皂莢棘刺提取物總黃酮提取測定、除螨活性及抗氧化活性研究

束成杰，李卓航，陳殿松，馬鈴，周欣雨，趙婧，王淼，馬世宏*

（1.中華全國供銷合作總社南京野生植物綜合利用研究所，江蘇 南京 211111；2.廣州德谷個人護理用品有限公司，廣東 廣州 510800；3.南京師范大學泰州學院，江蘇 泰州 225300）

棘刺為豆科植物皂莢（Gleditsia sinensisLam.）的干燥棘刺，又名皂針、天丁、皂角針等等，在我國東北、華北、華東、華南、四川以及貴州等地均有分布，全年可采收，是一種寶貴的中藥材［1-2］。其主要成分有黃酮苷、酚類和氨基酸等［3］?！侗静菥V目》記載：“皂莢刺治風殺蟲，功與莢同，但其銳利直達病所為異耳”［4］。研究表明，棘刺具有消腫、抗炎、抑菌、殺菌的功效，并對多種癌癥細胞具有一定的抑制作用［5-8］。但目前國內(nèi)外對于棘刺提取物的研究整體較少，且對藥理活性的探究多數(shù)集中在抗炎和抗癌方向。

本研究從除螨和抗氧化的角度出發(fā)，對棘刺的藥理活性進行了探究，為未來的綜合開發(fā)利用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

皂莢棘刺（南京野生植物綜合利用研究院）；蘆丁對照品（上海源葉生物科技有限公司）；粉塵螨（皖南醫(yī)學院寄生蟲教研室提供）；甲醇、乙腈、磷酸為色譜純（美國Fisher Scientific公司）；乙醇為分析純（南京化學試劑有限公司）。

NH-4數(shù)顯的恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市三壇儀器廠）；SHZ-DⅢ 循環(huán)式真空泵（鞏義市予華儀器責任有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生工儀器廠）；KF-1209型號的電子天平（中國凱豐集團有限公司）；BCD-183A型號冰箱（合肥榮事達有限公司）；高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；FA2004HM式分析天平（萬泰儀器有限公司）；TG1650-WS臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；DS-1組織粉碎機（北京華欣科創(chuàng)科技有限公司）；HCB-1300V垂直層流潔凈工作臺（青島海爾特種電器有限公司）；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；OlympusBX41奧林巴斯顯微鏡（南京艾朗儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 棘刺提取物的制備

精確稱取10.0 g皂莢棘刺，粉碎后過80目篩，加入120 mL的75%乙醇，放入72℃的水浴鍋，回流提取三次，每次90 min，將3次回流提取液合并，將合并后的提取液經(jīng)離心機離心后減壓抽濾，最后將其放至室溫條件下靜置，所得產(chǎn)物通過減壓蒸餾除去乙醇溶劑，補充純水定容至120 mL，得到皂莢棘刺提取物。

1.2.2 棘刺提取物的黃酮含量測定

色譜條件：流動相為乙腈∶0.25% 磷酸 = 50 ∶50，流速1.0 mL/min，檢測波長為360 nm［1］。

繪制標準曲線：準確稱取蘆丁標準品10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得金絲桃苷及蘆丁標準品溶液，稀釋成濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的溶液，精密吸取20 μL標準液進樣，得線性關(guān)系良好的回歸方程。

樣品配置：將棘刺提取物溶液再次過濾，精密吸取20 μL進樣。代入標準曲線公式，計算溶液中的蘆丁含量［2］。

1.2.3 棘刺提取物的除螨活性

取6個培養(yǎng)皿，其中3個培養(yǎng)皿中分別加入1 mL的皂莢棘刺提取物，另3個培養(yǎng)皿，加入1 mL純水作為陰性對照，每個培養(yǎng)皿內(nèi)壁上緣均勻涂抹白油凡士林混合物；每個培養(yǎng)皿中心放入200只塵螨，30 min后在培養(yǎng)皿中放入螨蟲飼料0.05 g，之后將培養(yǎng)皿置于隔水式培養(yǎng)箱內(nèi)，開始計時；48 h后，用體式顯微鏡觀察并對死亡螨蟲計數(shù)。分別按照式（1）和（2）計算自然死亡率和滅螨率［3-4］。

1.2.4 棘刺提取物的抗氧化能力測定

DPPH自由基清除能力測定［5-6］：稱取DPPH粉末4 mg，用無水乙醇定容到100 mL，得到0.1 mM DPPH自由基工作液。配制濃度10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL的棘刺提取物溶液，同濃度的抗壞血酸做對照。吸取100 μL待測溶液，加入100 μL DPPH自由基工作液，混勻，在30 ℃下暗室反應(yīng)30 min，測定在517 nm下的吸光度。按式（3）計算DPPH自由基清除率。

式中：Ai為待測溶液+DPPH溶液的吸光度；Aj為待測溶液+蒸餾水的吸光度；A0為蒸餾水+DPPH溶液的吸光度。

超氧陰離子清除能力測定［7］：先取0.45 mL pH = 8.2的10 mM的Tris-HCl溶液置于25 ℃水浴中溫育20 min。再分別加入0.1 mL的待測液和0.04 mL 3mM 鄰苯三酚溶液，混勻后25 ℃水浴中反應(yīng)5 min，加入0.1 mL 的10 mM HCl溶液終止反應(yīng)，搖勻后放置3 min，在波長325 nm下測定吸光值。以上各濃度樣品均做三組平行實驗。按照式（4）計算超氧陰離子清除率。

式中：Ai為待測溶液在反應(yīng)體系中的吸光度；Aj為反應(yīng)體系中含有待測溶液，以0.04 mL蒸餾水代替鄰苯三酚溶液加入體系中的吸光度；A0為蒸餾水代替待測溶液在反應(yīng)體系中的吸光度。

還原能力測定［8-9］：在1 mL待測溶液中加入0.2 mL pH = 6.6的磷酸鹽緩沖液，再加入1 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻，50 ℃靜置20 min，加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，3000 r/min 離心10 min，取2 mL上清液加入0.35 mL 0.1 %三氯化鐵溶液和1 mL蒸餾水。于700 nm 處測定樣品的吸光度值。吸光度值越高，表明其還原能力越強。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為平均值±平均標準誤差（S.E.M）。數(shù)據(jù)分析使用SPSS 12.0軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 棘刺提取物總黃酮含量測定

2.1.1 標準曲線

計算得知，蘆丁的峰面積與其質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系，并且經(jīng)過數(shù)據(jù)的歸納和分析，得到回歸方程為y= 27.011x- 10.74，r = 0.9936（y為峰面積，x為質(zhì)量濃度，r為相關(guān)因數(shù)）。由該結(jié)果可知，當蘆丁的進樣濃度控制在0.01 ～ 0.1 mg/mL的范圍時，其呈現(xiàn)的線性關(guān)系良好。

2.1.2 檢測結(jié)果

如表1，三次檢測結(jié)果中棘刺提取物的峰面積分別為992.93、1018.40、1031.77，帶入2.1.1所得的標準曲線中可得蘆丁含量分別為37.16、38.10和38.60 μg/mL，結(jié)合1.2.1中提取實際所用棘刺質(zhì)量以及提取料液比，可知棘刺提取物中總黃酮的提取率為0.136%，RSD值為2.24%。

2.2 棘刺提取物除螨活性

如表2，在相同環(huán)境條件下分別培養(yǎng)試驗組螨蟲和對照組螨蟲，計時48 h。由對照組可知，培養(yǎng)48 h后，空白對照組存活螨蟲數(shù)分別為181只、178只和185只，平均存活螨蟲數(shù)為181.0只，即正常調(diào)節(jié)下48 h螨蟲的自然死亡率平均值為13.8%。試驗組給藥培養(yǎng)48 h后分別存活數(shù)為25只、26只和32只，平均存活螨蟲數(shù)為27.7只，可發(fā)現(xiàn)皂莢棘刺提取物給藥48 h后的平均滅螨率為91%，與未給藥組相比表現(xiàn)出極顯著性差異（P＜ 0.01）。由上可知，棘刺提取物可顯著提高對螨蟲的殺滅率，具有作為一種滅螨劑開發(fā)的巨大潛力。

表2 棘刺提取物除螨實驗檢測結(jié)果Tab.2 Results of mite removal experiment of of the extract of Gleditsia Sinensis thron

2.3 皂莢棘刺的抗氧化活性

2.3.1 棘刺提取物對DPPH自由基清除率的影響

由圖1可知，Vc作為對照，它的清除能力最強。Vc濃度為1% ～ 10%時，清除率基本維持在90%以上。棘刺提取物的清除能力隨濃度的升高而升高，在濃度為0.625% ～ 10%時，棘刺提取物隨著濃度的增加不斷增大，對DPPH自由基的清除能力從18.40%增長至91.60%，具有明顯的濃度梯度效應(yīng)。當棘刺提取物濃度為10%時，清除能力為91.60%，與Vc的清除能力相當。

圖1 棘刺提取物對DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of the extract of Gleditsia Sinensis thron on DPPH free radical scavenging rate

2.3.2 棘刺提取物對超氧陰離子自由基清除率的影響

由圖2可知，Vc的超氧陰離子自由基的清除能力最強，清除能力高達95%以上。棘刺提取物的超氧陰離子自由基清除率隨濃度的升高而增強，具有濃度梯度效應(yīng)。濃度范圍在0.625% ～ 10%時，棘刺提取物的超氧陰離子清除率從29.19%增至90.32%；當濃度到達2.5%值時，隨著濃度的不斷增加，棘刺提取物的清除率增加趨向逐漸放緩。

圖2 棘刺提取物對超氧陰離子自由基清除率的影響Fig.2 Effect of the extract of Gleditsia Sinensis thron on the scavenging rate of superoxide anion radical

2.3.3 棘刺提取物對還原力的影響

由圖3可知，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，棘刺提取物和Vc溶液濃度越大，還原力越強，還原力與濃度呈明顯的正相關(guān)，隨濃度的升高迅速增強。Vc的還原能力最強，還原力基本維持在2.3以上。在濃度范圍為0 ～ 10%時，棘刺提取物的還原能力從1.20增至3.63。

圖3 棘刺提取物對還原力的影響Fig.3 Effect of the extract of Gleditsia Sinensis thron on reducing power

3 討論與結(jié)論

皂莢棘刺作為我國一種傳統(tǒng)的中藥材，具有價格低廉，來源廣泛，功效突出以及少有毒副作用的特征，在中醫(yī)抗癌治療中是最常用的一種配伍藥，是少有的具有良好功效的抗癌中藥材。目前隨著各類分析檢測儀器的逐漸普及與發(fā)展，對皂莢棘刺中的化學成分的探究也日漸增多，已明確其主要含有黃酮、酚類、氨基酸和三萜類等化合物［18-20］。近年間對皂莢棘刺的研究主要集中在抗炎與抗癌方向［21-23］，在臨床應(yīng)用中多以傳統(tǒng)中藥形式加以應(yīng)用，例如以皂莢棘刺辯證配伍少許藥材治療坐骨神經(jīng)痛，或皂針顆粒治療慢性闌尾炎，或澤桂癃爽膠囊治療前列腺增生等［24-26］。在天然日化領(lǐng)域尚無應(yīng)用背景，對除螨及抗氧化也未有應(yīng)用實例。

本研究以皂莢棘刺為研究對象，選用75%的乙醇進行提取，以蘆丁作為提取物提取率的評價標準，所得的皂莢棘刺提取物中蘆丁的含量為0.136%。本文首次對所得的皂莢棘刺提取物的除螨活性進行了探究，利用粉塵螨這類生活中最常見的螨蟲進行給藥，確定了皂莢棘刺提取物具有良好的除螨活性，在未來螨蟲滅殺領(lǐng)域具有一定的開發(fā)利用潛力。此外，本研究對所得的皂莢棘刺提取物的抗氧化活性進行了探究，確定皂莢棘刺提取物具有良好的抗氧化效果，目前已有研究結(jié)果測定了皂莢棘刺提取物對Fe3+的清除能力［27］，本文加以對DPPH自由基以及超氧陰離子自由基清除實驗，相互印證確定了皂莢棘刺具有良好的抗氧化功效，在較高濃度時具有接近Vc的抗氧化效果，補充與完善了皂莢棘刺在除螨以及抗氧化功效方向的空白，為后續(xù)的研究提供理論基礎(chǔ)，為合理有效利用皂莢棘刺資源提供思路。