南天竹和火焰南天竹葉色表型與色素含量變化研究

蔡鴻宇，劉國華，邱國金，郭聰聰，高宇，顧恒，王良桂*

（1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400；2.南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江蘇 南京 210037；3.國有金湖縣林場，江蘇 淮安 211616）

南天竹（Nandina domesticaThunb.）為小檗科南天竹屬常綠灌木，原產(chǎn)于中國，是一種集觀賞、藥用、生態(tài)等多種價(jià)值于一身的樹種［1-2］。其根、莖、葉、果均可入藥，具有清熱除濕、通經(jīng)活絡(luò)等功效［3］。南天竹植株優(yōu)美，果實(shí)鮮艷，尤其是其葉片，幼葉及秋冬呈鮮紅色，并且對環(huán)境有著很強(qiáng)的適應(yīng)性。經(jīng)過多年的栽培馴化，已經(jīng)形成許多栽培品種，其中最常見的是火焰南天竹。火焰南天竹（N.domestica‘Firepower’）屬于園藝新品種，其葉片橢圓且長［4］。在江蘇地區(qū)4月中旬開始萌芽，新葉嫩紅，氣溫30℃以上逐漸轉(zhuǎn)綠。在12月份溫度下降到5℃以下，并且晝夜溫差在10℃以上，其葉片開始變紅。目前，南天竹和火焰南天竹已廣泛應(yīng)用于園林綠化中。

近年來，相關(guān)學(xué)者對南天竹屬的不同品種進(jìn)行了大量研究，主要集中在播種育苗、扦插繁殖、組培快繁等方面［5］。王生等［6］在南天竹種子催芽方式的研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過低溫沙藏處理后的種子，其發(fā)芽率最高，可達(dá)83%，且種子萌發(fā)快而整齊。任雪玲［7］對美國‘白果’南天竹多年生硬枝及當(dāng)年生嫩枝進(jìn)行了扦插試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)嫩枝扦插生根率高于硬枝扦插，且接穗蘸一定濃度的ABT生根粉生根率更佳。付歡歡等［8］研究了不同培養(yǎng)基和植物激素組合對火焰南天竹再生能力影響，以及不同蔗糖濃度配比和不同生長素濃度對火焰南天竹生根的影響。截至目前，還未見有關(guān)于南天竹葉色變化相關(guān)的研究。

植物葉色變化是一個(gè)十分復(fù)雜的過程。對多種彩葉植物進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，植物葉片顏色的變化是由其體內(nèi)色素的種類和含量引起的［9］。葉綠素、類胡蘿卜素、花青素這三種色素是導(dǎo)致葉色變化的主要色素［10］。當(dāng)葉片中三類色素的含量發(fā)生顯著變化時(shí)，各色素的比例也會隨之改變，進(jìn)而決定葉片的顏色［11-12］?；谇捌趯δ咸熘窈突鹧婺咸熘裎锖蛴^測的結(jié)果，本研究通過對一年內(nèi)每個(gè)月的葉片進(jìn)行采集進(jìn)行葉色表型和相關(guān)色素（葉綠素、類胡蘿卜素和花青素）含量的測定，分析了葉色變化的原因，為南天竹和火焰南天竹葉色變異機(jī)理提供了參考，也為今后南天竹和火焰南天竹葉色的遺傳改良研究提供了方向。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為生長在江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院彩葉苗木良種科研基地內(nèi)（32°01′N， 119°24′E）的2年生的南天竹和火焰南天竹。2018年5月至2019年4月期間，分別于每月15日上午10點(diǎn)采集生長良好的嫩葉，每次取樣部位一致。用純水將附著在葉片上的灰塵清洗干凈，去掉中脈，裝入無菌無酶的離心管內(nèi)，立即放入液氮中速凍10 min，隨后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱內(nèi)保存。

1.2 相關(guān)指標(biāo)測定

1.2.1 葉色測定

分別對不同時(shí)期的葉片使用英國皇家園藝學(xué)會比色卡和分光測色儀測定葉色變化［13-14］。使用分光測色儀時(shí)，將葉片外部遠(yuǎn)離中脈的部分對上通光孔，通過儀器測定數(shù)據(jù)并記錄。

1.2.2 葉綠素、類胡蘿卜素以及花青素含量的測定

色素含量采用張和陳的方法進(jìn)行測定［15-16］。用95%的乙醇對研磨好的葉片進(jìn)行浸泡，浸泡時(shí)間為24 h，黑暗中進(jìn)行，使用分光光度計(jì)在470 mm、649 mm和665 nm波長下定量，進(jìn)行葉綠素和類胡蘿卜素的測定。而花青素采用試劑盒進(jìn)行測定（植物花青素試劑盒，南京建成生物工程研究所有限公司）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

葉色測定及相關(guān)色素含量測定均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。使用Microsoft Excel 2010進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)。使用IBM SPSS Statistics 26進(jìn)行方差分析。

2 方法結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)期葉色表型變化

使用比色卡分別測定了南天竹和火焰南天竹的葉色。由表1可知，不同月份的南天竹和火焰南天竹葉片呈現(xiàn)不同的葉色。其中，南天竹在3～9月均呈現(xiàn)綠色，在10月至翌年2月則呈現(xiàn)不同深度的紅色，尤其是11月至翌年1月的顏色最鮮艷。而火焰南天竹1年內(nèi)幾乎保持在黃綠色，在11月至翌年2月葉色發(fā)生變化，葉色變紅且色澤比南天竹更加明麗。

表1 比色卡測定南天竹和火焰南天竹葉色表型變化Tab. 1 The change of leaf color of N.domestica Thunb. and N.domestica ‘Firepower’ was determined by colorimetric card

使用分光測色儀分別測定了南天竹和火焰南天竹的葉色。由表2可知，南天竹和火焰南天竹葉片在不同月份表現(xiàn)出不同的葉色。其中，南天竹在3～9月葉片亮度幾乎保持一致，10月至翌年2月亮度下降，同期葉色變紅。根據(jù)比色卡測試的結(jié)果（表1）與分光測色儀測定的結(jié)果（表2），南天竹與火焰南天竹的葉色變化期基本上保持一致，但南天竹的葉色變化更加豐富，火焰南天竹的葉色變化更鮮艷。

表2 分光測色儀測定南天竹和火焰南天竹葉色表型變化Tab.2 The change of leaf color phenotype of N.domestica Thunb. and N.domestica ‘Firepower’ were determined by spectrophotometer

2.2 不同時(shí)期葉片色素含量變化

2.2.1 葉綠素含量變化

由表3和圖1可知，6月份南天竹葉片中葉綠素含量最高，達(dá)到5.5229 mg/g，12月份的南天竹葉片中葉綠素含量最低，為2.0849 mg/g。而火焰南天竹葉片中葉綠素含量在3月份最高，為3.4159 mg/g，2月份含量最低，為0.8237 mg/g。同時(shí)，南天竹和火焰南天竹在5月至翌年3月葉片中葉綠素的含量變化呈現(xiàn)相同的趨勢。此外，在3～5月期間，南天竹葉片呈現(xiàn)一直上升的趨勢，而火焰南天竹則是先下降再上升。

圖1 南天竹和火焰南天竹葉片葉綠素含量Fig. 1 Content of chlorophyll in leaves of N.domestica Thunb. and N.domestica ‘Firepower’

2.2.2 類胡蘿卜素含量變化

由表4和圖2可知，1月份南天竹葉片中類胡蘿卜素含量最高，達(dá)到1.7772 mg/g，5月份的南天竹葉片中類胡蘿卜素含量最低，為0.982 mg/g。而火焰南天竹葉片中類胡蘿卜素含量在3月份最高，為1.4074 mg/g，7月份含量最低，為0.5591 mg/g。同時(shí)，南天竹和火焰南天竹葉片在三個(gè)時(shí)間段內(nèi)類胡蘿卜素的含量變化呈現(xiàn)相同的變化趨勢，分別為5～11月、1～2月以及3～4月。此外，在另外三個(gè)時(shí)間段則表現(xiàn)出不同的變化趨勢，2～3月和3～5月，南天竹葉片類胡蘿卜素含量呈向下降的趨勢，而火焰南天竹則呈現(xiàn)上升的趨勢；2～3月則正好相反，南天竹葉片類胡蘿卜素含量呈向上升的趨勢，而火焰南天竹則呈現(xiàn)下降的趨勢。

表4 不同時(shí)期南天竹和火焰南天竹葉片類胡蘿卜素含量Tab. 4 Contents of carotenoids in leaves of N.domestica Thunb. and N.domestica ‘Firepower’ at different periods

2.2.3 花青素含量變化

由表5和圖3可知，11月份南天竹葉片中花青素含量最高，達(dá)到1.1870 mg/g，5月份的南天竹葉片中花青素含量最低，為0.1570 mg/g。而火焰南天竹葉片中花青素含量在2月份最高，為1.6103 mg/g，4月份含量最低，為0.1100 mg/g。同時(shí)，南天竹和火焰南天竹在8月至翌年4月葉片中花青素的含量變化呈現(xiàn)相同的趨勢。此外，在4～8月期間，南天竹葉片呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而火焰南天竹葉片中花青素含量變化不大且差異不顯著。

圖3 南天竹和火焰南天竹葉片花青素含量Fig. 3 Anthocyanin content in leaves of N.domestica Thunb.and N.domestica ‘Firepower’

表5 不同時(shí)期南天竹和火焰南天竹葉片花青素含量Tab. 5 Anthocyanin content in leaves of N.domestica Thunb.and N.domestica ‘Firepower’ in different periods

3 討論與結(jié)論

彩葉植物廣泛存在于自然界中，具有獨(dú)特的觀賞價(jià)值，可以提高城市綠化的觀賞性［17-18］。對于南天竹和火焰南天竹而言，葉片顏色是其最重要的觀賞性狀。根據(jù)觀察可知，南天竹葉片在10月-翌年2月表現(xiàn)出不同程度的紅色，其余時(shí)間則呈現(xiàn)綠色。而火焰南天竹葉片大部分時(shí)間保持在黃綠色，只是在11月-翌年2月葉色發(fā)生變化，但其葉色變紅且色澤比南天竹更加明麗。

影響植物葉片顏色變化的色素主要包括葉綠素、類胡蘿卜素和花青素［19-20］。葉綠素產(chǎn)生于植物的葉綠體中，是葉片重要的光合色素［21］。植物葉片呈現(xiàn)綠色，主要是由于葉綠素含量高，與葉綠素的合成和降解有關(guān)。本研究中，南天竹和火焰南天竹在5月至翌年3月葉片中葉綠素的含量變化呈現(xiàn)相同的趨勢，且6月南天竹葉片中葉綠素含量最高，火焰南天竹葉片中葉綠素含量在 3月最高，和葉色表型變化的數(shù)據(jù)相符。徐展宏等［22］對不同葉色的青錢柳［Cyclocarya paliurus（Batal.） Il jinsk.］色素研究中發(fā)現(xiàn)，綠葉的葉綠素含量要顯著高于紅葉，我們的結(jié)果與之相符。

類胡蘿卜素是一類重要的脂溶性色素，廣泛存在于植物中。作為次生代謝物，類胡蘿卜素賦予了植物花、葉及果實(shí)鮮艷的色彩［23］。本研究中，南天竹和火焰南天竹葉片類胡蘿卜素含量在一年中的變化不大。其中1月南天竹葉片中類胡蘿卜素含量最高，5月的南天竹葉片中類胡蘿卜素含量最低。而火焰南天竹葉片中類胡蘿卜素含量在 3月最高，7月含量最低。值得注意的是，在2～4月之間，南天竹葉片中類胡蘿卜素的含量呈現(xiàn)下降趨勢，而火焰南天竹則是先上升后下降，而且3～4月急劇下降，可能的原因是類胡蘿卜素含量的下降，對火焰南天竹維持葉綠體功能以及葉綠素水平發(fā)揮了反向調(diào)控作用，間接促使葉片變綠，這與紫葉茶（Camellia sinensisL.）中的研究結(jié)果相似［24］。

花青素是植物中常見的一種水溶性色素，具有廣泛的功能。由于存在于植物的葉、花及果實(shí)中，使得植物呈現(xiàn)出紅色、紫色和藍(lán)色等多種多樣的顏色［25-27］。葉片顏色不同，其花青素含量有所差異，而紅葉和紫葉植物中花青素是主要的呈色物質(zhì)［28］。本研究發(fā)現(xiàn)，11月南天竹葉片中花青素含量最高，而火焰南天竹葉片中花青素含量在2月最高，可能是由于葉片的光合器官尚未發(fā)育完全，不能充分利用光能而導(dǎo)致自身產(chǎn)生較多的超氧化物，從而把營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成一些具有抗氧化能力的化合物，從而使葉片變紅［29-30］。

近年來，諸多學(xué)者對一些植物葉色變化的分子機(jī)制進(jìn)行了報(bào)道。如在菊花（Chrysanthemum morifoliumcultivars ‘Chunxiao’ 和 ‘Green anna’）葉片中短暫過表達(dá)的研究中發(fā)現(xiàn)，CmNAC73是葉綠素生物合成的正調(diào)控因子，它直接與葉綠素合成相關(guān)基因HEMA1和CRD1的啟動子結(jié)合，調(diào)控菊花葉色的改變［31］。在對銀杏（Ginkgo bilobaL.）突變體的轉(zhuǎn)錄組測序中發(fā)現(xiàn)，GbZDS和GbLCYE基因的上調(diào)促進(jìn)了葉片中類胡蘿卜素的積累［32］。另外一項(xiàng)關(guān)于梨（Pyrus bretschneideriRehder）的研究報(bào)道稱PbWRKY75可通過激活DFR、UFGT或MYB的啟動子來調(diào)控梨中花青素的積累，使葉色逐漸變深［33］。本研究中2種南天竹葉色變化的過程中可能受到一些關(guān)鍵基因的調(diào)控，從而使得其在一年中表現(xiàn)出不同的葉色。

溫度是影響植物葉片顏色的外界因素之一。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境溫度發(fā)生變化時(shí)會影響花青素的積累，導(dǎo)致植物葉色也隨之改變。通過高效液相色譜法分析白花紫露草（Tradescantia reflexaVell.）突變體和野生型葉片中的花青素含量，發(fā)現(xiàn)低溫條件下葉片中花青素的含量高［34］。本研究中發(fā)現(xiàn)，低溫環(huán)境下南天竹和火焰南天竹的葉色更紅，可能的原因是低溫誘導(dǎo)了調(diào)控花青素合成途徑上關(guān)鍵基因的表達(dá)，使葉片中花青素含量上升，從而使葉片變紅，而關(guān)于其葉片變化的機(jī)制是后續(xù)研究的方向。目前南天竹和火焰南天竹不同時(shí)期的葉片測序工作正在進(jìn)行，我們期望從分子層面深入解析2種南天竹葉色變化的分子機(jī)制。

綜上所述，南天竹和火焰南天竹生長發(fā)育過程中葉色變化的現(xiàn)象涉及多種色素代謝途徑。在南天竹和火焰南天竹葉片發(fā)育的初期，由于外界溫度低，誘導(dǎo)葉片大量合成花青素，使其呈現(xiàn)紅色。隨著環(huán)境溫度的不斷升高，葉片中葉綠素和類胡蘿卜素的含量慢慢產(chǎn)生并積累到一定程度，從而導(dǎo)致葉片顏色逐漸由紅色慢慢轉(zhuǎn)變成綠色。本研究為南天竹和火焰南天竹葉色變化的機(jī)理提供了新的見解，也為其在園林應(yīng)用方面提供了一定的指導(dǎo)。