 低溫儲存

低溫儲存指將食品放在低溫的環(huán)境下以減緩其腐敗變質程度并延長保質期。大部分的研究表明，將食品在低溫下儲存有利于穩(wěn)定食品中的葉酸含量。Phillips 等[19]發(fā)現(xiàn)，西藍花、柑橘、草莓、香蕉等蔬菜水果在-60 ℃條件下貯藏12 個月后，其葉酸含量均沒有變化。然而也有部分研究者發(fā)現(xiàn)，在低溫儲存條件下，食品中的葉酸含量仍然有所減少，這可能是因其受到食品前處理技術及儲存條件中的光和氧氣等的影響。Czarnowska 等[20]探究綠豆、黃豆、西藍花、花菜、菠菜等蔬菜在-18 ℃儲存3、6、9、12 個月過程中葉酸含量的變化，結果發(fā)現(xiàn)在試驗期間蔬菜中的葉酸含量都有明顯下降，尤其是黃豆和綠豆在儲存9 個月后，葉酸損失率分別達到了95%、75%。這可能是食品前處理方式（切碎）破壞了蔬菜細胞的結構，從而釋放了能夠氧化和改變葉酸結構的內源酶。Octavia 等[21]發(fā)現(xiàn)，將草莓在4 ℃下儲存6 d 后，其葉酸含量明顯下降，原因可能是環(huán)境中氧氣與光的存在影響了葉酸的穩(wěn)定性。

1.5 發(fā)酵

隨著對微生物探索的逐步深入，研究人員發(fā)現(xiàn)部分微生物自身具備生產葉酸的能力。傳統(tǒng)的加工方式如熱燙、裝罐等，會減少食品中葉酸的含量，而選用能產生葉酸的微生物發(fā)酵食品則能在一定程度上提高食品中葉酸的含量[22]。因而利用產葉酸的微生物對食品進行發(fā)酵加工，成為提高葉酸含量的重要食品加工方式之一。發(fā)酵技術在乳制品、主食類制品等方面應用較為廣泛。食品發(fā)酵在賦予食品新的質構與風味的同時，還可以增加食品中葉酸的含量，增強食品的營養(yǎng)功能。Jiao 等[23]利用能產生葉酸的嗜熱鏈球菌與乳酸菌發(fā)酵牛奶，明顯提高了牛奶中葉酸的含量。Tamene 等[10]利用發(fā)酵技術提高了畫眉草面包中的葉酸含量。Liang 等[24]用小麥粉制作了面包、面條、饅頭等食品，發(fā)現(xiàn)小麥粉經發(fā)酵制成面包和饅頭后，其葉酸含量顯著增加，而小麥粉未經發(fā)酵制成的面條，其葉酸含量有所下降。

對果蔬類食品進行發(fā)酵加工也能提高其中的葉酸含量，同時也豐富了葉酸強化食品的種類，為消費者提供了更多的營養(yǎng)膳食選擇。Mosso 等[25]利用能產生葉酸的乳酸菌對安第斯山土豆、莧菜發(fā)酵，研制出了一款葉酸強化素食產品，該產品在儲存期間，質構沒有發(fā)生明顯變化。Walkey 等[26]選用了19 種釀酒酵母發(fā)酵葡萄，釀造含高葉酸的白葡萄酒和紅葡萄酒。

2 葉酸與保護劑

由于葉酸在食品加工過程中容易受到水、氧氣、光照、溫度等因素的影響而分解，因此探索能穩(wěn)定葉酸結構的保護劑，對于提高食品中葉酸的傳遞效率與穩(wěn)定食品加工過程中的葉酸含量至關重要。目前，主要發(fā)現(xiàn)的葉酸保護劑有抗壞血酸、蛋白質、碳水化合物及其他化學添加劑。

2.1 抗壞血酸

抗壞血酸是機體內新陳代謝中十分重要的還原劑與抗氧化劑，作為一種在食品加工中常見的添加劑，其與葉酸的交互協(xié)同作用也能夠增強葉酸在食品加工過程中的穩(wěn)定性及抗氧化性，從而減緩葉酸的損失，提高加工食品中葉酸的含量[27]。Liu 等[28]在葡萄酒儲存過程中發(fā)現(xiàn)，抗壞血酸的添加能夠減緩葡萄酒中葉酸的氧化分解程度。Indrawati 等[29]對比了添加抗壞血酸（0.5 mg/g）與沒有添加抗壞血酸的胡蘿卜汁、蘆薈汁中葉酸的穩(wěn)定性，試驗結果表明在高壓、高溫的條件下，抗壞血酸的存在能夠增強葉酸的熱穩(wěn)定性及抗壓穩(wěn)定性。Oey 等[30]發(fā)現(xiàn)，當抗壞血酸作為單一抗氧化劑存在于含氧環(huán)境中，其濃度為起始環(huán)境中氧氣含量的2 倍時，能有效抑制葉酸降解。

2.2 蛋白質

部分蛋白質能與葉酸通過化學鍵作用結合，形成穩(wěn)定的非共價復合物，從而可成為葉酸在食品加工中的運載工具與保護劑。Shahraki 等[31]利用紫外可見光譜、3D 熒光光譜與分子對接技術探究了食品中常見的β-乳球蛋白與葉酸的反應機制，發(fā)現(xiàn)β-乳球蛋白可以通過疏水作用和葉酸結合形成穩(wěn)定的復合物。Cen 等[32]發(fā)現(xiàn)，雞蛋卵清蛋白能與葉酸通過分子間親水/疏水作用結合，形成較大且穩(wěn)定的蛋白質顆粒。Ochnio 等[33]利用大豆粉制備的球蛋白能與葉酸結合，從而形成穩(wěn)定的納米級復合物，且該復合物也能夠增強干酪乳桿菌BL23 的生物活性，在葉酸強化食品研制工藝中具有較強的應用潛力。

2.3 多糖

糖類物質作為食品中的主要成分，在加工過程中會與葉酸發(fā)生一系列理化反應，影響葉酸的結構與穩(wěn)定性。相比于部分單糖（葡萄糖、果糖等）與食品中的葉酸發(fā)生化學反應從而破壞葉酸結構[34-35]，部分多糖對維護葉酸的結構與穩(wěn)定性則具有積極作用，其能夠與葉酸通過化學鍵的相互作用結合，形成穩(wěn)定的生物大分子。因此，這類多糖在食品加工中可作為運輸葉酸的有效載體，以提高葉酸的傳遞效率。Fathima 等[36]以殼聚糖為主要原料制備了能夠運載葉酸的殼聚糖納米顆粒，增強葉酸穩(wěn)定性的同時，提高了細胞對葉酸的吸收與代謝效率。Acevedo-Fani 等[37]利用海藻酸與殼聚糖研發(fā)了含葉酸的可食用親水性納米材料，能顯著提高葉酸的對光穩(wěn)定性，并有效調控葉酸的釋放速率。Ali Ganie 等[38]發(fā)現(xiàn)，菊粉（植物中的儲備性多糖）能與葉酸共價結合，使葉酸在不同的pH 值環(huán)境中更加穩(wěn)定，并且該復合物在胃腸道試驗中也能有效釋放葉酸。

2.4 其他化合物

部分學者研究了其他化合物對葉酸的保護作用。Rozoy 等[39]探究了在pH5.5 的緩沖劑中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯與兒茶素對葉酸穩(wěn)定性的影響，結果表明，在常溫大氣中儲存12 h 后，含有兒茶酸提取物的緩沖劑中的葉酸含量為90%，不含兒茶酸提取物的緩沖劑中葉酸含量為74%。Patring 等[40]通過模擬食物環(huán)境，探究了4 種抗氧化劑（2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、2，3-二巰基-1-丙醇、2-硫代巴比妥酸） 在樣品加熱、長時間貯藏、冷凍與解凍循環(huán)過程中葉酸的穩(wěn)定性，結果表明2，3-二巰基-1-丙醇穩(wěn)定葉酸的效果最佳。Puthusseri 等[41]發(fā)現(xiàn)，在擬南芥葉的生產過程中，水楊酸的添加能夠有效提高其中的葉酸含量，其原因可能是水楊酸誘導了擬南芥葉中與葉酸代謝有關基因的進一步表達。

在食品加工、包裝及儲存過程中，光照對葉酸含量的影響也不容忽視，因此在光照條件下能有效維持葉酸穩(wěn)定性的保護劑也被逐步探索。Wusigale 等[42]研究表明，羥基肉桂酸（咖啡酸、阿魏酸、對香豆酸）、黃酮類（槲皮苷、表沒食子兒茶素沒食子酸酯）、姜黃素、白藜蘆醇、對苯醌都能增強葉酸的對光穩(wěn)定性，其中效果最好的是咖啡酸，且酚類物質比烯烴雙鍵類化合物更能高效地維護葉酸的穩(wěn)定性。Mohammed 等[43]從天然孢子中提取出了有機化合物—孢粉素（Lycopodium clavatum sporopollenin），能減緩葉酸在紫外線和陽光下的降解程度。Wang 等[44]發(fā)現(xiàn)，單寧酸具有自由基清除的作用，從而提高葉酸的對光穩(wěn)定性。

3 國內外葉酸強化功能性食品的研究進展

隨著各行業(yè)的交叉融合發(fā)展，食品加工工藝手段也逐漸豐富。目前，國內外葉酸強化食品的研發(fā)焦點主要為利用基因工程技術對含葉酸的植物細胞以及產葉酸的微生物細胞進行基因修飾，從而使細胞代謝產生更多的葉酸；組合不同種類能產生葉酸的微生物，充分利用其生物活性發(fā)酵出富含葉酸的產品；利用微膠囊包埋技術將人工合成的葉酸包埋后添加在食品中，提高葉酸在加工過程中的穩(wěn)定性；利用輻照、超聲波及其他技術研制葉酸強化食品。

3.1 基因工程

通過基因工程對細胞內與葉酸合成相關的代謝基因進行修飾是研制葉酸強化食品的重要工藝，并且具有較高的經濟成本效益[45]。De Lepeleire 等[46]通過在馬鈴薯塊莖細胞的線粒體中導入了控制葉酸合成的下游基因HPPK/DHPS 和FPGS，從而研制出了葉酸含量為普通馬鈴薯塊莖12 倍的葉酸強化型馬鈴薯塊莖。Liu 等[28]利用生物工程技術使釀酒酵母中的FOL2 基因超表達，從而研制出了含高葉酸的葡萄酒（葉酸含量為248 μg/L）。Storozhenko 等[47]使野生大米細胞中合成葉酸的基因超表達，將野生大米中的葉酸含量提高了100 倍（葉酸含量為38.3 nmol/g），從而實現(xiàn)食用100 g 精米就能達到成人每日所需葉酸攝入量的4 倍。Puthusseri 等[41]發(fā)現(xiàn)使擬南芥菜中調控葉酸合成蛋白的基因超表達，可以提高葉酸的含量及葉酸在儲存期間的穩(wěn)定性。

3.2 組合微生物發(fā)酵

相比于傳統(tǒng)的利用單一菌株對食品發(fā)酵，組合不同的產葉酸的發(fā)酵菌株對食品進行發(fā)酵更能有效提高發(fā)酵食品中的葉酸含量。Zahed 等[48]利用乳酸菌及組合了乳酸菌與丙酸菌（Propionibacterium freudenreichii）兩種菌株分別發(fā)酵制作了兩款酸奶，對比發(fā)現(xiàn)利用兩種菌株共同發(fā)酵而成的酸奶含有更多的葉酸，且將酸奶中的葉酸含量提高了49%。Chandrasekar 等[49]使用乳酸乳球菌N8 和布拉迪酵母菌SAA655 組合發(fā)酵，得到一種蒸米蛋糕，研究表明，相較傳統(tǒng)的制作蒸米蛋糕的方式（約50 %的葉酸損失），利用這兩種菌株組合發(fā)酵蒸米蛋糕會提高其中的葉酸含量。Bationo 等[50]組合2 種特定菌株（植物乳酸桿菌6.2 與發(fā)酵乳酸桿菌MW2 或MW8.2）發(fā)酵，可將燕麥粥中葉酸含量提高約3.0 μg/100 g（鮮樣）。Albuquerque 等[51]組合了乳酸桿菌與嗜熱鏈球菌ST-M6 或TH-4 以發(fā)酵豆乳，顯著提高了豆乳中的葉酸含量，并發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中添加百香果副產品或者低聚果糖，有利于菌株的生長并產生更多的葉酸。

3.3 微膠囊包埋技術

目前，已有在主食類食品（如玉米面粉的相關制品）制作過程中直接添加人工合成的葉酸，從而研制一系列葉酸強化的谷物類食品的相關工藝[52]，但此類葉酸強化食品在加工及烹飪過程中，其葉酸損失率也較為明顯[53]。因而，越來越多的研究者利用微膠囊包埋技術將葉酸包埋在特定的材料后再添加到食品中，可以有效提高葉酸在食品加工過程中的穩(wěn)定性。

微膠囊包埋技術是指通過特定的載體（屏壁）將目標成分包住，以提高食品中生物活性分子的穩(wěn)定性[54]。Shrestha 等[55]探究了微膠囊包埋后的葉酸在餅干烘焙過程中的穩(wěn)定性，結果表明，餅干在180 ℃下烘焙5 min后，通過噴霧干燥技術用果膠與海藻鹽（質量比為80∶20） 包埋的人工合成的葉酸與沒有包埋的葉酸相比，在加工過程中表現(xiàn)出了更強的穩(wěn)定性。KamaliRousta等[53]發(fā)現(xiàn)，包埋在脫脂牛奶粉中的葉酸在食品加工過程中的穩(wěn)定性更高，并且利用脫脂牛奶粉與抗壞血酸鈉同時包埋葉酸，對維護葉酸在食品加工過程中的穩(wěn)定性也具有積極影響。Liu 等[56]在面粉中分別添加了包埋后的葉酸（添加量為4.5 mg/kg）與沒有包埋后的葉酸（添加量為4.0 mg/kg）制作成兩種面條，試驗結果表明，在面條的制作及烹飪（煮、炒）過程中，微膠囊包埋中的葉酸表現(xiàn)出了更強的穩(wěn)定性。

3.4 其他葉酸強化食品技術

部分研究者利用物理前處理技術，有效提高了食品在加工、貯藏后的葉酸含量。Pinela 等[57]在對西洋菜進行輻照處理后，發(fā)現(xiàn)相比于沒有輻照過的西洋菜，被1、2、5 kGy 輻照過的西洋菜在4 ℃下貯藏7 d 后，其中的葉酸含量更高；然而，采用同樣的輻照方式處理一類法國酢漿草屬類植物后卻沒有得到相似的結果，這可能是因為輻照處理對食品中葉酸的保護作用受到輻照劑量及食物自身質構的交互影響。Tiozon 等[58]利用超聲波處理糙米與精米后，將其在含有0.01%～0.1%的葉酸溶液中浸泡，其中的葉酸含量分別提高了1 982倍與4 054 倍；在隨后的水洗及烹飪試驗中發(fā)現(xiàn)，經過超聲波處理浸泡后的富含葉酸的糙米的葉酸保留率也較高，約為93.53%。

Gu 等[59]在母雞的飼料中添加葉酸，生產出葉酸含量高于空白對照組2 倍的雞蛋，并發(fā)現(xiàn)該方法對雞蛋的品質（如質量、蛋黃比例等）沒有明顯影響。López-Nicolás 等[60]在精白面包和全谷物面包的發(fā)酵制作過程中添加了甜菜（20 g/100 g）或菠菜（40 g/100 g）后，將其中的葉酸含量分別提高了約2～3 倍，這可能是因為甜菜、菠菜等蔬菜本身含有葉酸及其他類維生素物質等。且相應的市場調查顯示，含有蔬菜的葉酸強化面包也較受消費者喜愛。

4 結語與展望

葉酸作為在人體生長發(fā)育中必不可少的營養(yǎng)素之一，足量的葉酸攝入對維持人體健康至關重要。提高葉酸在食品加工中的穩(wěn)定性及研發(fā)更多富含葉酸的食品，在滿足人們營養(yǎng)需求的同時，也具有廣闊的研究前景和市場空間。但目前能夠穩(wěn)定或者提高葉酸在食品加工后含量的相關食品加工工藝較為單一，且葉酸強化營養(yǎng)食品種類較少。因此，可借助現(xiàn)代基因工程、代謝組學技術修飾植物類與微生物類細胞基因，從而提高食品中的葉酸含量。食品發(fā)酵行業(yè)可因地制宜地利用我國現(xiàn)有食品資源，結合我國居民的飲食消費習慣，利用發(fā)酵技術研制出種類豐富的葉酸強化發(fā)酵食品。除此以外，可探索研發(fā)更多且能夠在食品級別中應用的葉酸保護劑，綜合利用物理、化學等加工工藝，結合多種食品成分，研發(fā)出更多葉酸強化食品，以滿足人群日益增長的健康需求，豐富膳食選擇。