馬翠，楊凡，張君泰，何凱

（1 中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，廣東 深圳 518055； 2 深圳市精密工程重點實驗室，廣東 深圳 518055）

目前生物分析技術(shù)正向高靈敏度、小劑量、高通量、多功能等趨勢發(fā)展，以微孔板為載體的多功能微孔板檢測儀是合成生物實驗中的必備儀器。微孔板是一種高通量反應(yīng)容器，常用的96孔板每孔的容量大概是365 μL，單次檢測所需的溶液體積小且可多孔批量檢測，利用它可以提高檢測速度并降低檢測成本。微孔板讀板機、酶標(biāo)儀是針對微孔板的檢測儀器，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥檢測［1-4］。該類儀器最早是由BioTek公司（現(xiàn)已歸入Agilent公司）生產(chǎn)研制，極大地提高了生化分析的工作效率。后來Molecular Devices、Tecan、PerkinElmer、Thermo Scientific等公司也逐漸推出了具有動力學(xué)檢測功能、溫控功能、振板功能的酶標(biāo)儀和微孔板檢測儀，這些儀器可進(jìn)行吸光度檢測、熒光強度檢測、熒光偏振檢測、化學(xué)發(fā)光檢測等，性能逐漸完善，功能也不斷擴充。多功能微孔板檢測儀幾乎被這些國外知名儀器廠商所壟斷，典型的有Agilent Biotek的Synergy系列［5］、Molecular Devices公司的SpectraMax系列［6］、Tecan公司的Infinite系列［7］等。在儀器研制方面，國內(nèi)很多高校和研究機構(gòu)也開展了相關(guān)方面的研究。如山東藥學(xué)科學(xué)院于學(xué)龍等［8］研制了多通道的吸光度檢測酶標(biāo)儀，12通道同時檢測，帶溫控功能；蘇州大學(xué)林學(xué)源等［9］增加參比光路，研制高分辨率酶標(biāo)儀；上海交通大學(xué)的朱家亮等［10］研制基于嵌入式系統(tǒng)的小型酶標(biāo)儀；浙江大學(xué)王宇等［11］研制熒光/發(fā)光檢測的多功能分析儀；華南理工大學(xué)的李強等［12］研制多功能熒光分析儀；杭州電子科技大學(xué)的周鵬飛等［13］研制了一套多功能微孔板分析儀樣機，包括吸光度、熒光、化學(xué)/生物發(fā)光檢測；中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所的耿旭輝團隊［14-15］研發(fā)了小型高精度的熒光檢測模塊，達(dá)到同等儀器國際先進(jìn)水平。國內(nèi)的研究雖然取得了不少成績，但產(chǎn)業(yè)化的產(chǎn)品還不多。國內(nèi)公司生產(chǎn)的酶標(biāo)儀基本都只包含吸光度檢測功能，雖然也有相關(guān)的熒光PCR儀、發(fā)光分析儀等，但單機功能相對單一，自動化水平不高。

合成生物學(xué)自動化鑄造平臺將工業(yè)4.0的理念引入實驗室，用自動化機器代替人。通過集成軟硬件技術(shù)實現(xiàn)生物材料的自動化合成，代替研究人員進(jìn)行海量的工程化試錯實驗，提升實驗效率和操作精度［16］。微孔板檢測儀作為自動化平臺中廣泛使用的一種檢測設(shè)備，需要能夠集成在自動化控制系統(tǒng)中。進(jìn)口產(chǎn)品價格昂貴，操作復(fù)雜，且其控制指令自成體系，接口通常不開放，不易集成；國內(nèi)已有設(shè)備儀器功能相對單一，同時也需要進(jìn)行改造才能集成應(yīng)用于自動化鑄造平臺。

本研究面向合成生物學(xué)研究中對微孔板檢測儀的廣泛需求，研究高精度吸光度檢測和高靈敏度熒光檢測等關(guān)鍵技術(shù)，開發(fā)具有吸光度檢測和熒光檢測功能的緊湊、經(jīng)濟型微孔板檢測儀，并自主開發(fā)控制系統(tǒng)及采集分析軟件，使其易于接入合成生物自動化鑄造平臺。

1 系統(tǒng)基本原理

作為合成生物自動化鑄造平臺的組成部分，微孔板檢測系統(tǒng)必須實現(xiàn)全自動操作，包括進(jìn)樣的自動化以及檢測的自動化。系統(tǒng)發(fā)送指令，機械臂將待檢測微孔板放置在檢測平臺上，放置完成后機械臂收回，儀器蓋自動關(guān)閉，系統(tǒng)自動執(zhí)行檢測功能；當(dāng)檢測完成后儀器蓋自動打開，機械臂取出檢測完成的微孔板，進(jìn)行下一步操作。

按功能模塊設(shè)計，多功能微孔板檢測系統(tǒng)的硬件部分可以分為吸光度檢測模塊、熒光檢測模塊、控制模塊、光源模塊、電源模塊、儀器蓋自動開閉及微孔板進(jìn)給模塊，如圖1所示。其中，吸光度和熒光檢測模塊主要包括吸光度和熒光檢測的光路系統(tǒng)，包含光源、探測器、濾光片、準(zhǔn)直鏡、聚焦鏡等光學(xué)器件。控制模塊需要完成微孔板機構(gòu)的運動控制、儀器蓋的自動開閉機構(gòu)運動、數(shù)據(jù)的采集與處理、信號的傳輸通信等。

圖1 微孔板檢測儀主要模塊Fig. 1 Main modules of microplate reader

2 系統(tǒng)開發(fā)

微孔板檢測系統(tǒng)具有吸光度檢測、熒光檢測兩種模式，分別對應(yīng)不同的波長種類和不同的光學(xué)結(jié)構(gòu)，可獨立運行。

2.1 光路結(jié)構(gòu)

2.1.1 吸光檢測模塊

微孔板吸光度的檢測與分光光度計類似［17］，均是基于朗伯-比爾定律，當(dāng)一束單色光照射于介質(zhì)表面，通過一定厚度的介質(zhì)后，光會被吸收一部分，透射光會減弱。介質(zhì)的厚度和濃度越大，光強減弱就越明顯。吸光度或光密度OD（optical density）可以用公式表示如下：

式中，OD為光密度或吸光度；I0為入射光強；It為透射光強；T為透過率；K為摩爾系數(shù)或吸收系數(shù)；l為吸收介質(zhì)的厚度；c為物質(zhì)濃度。

光源模塊輸出的光經(jīng)過微孔板樣品后，進(jìn)入吸光度檢測光路。物質(zhì)對不同波長的光具有不同的吸收能力，檢測吸收能力需要用單色光。單色光通常有兩種實現(xiàn)方法：一是單色儀分光，可以任意選擇波長，波長范圍寬準(zhǔn)確性高，但光能損失會較大；二是采用濾光片方式得到單色光，波段數(shù)量有限，但濾光片相對更便宜，光能損失小。不同的光學(xué)系統(tǒng)都有各自的優(yōu)點和局限，目前市面上的微孔板檢測儀均采用光柵單色儀或濾光片來實現(xiàn)。具有代表性的是Agilent BioTek公司提出了Hybrid混合技術(shù)［18］，將兩種光學(xué)系統(tǒng)結(jié)合，可以實現(xiàn)兩種方式的吸光度檢測，具有較高的靈活度。光路系統(tǒng)如圖2（a）所示，圖中黃色部分是濾光片光路系統(tǒng)，白色標(biāo)注部分是雙光柵的分光系統(tǒng)。該系統(tǒng)靈敏度高，不同光路系統(tǒng)對應(yīng)不同的應(yīng)用場景，應(yīng)用范圍廣，但結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜。

圖2 吸光度檢測原理Fig. 2 Principle of absorbance detection

這里我們研究緊湊、經(jīng)濟型微孔板檢測儀，僅采用濾光片方式，光路結(jié)構(gòu)簡單，要得到相同的靈敏度不需要很強的光源。結(jié)合濾光片輪得到多個單色光，目前包含4個濾光片（405 nm、450 nm、492 nm、630 nm），后續(xù)可擴展。采用8路光路并行檢測來提高檢測速度，光源發(fā)出的光經(jīng)8條光纖束同時入射到8個樣品，經(jīng)樣品吸收后進(jìn)入檢測光路，被8個光電二極管同時接收。檢測前經(jīng)一組透鏡組進(jìn)行聚焦，避免多路信號的相互干擾，檢測光路示意圖如圖（2b）所示。圖2（c）是吸光度檢測的實物圖，光源選用Philips的12 V/24 W鹵鎢燈，光纖芯徑400 μm，8路探測器均采用濱松的S1133-01，光譜有效范圍320～1100 nm，感光面積2.8 mm×2.4 mm。透鏡組之間的間隔與探測器的排列尺寸對應(yīng)。

2.1.2 熒光檢測模塊

分子受到激發(fā)，吸收光子能量，從激發(fā)態(tài)的最低振動能級返回基態(tài)時發(fā)射特定波長光譜的現(xiàn)象稱為熒光。熒光輻射比激發(fā)光能量低，發(fā)射的波長比激發(fā)光的波長要長。熒光檢測技術(shù)具有靈敏度高、動態(tài)范圍寬等優(yōu)點，但也容易受環(huán)境的影響，如：熒光猝滅、光漂白等會對檢測產(chǎn)生較大的影響。不同的熒光物質(zhì)有不同的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，可用熒光對物質(zhì)進(jìn)行鑒別；同時在較低濃度下，熒光強度與樣品濃度存在線性變化關(guān)系，熒光檢測也可用于物質(zhì)的定量測定［19-20］。

熒光檢測系統(tǒng)中，由光源輸出光入射到微孔板樣品，激發(fā)的熒光信號進(jìn)入熒光檢測光路。光路主要包括激發(fā)光路和發(fā)射光路，激發(fā)光路是從光源輸出光照射到樣品，實現(xiàn)高效激發(fā)；發(fā)射光路用于檢測激發(fā)的熒光。熒光信號通常較弱，常用熒光檢測系統(tǒng)中，光源多采用大功率的氙燈，探測器采用高靈敏的光電倍增管PMT（photomultiplier），發(fā)射及激發(fā)光路均采用單色儀，可以實現(xiàn)光譜掃描。光路結(jié)構(gòu)如圖3（a）所示［21］，該系統(tǒng)波段范圍廣，可得到熒光光譜，但系統(tǒng)功率高且體積也較大。后來有研究人員研制出小型熒光檢測模塊，采用LED光源和光電二極管PD（photodiode）實現(xiàn)［22-25］，同樣具有較高的檢測靈敏度。特別是中科院大連化物所研制的高靈敏度小型熒光模塊［14］，結(jié)構(gòu)緊湊，精度高。這里我們采用類似的光路結(jié)構(gòu)，集成小型熒光模塊，減小系統(tǒng)體積，光路結(jié)構(gòu)如圖3（b）所示。為保證激發(fā)光信號不會影響熒光信號，分別采用激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片來實現(xiàn)。光源經(jīng)激發(fā)濾光片得到窄波段的激發(fā)光源，經(jīng)二向色鏡反射到微孔板樣品，激發(fā)熒光后，熒光經(jīng)二向色鏡和發(fā)射濾光片到達(dá)探測器上，即可檢測熒光強度。光源采用300 mW的藍(lán)光LED，濾光片選擇480 nm和520 nm范圍的窄帶濾光片，探測器選用LSSPD-1.2。光路末端連接一個5 mm孔徑的光纖準(zhǔn)直鏡，避免光線發(fā)散造成較大的孔間干擾。同時，小型熒光模塊安裝在一維移動機構(gòu)上，與微孔板的一維運動機構(gòu)組合實現(xiàn)二維空間掃描檢測。此外，鏡頭相對被測物的距離對檢測光強也有較大影響，結(jié)構(gòu)設(shè)計時增加距離可調(diào)部件用于實驗時調(diào)節(jié)測試。熒光檢測部分的實物圖如圖3（c）所示，熒光光路封裝集成在一小盒子里，由于微孔板里的裝載樣品可能會有不同容量，所需的聚焦位置會不同，這里在底部增加一個準(zhǔn)直鏡使光線平行。后續(xù)也可考慮自動聚焦系統(tǒng)，根據(jù)樣品溶液的高度調(diào)節(jié)聚焦位置。

圖3 熒光檢測原理Fig. 3 Principle of fluorescence detection

2.2 控制系統(tǒng)

控制系統(tǒng)基于ARM Cortex-M4內(nèi)核的主控器STM32F407芯片，包括電源轉(zhuǎn)換模塊、步進(jìn)電機驅(qū)動模塊、數(shù)據(jù)采集模塊、串口通信等（圖4）。

圖4 控制系統(tǒng)主要功能Fig. 4 Functions of control module

2.2.1 電機驅(qū)動控制模塊

系統(tǒng)共有4個電機，包括送板位置二維運動的兩個電機、濾光片輪控制電機以及自動開蓋的控制電機。這里均采用兩相步進(jìn)電機來實現(xiàn)，使用微控制器結(jié)合步進(jìn)電機驅(qū)動芯片來驅(qū)動電機。每個電機4個端子A+A-B+B-對應(yīng)控制端的4個端口，通過微控制器端口的電平高低控制電流的導(dǎo)通，通過導(dǎo)通順序控制轉(zhuǎn)動方向。定時器的時鐘頻率控制速度，脈沖數(shù)控制運行位置，細(xì)分部分可以提高位置控制精度。

每個電機均配有光電限位開關(guān)，通過光電開關(guān)判斷電機是否到達(dá)零點及限定位置。當(dāng)發(fā)生限位時產(chǎn)生外部中斷傳入微控制器，根據(jù)中斷信號進(jìn)行停止等操作。

2.2.2 數(shù)據(jù)采集模塊

光學(xué)信號的采集需要I/V轉(zhuǎn)換電路、前置放大、增益放大、信號調(diào)理、AD轉(zhuǎn)換電路等，還需與數(shù)字電路、功率電路進(jìn)行電氣隔離。吸光度檢測的是相對初始光強的比值，因此信號放大部分要求不是很高。熒光檢測的是發(fā)射熒光的強度，熒光信號通常較弱，要得到高的檢測靈敏度需要更大的放大倍數(shù)。STM芯片內(nèi)部有AD轉(zhuǎn)換功能，為了提高檢測精度，增加外置AD轉(zhuǎn)換模塊，特別是熒光溶液的檢測精度需要微伏級別，這里采用24位的高精度采集卡。

2.2.3 通信模塊

通信模塊負(fù)責(zé)發(fā)送接收指令和數(shù)據(jù)，這里采用串口總線接口設(shè)計，利用MAX3232電平轉(zhuǎn)換芯片實現(xiàn)單片機與上位機進(jìn)行通信。波特率采用19 200 bit/s，包含1個起始位、8個數(shù)據(jù)位、無校驗位、1個停止位。指令主要分為三大類：送板位置控制，吸光度檢測，熒光檢測。根據(jù)串口功能，可自定義串口指令格式（串口指令功能見表1），如：這里以十六進(jìn)制FA字符作為幀頭，功能碼自定義，ODOA字符結(jié)束。根據(jù)定義的指令格式，可與上位機PC端進(jìn)行通信控制，也可與自動化鑄造平臺集成控制軟件進(jìn)行通信。

表1 串口指令功能表Table 1 Serial port instructions

2.3 軟件設(shè)計

2.3.1 下位機程序

下位機的控制程序在Keil uVision環(huán)境下編寫，主要實現(xiàn)對電機驅(qū)動控制、數(shù)據(jù)傳輸、串口通信等，涉及系統(tǒng)時針設(shè)置、定時器TIM設(shè)置及中斷函數(shù)、I/O配置、外部中斷函數(shù)、AD通道配置及DMA數(shù)據(jù)傳輸設(shè)置、串口指令功能等。

以電機驅(qū)動控制為例，電機控制主要包括速度、位置、方向，這里我們通過在嵌入式程序里的定時器TIM時鐘頻率控制電機運行速度，通過寫入的脈沖數(shù)控制電機運動的位置，通過改變電機電磁繞組端子A/B/C/D的導(dǎo)通順序控制電機轉(zhuǎn)動方向。驅(qū)動控制的流程及主要函數(shù)如圖5所示。

圖5 電機的驅(qū)動控制程序Fig. 5 Control program for stepping motor

2.3.2 上位機程序設(shè)計

上位機程序采用QT開發(fā)，包括參數(shù)設(shè)置、吸光度和熒光檢測功能、數(shù)據(jù)處理分析、系統(tǒng)校準(zhǔn)，軟件主要功能如圖6。

圖6 軟件功能圖Fig. 6 Software function diagram

具體的操作界面如圖7。圖7（a）是軟件主界面，可以進(jìn)行參數(shù)設(shè)置、檢測控制。另外，還可在操作界面進(jìn)行以下操作：

圖7 軟件界面Fig. 7 User interface of software

（1）顯示/隱藏調(diào)試信息

點擊按鈕顯示/隱藏調(diào)試信息交替顯示。顯示調(diào)試信息，便于查看串口的傳輸數(shù)據(jù)。

（2）檢測數(shù)據(jù)的保存和顯示

檢測完成后數(shù)據(jù)自動保存并顯示在界面的表格里。數(shù)據(jù)保存采用兩種方式：一種是CSV文件，方便用Excel隨時查看，文件名以當(dāng)前時間命名；另一種是數(shù)據(jù)庫文件，可以進(jìn)行查詢、修改等操作，數(shù)據(jù)庫這里選用SQLite小型數(shù)據(jù)庫，無需額外的安裝與配置。

（3）校準(zhǔn)菜單

校準(zhǔn)包括位置校準(zhǔn)、檢測值的校準(zhǔn)。圖7（b）顯示了位置校準(zhǔn)界面，位置校準(zhǔn)主要是送板位置的偏差校準(zhǔn)和濾光輪不同波長位置的校準(zhǔn)，若存在位置誤差可根據(jù)偏差值補償在實際的運動中。檢測值校準(zhǔn)針對一些系統(tǒng)固定誤差進(jìn)行補償，不同波長對應(yīng)的檢測值誤差可能不同，具體的校準(zhǔn)方法將根據(jù)實驗數(shù)據(jù)分析。

（4）質(zhì)控圖

對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算均值M和均方差S，確定圖形中心線、上下控制限、上下輔助線等。如圖7（c），根據(jù)檢測值的變化分布可以查看檢測值的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性等。按照統(tǒng)計學(xué)規(guī)律，檢測數(shù)值一般要遵循一些規(guī)律，如：95%的結(jié)果應(yīng)落在M±2S范圍內(nèi)；均值兩側(cè)的數(shù)據(jù)分布幾乎相同，不能有連續(xù)多次結(jié)果在均值的同一側(cè)，或連續(xù)多次數(shù)值漸升或漸降。如果準(zhǔn)確性變化，數(shù)值會出現(xiàn)向上或向下的總體趨勢性變化；如果精密度變化，會出現(xiàn)數(shù)值差異性增大的現(xiàn)象。

2.3.3 自動化鑄造平臺的連接通信

微孔板檢測儀作為合成生物實驗中常用的一種檢測儀器，需要集成在合成生物自動化鑄造平臺中，并與集成控制軟件通信控制。該系統(tǒng)可以通過兩種方式通信：一種是通過串口進(jìn)行物理連接，直接使用表1中的串口指令進(jìn)行通信，這種方式不需要運行微孔板檢測的上位機程序，但需要串口線連接，使用范圍有限制：另一種是通過TCP/IP協(xié)議進(jìn)行通信，可以遠(yuǎn)程控制，TCP（transmission control protocol）傳輸控制協(xié)議是一個用于數(shù)據(jù)傳輸?shù)膫鬏攲泳W(wǎng)絡(luò)協(xié)議，一般分為客戶端和服務(wù)端，即C/S（client/server）模型。這里微孔板檢測系統(tǒng)作為服務(wù)端，集成控制平臺作為客戶端，通過QT的QTcpSocket來讀取和寫入數(shù)據(jù)。程序運行時，客戶端需已知服務(wù)端的IP地址和端口號，先打開服務(wù)端程序，服務(wù)端監(jiān)聽客戶端發(fā)來的連接請求，等連接后可以讀取客戶端發(fā)來的數(shù)據(jù)報，也可發(fā)送數(shù)據(jù)報。表2是自定義的TCP通信指令，客戶端連接后可通過該指令進(jìn)行遠(yuǎn)程控制。圖8是編寫的服務(wù)端和客戶端測試程序，圖8（a）是微孔板檢測儀程序上對應(yīng)的服務(wù)端，圖8（c）對應(yīng)自動化平臺上的客戶端程序，經(jīng)測試兩部分程序可以進(jìn)行遠(yuǎn)程連接通信。

表2 TCP通信指令Table 2 Instructions of TCP communication

圖8 TCP通信測試Fig.8 TCP communication test program

3 實驗結(jié)果和分析

圖9（a）是樣機的外部實物圖，圖9（b）是打開上面蓋子后的內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖。吸光度檢測時，96孔板的一排8孔同時檢測，送板機構(gòu)只需要一維來回運動。熒光檢測是單點檢測，需要增加另一軸的掃描運動。為了減小儀器尺寸，設(shè)計熒光檢測模塊在另一方向來回運動，結(jié)合送板機構(gòu)的一維運動實現(xiàn)二維掃描。開蓋部分設(shè)計為向上的推拉方式，方便機械臂從側(cè)面進(jìn)行微孔板的拿取和放下。

圖9 研制樣機Fig. 9 Prototype built

3.1 吸光度檢測

根據(jù)計量檢定規(guī)程JJG 861—2007的規(guī)定要求，采用中性密度濾光片對微孔板吸光度性能進(jìn)行重復(fù)性檢測［26-28］。實驗中采用大恒光電的GCC系列中性濾光片。

由于環(huán)境、暗電流等影響，在沒有光照的情況下，探測器的檢測值通常不為0，故吸光度的計算［式（1）］表示為：

式中，Imin是沒有光照的情況下的檢測值；Imax是沒有檢測物的情況下測的光源強度。光源的穩(wěn)定性隨著時間可能會有變化，可以每次測量時先測量光源強度再進(jìn)行檢測，也可以事先測量光源強度保存相關(guān)值，定期對光源值進(jìn)行校準(zhǔn)。經(jīng)檢測，不同波長光源的光強值差異較大，每個波段需要單獨保存用于計算。為了提高檢測速度，這里選用保存光源測量值、定期校準(zhǔn)光源的方式，吸光度整板檢測一次測量時間小于10 s。

3.1.1 重復(fù)性及準(zhǔn)確性測試

選擇不同波長的光源，將標(biāo)稱值OD=1.0的中性濾光片放在96孔架上，如圖10所示，在濾光片所在的中心孔位重復(fù)測量10次，計算多次測量OD值的平均值A(chǔ)VE和標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（表3）。

表3 不同波長吸光度測量值Table 3 OD values at different wavelength

圖10 檢測中性密度濾光片的OD值Fig. 10 Neutral filter used for OD test

從上表可以看到，4個波長的測量值標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.3%。測量準(zhǔn)確性方面，不同波長的光源強度有些差異，測量誤差也有些不同，405 nm的示值誤差稍大，平均值與標(biāo)稱值的差異為0.035，其他幾個波長分別為0.008、0.006、-0.004。由于測量值的重復(fù)性較好，考慮補償方式校正示值誤差。測量誤差隨波長不同有些變化，需對不同波長測量結(jié)果分別校正。

除了同一孔位的重復(fù)性，不同孔位之間的差異也需要考慮。這里選取同一波長同一濾光片，隨機移動濾光片在96孔板上的位置，測量幾個不同孔位的重復(fù)性，不同孔位用微孔板兩個方向的序號代表，測量結(jié)果如表4，測量標(biāo)準(zhǔn)偏差同樣小于0.3%。后續(xù)還需進(jìn)一步增加測量孔位，并在測量值的校準(zhǔn)中綜合考慮不同孔位的誤差。

表4 不同孔位吸光度測量值Table 4 OD values at different position

3.1.2 線性度測試

為更準(zhǔn)確地測量線性度，在中國計量科學(xué)研究院購買橙黃G吸光度標(biāo)準(zhǔn)溶液［生化分析儀線性誤差校準(zhǔn)用溶液GBW（E）130767-130774］進(jìn)行線性度測試。不同濃度的溶液分別取100 μL加入透明微孔板的不同孔位，光源采用492 nm波段，吸光度測量值的平均值A(chǔ)VE及標(biāo)準(zhǔn)差RSD如表5。線性擬合曲線如圖11所示，擬合方程y=0.2739x+0.0434，擬合系數(shù)R2=0.9963。由于測量條件不一樣，使用的波長及檢測工具不同，測量值與標(biāo)準(zhǔn)值數(shù)值差異較大，但擬合系數(shù)接近1，線性度較好。

表5 不同標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度測量值Table 5 OD values for different standard solutions

圖11 不同濃度溶液吸光度測量值的線性擬合Fig. 11 Linear fitting of different solutions OD test

3.2 熒光檢測

熒光素鈉安全無毒，這里我們采用熒光素鈉粉末（分子量376.27）配制熒光素溶液（圖12）測試熒光檢測精度，10 mmol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液作為稀釋溶液。主要的儀器工具包括高精度電子秤、移液槍、容量瓶、燒杯、滴定管等。為降低背景干擾，熒光檢測選用黑色的96孔板。

圖12 配制熒光素鈉溶液Fig. 12 Fluorescein solution

①配制0.5 mmol/L熒光素鈉溶液：用電子秤量取0.301 g熒光素鈉，與1600 mL的NaOH溶液融合。選擇該溶液作為母液，用NaOH溶液稀釋可得到所需濃度的溶液。

②配制pmol/L的熒光素鈉梯度溶液：首先將10 μL的0.5 mmol/L的熒光素鈉溶液與4990 μL的NaOH溶液混合得到1 μmol/L的溶液；再將10 μL 1 μmol/L的溶液與10 mL NaOH溶液稀釋得到1 nmol/L的溶液，此后再對半稀釋得到500 pmol/L、250 pmol/L、125 pmol/L、 62.5 pmol/L、 31.25 pmol/L、15.625 pmol/L、7.8125 pmol/L、3.9063 pmol/L的溶液。

③用移液槍量取100 μL的不同濃度的溶液分別滴入96孔板，連續(xù)測量5次計算平均值A(chǔ)VE和標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，測量結(jié)果如表6。根據(jù)測量的平均值進(jìn)行線性擬合，這里將稀釋所用的NaOH溶液作為對照樣本，其他濃度的溶液減去對照樣本的數(shù)值后再進(jìn)行擬合，如圖13，擬合系數(shù)R2=0.9967。當(dāng)濃度稀釋至3.9063 pmol/L時，檢測值與稀釋溶液NaOH的值接近，基本到達(dá)檢測限。

表6 熒光素鈉溶液檢測值Table 6 Detected values of fluorescein sodium

圖13 熒光檢測值線性擬合Fig. 13 Linear fitting of fluorescence detection

此外，為比較不同孔位的檢測重復(fù)性，用移液槍選取100 μL的相同濃度溶液分別加入96孔板的不同孔位。檢測結(jié)果如表7，可以看到檢測值的標(biāo)準(zhǔn)差相對表6明顯增加，機構(gòu)移動時的定位誤差會影響光照位置，不同孔位的加樣過程也可能會引入部分誤差，均會影響檢測值。后續(xù)還需提高位置控制精度，另外，不同的檢測距離、溶液加樣量［29］等對測量結(jié)果都會有影響，還需要進(jìn)一步實驗驗證選取最佳參數(shù)。

表7 不同孔位的熒光檢測值Table 7 Fluorescence values at different position

3.3 自動化鑄造平臺的控制測試

實驗中采用自動化鑄造平臺的集成控制軟件控制機械臂與微孔板檢測系統(tǒng)，可以實現(xiàn)對微孔板檢測系統(tǒng)的控制。首先，集成控制軟件根據(jù)IP地址和端口號連接設(shè)備；然后，機械臂運動到微孔板檢測儀所在的位置，如圖14（a）；接著，機械臂將96孔板送到檢測系統(tǒng)，如圖14（b）；最后，發(fā)送命令進(jìn)行操作并顯示當(dāng)前狀態(tài)。圖14（c）顯示集成控制軟件發(fā)送#Abs001#進(jìn)行吸光度檢測，目前狀態(tài)是吸光度檢測完成。

圖14 自動化平臺遠(yuǎn)程控制Fig. 14 Remote controlled by automated integration platform

3.4 分析比較

本系統(tǒng)研制一種經(jīng)濟、緊湊型多功能微孔板檢測儀，根據(jù)實驗結(jié)果與部分國內(nèi)外儀器進(jìn)行性能比較。國外的多功能微孔板檢測儀種類較多，功能也從單功能、雙功能到多功能。這里僅列舉兩種：SectralMax Mini作為一種經(jīng)濟型的多功能酶標(biāo)儀，主要用于檢測光吸收、熒光；BioTek Synergy H1多功能檢測儀，采用光柵和濾光片的獨特組合光路，可以檢測光吸收、熒光強度、熒光偏振、時間分辨率熒光、生物發(fā)光、熒光共振BRET等，功能強大。國內(nèi)的酶標(biāo)儀基本都只包含吸光度檢測，選取博科公司最新的BK-EL10D型號進(jìn)行對比。光吸收和熒光檢測性能比較如表8，可以看到國內(nèi)酶標(biāo)儀在吸光度檢測方面已經(jīng)接近國外水平，但功能相對單一，沒有集成熒光、發(fā)光檢測等功能。本系統(tǒng)研發(fā)的微孔板檢測儀，是一種緊湊、經(jīng)濟型檢測儀器，吸光度檢測精度在0～2.0范圍內(nèi)較好，熒光檢測靈敏度可以達(dá)到pmol/L級別，與國外的經(jīng)濟型儀器指標(biāo)已比較接近，但在檢測范圍方面還有待提高。在自動化兼容方面，僅BioTek Synergy系列提到可以與第三方兼容，其他型號無相關(guān)介紹；本系統(tǒng)研發(fā)設(shè)備的接口開放，已實驗測試可以實現(xiàn)自動化平臺的遠(yuǎn)程控制。因此，該系統(tǒng)研發(fā)儀器可以替代國外的經(jīng)濟型多功能酶標(biāo)儀用于合成生物自動化平臺。

表8 微孔板檢測儀性能比較Table 8 Performance comparison of microplate readers

4 結(jié) 論

本課題組研制了一套經(jīng)濟、緊湊型的多功能微孔板檢測系統(tǒng)，包含吸光度檢測和熒光檢測功能，自主設(shè)計了控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集處理軟件，可以通過串口和TCP方式與自動化平臺的集成控制系統(tǒng)進(jìn)行通信。實驗測試驗證了系統(tǒng)的可行性及檢測的準(zhǔn)確性。系統(tǒng)的主要優(yōu)點有：

①模塊化設(shè)計，吸光度模塊和熒光模塊均可獨立控制和運行。吸光度同時檢測多路透射光，一維掃描實現(xiàn)96孔板的檢測，整板檢測只需10 s；熒光檢測激發(fā)光，單點高精度檢測，二維掃描實現(xiàn)整板檢測。

②系統(tǒng)結(jié)構(gòu)緊湊。熒光檢測時，通過微孔板的一維運動結(jié)合小型熒光檢測模塊的一維運動實現(xiàn)二維掃描，掃描機構(gòu)緊湊；另外，電機控制采用嵌入式微控制器和電機驅(qū)動芯片，不需要外接驅(qū)動器，節(jié)約成本及空間。

③多種接口通信方式，可串口連接調(diào)試控制，也可遠(yuǎn)程操作檢測。

該微孔板檢測系統(tǒng)可以實現(xiàn)吸光度和熒光的檢測，功能基本實現(xiàn)，但目前還有待改進(jìn)的地方，也是后續(xù)工作的重點：

①完善軟件的數(shù)據(jù)處理和分析。目前只包含了基本的質(zhì)控分析，還需增加測量數(shù)據(jù)的曲線顯示、回歸計算、具體生化數(shù)據(jù)分析等。

②進(jìn)一步提高檢測精度。吸光度檢測中，當(dāng)透射率較小時測量誤差會有所增加，正在改進(jìn)數(shù)據(jù)采集模塊，提高數(shù)據(jù)的采集精度并提高吸光度的測量范圍。熒光檢測中，將進(jìn)一步進(jìn)行影響因素分析，如溶液量、檢測距離、放大倍數(shù)等，實驗選取最佳參數(shù)。此外，機械運動誤差會增加不同孔位之間的檢測誤差，還要進(jìn)一步提高定位精度，減小整體系統(tǒng)誤差。

③便攜性設(shè)計。小型化、便攜性是檢測儀器發(fā)展的趨勢，本系統(tǒng)結(jié)構(gòu)緊湊但還有提升空間。如：a.減小儀器體積，開蓋機構(gòu)目前采用向上推拉設(shè)計，增加了儀器高度和重量，后續(xù)考慮改進(jìn)孔板的進(jìn)樣機構(gòu)，讓孔板自動向外伸縮，減小體積；b.輕量化設(shè)計，目前樣機外殼稍重，后續(xù)擬采用輕質(zhì)材料減小重量，并進(jìn)一步優(yōu)化結(jié)構(gòu)設(shè)計，使其更便攜美觀。