何嘉偉 江漢美 邸江雪 田 宇 劉天琪 黃振陽

(湖北中醫(yī)藥大學藥學院湖北省藥用植物研發(fā)中心,武漢,430065)

中藥藥對源于中醫(yī)臨床實踐,系指兩味中藥通過相對固定的組合形式形成配伍單位而發(fā)揮綜合效應(yīng),是中藥復方“合群妙用”的縮影,體現(xiàn)了方劑配伍的規(guī)律特征和辨證施治的科學內(nèi)涵[1]。

中藥干姜來源于姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的干燥根莖,性辛,熱,歸脾、胃、腎、心、肺經(jīng),具有溫中散寒、溫肺化飲的功效,有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎抑菌、保護心血管等藥理作用[2]。中藥細辛來源于馬兜鈴科植物北細辛[Asarumheterotr-opoidesFr.Schmidtvar.mandshuricum(Maxim.)Kitag.]、漢城細辛(AsarumsieboldiiMiq.var.seoulensenakai)或華細辛(Asarum sieboldii Miq.)的干燥根和根莖,性辛,溫,歸肺、腎經(jīng),具有解表散寒、祛風止痛、溫肺化飲的功效,有解熱鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、保護心腦血管系統(tǒng)、抗腫瘤等藥理作用;細辛也在國家衛(wèi)生健康委員會、國家中醫(yī)藥管理局推薦臨床治療新型冠狀病毒感染(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)的通用方劑清肺排毒湯中得到合理應(yīng)用[3-4]。

干姜、細辛藥對首見于《傷寒論》中的小青龍湯中,可溫肺散寒化飲止喘,用于治療肺寒之諸喘證;臨床上主治呼吸系統(tǒng)的疾病如風寒襲肺引起的痰飲、咳喘、鼻塞、慢性阻塞性肺病等病癥[5-8]。揮發(fā)油類物質(zhì)為干姜、細辛藥對的主要有效成分,目前在國內(nèi)外文獻中運用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Headspace Solid-phase Microextraction-gas Chromatography-mass Spectrometry,HS-SPME-GC-MS)法分析干姜、細辛藥對配伍后的揮發(fā)性成分尚未見報道。本研究采用HS-SPME-GC-MS法對比分析干姜、細辛的揮發(fā)性成分,為后續(xù)其藥效成分的深入研究奠定基礎(chǔ),同時進一步考察配伍前后的揮發(fā)性成分變化,以期為藥對發(fā)揮協(xié)同增效的物質(zhì)基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 藥材 干姜(湖南松齡堂中藥飲片有限公司,批號:20210406),細辛(湖南松齡堂中藥飲片有限公司,批號:202104014),經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學楊紅兵教授鑒定,分別為姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的干燥根莖和馬兜鈴科植物華細辛AsarumsieboldiiMiq.的干燥根和根莖。將干姜和細辛分別用粉碎機打成粉末并過16目篩,取出備用。

1.2 儀器 手動固相微萃取進樣裝置(IKA公司,德國,型號:C-MAG HS-4),氣相-質(zhì)譜-計算機聯(lián)用儀(Hewlett-Packard公司,美國,型號:Agilent6890/5973),電子天平(北京賽多利斯天平有限公司,型號:ALC-210.2)。

2 方法與結(jié)果

2.1 GC-MS色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 GC條件 色譜柱:HP-5MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);載氣:高純度氦氣(99.999%);流速0.8 mL/min;進樣口溫度:230 ℃;程序升溫:從50 ℃開始,以10 ℃/min升溫至230 ℃;不分流進樣。

2.1.2 MS條件 EI源;離子源溫度230 ℃,電離電壓70 eV;四極桿溫度150 ℃;掃描質(zhì)量范圍35～550 m/z。

2.2 頂空固相微萃取條件的優(yōu)化

2.2.1 取樣量的優(yōu)化 分別精密稱取藥對混合粗粉0.4 g、0.6 g、0.8 g、1.0 g,在60 ℃下平衡10 min,選用65 μm PDMS/DVB萃取纖維頭萃取15 min,按“2.1”項下條件進樣測定,以色譜出峰總面積為主要指標,以質(zhì)譜鑒定出的化合物種類數(shù)為輔助指標,對樣品取樣量進行優(yōu)化。當取樣量為0.8 g時,萃取吸附效果最好,故確定0.8 g為最佳取樣量。

2.2.2 萃取溫度的優(yōu)化 精密稱取藥對混合粗粉0.8 g,其他條件不變,分別在40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃、120 ℃條件下對混合樣品進行萃取,按“2.1”項下條件進樣測定和分析。當萃取溫度為100 ℃時,萃取吸附效果最佳,故確定100 ℃為最佳萃取溫度。

2.2.3 萃取時間的優(yōu)化 精密稱取藥對混合粗粉0.8 g,在100 ℃下加熱平衡10 min,其他條件不變,選用65 μm聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)/二乙烯苯(Divinylbenzene,DVB)萃取纖維頭分別萃取10、15、20、25、30 min,按“2.1”項下條件進樣測定和分析。當萃取時間為25 min時,萃取效果最佳,故確定25 min為最佳萃取溫度。

2.2.4 解析時間的優(yōu)化 精密稱取藥對混合粗粉0.8 g，在100 ℃下加熱平衡10 min，選用65 μm PDMS/DVB萃取纖維頭萃取25 min，取出，立即插入色譜儀進樣口，分別解析1、2、3、4、5 min，按“2.1”項下條件進樣測定和分析。當解析時間為3 min時，總峰面積最大，故確定3 min為最佳解析時間。

2.2.5 頂空固相微萃取條件 綜合“2.2.1～2.2.4”項的考察結(jié)果,最終確定頂空固相微萃取條件的最佳條件為:精密稱取藥對混合粗粉0.8 g,至于15 mL頂空瓶中,插入裝有65 μmPDMS/DVB萃取纖維頭的手動進樣器,在100 ℃下加熱平衡10 min,再壓縮手柄伸出萃取頭萃取25 min,取出,立即插入氣相色譜儀進樣口解析3 min,不分流進樣。單味藥材干姜和細辛的實驗條件同上。

2.3 數(shù)據(jù)分析 采用峰面積歸一化法計算各組分相對百分含量,并通過NIST08質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對所出峰的質(zhì)譜圖進行檢索,結(jié)合相關(guān)文獻進行人工譜圖解析,并結(jié)合相對保留時間以鑒定各組分。實驗結(jié)果通過SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對干姜、細辛及其藥對的揮發(fā)性成分及其含量進行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA),得到主成分的特征值和貢獻率。各特征向量揮發(fā)性成分相對含量再通過SPSS 21.0標準化后,得到各主成分得分及綜合得分。

2.4 樣品測定結(jié)果

按照上述條件,采用HS-SPME-GC-MS法對干姜、細辛配伍前后揮發(fā)性成分進行檢測分析,初步鑒定出了78種化合物,揮發(fā)性成分分析結(jié)果見表1。干姜、細辛及其藥對總離子流見圖1。

圖1 干姜、細辛及其藥對揮發(fā)性成分總離子流注:A.藥對;B.干姜;C.細辛

表1 干姜、細辛以及干姜細辛藥對揮發(fā)性成分分析結(jié)果

2.4.1 干姜、細辛以及藥對的揮發(fā)性成分的定量分析 從干姜、細辛及其藥對中共鑒定出揮發(fā)性成分78種。其中從干姜、細辛藥對中分離出52個峰,并鑒定出37種成分;從藥材干姜中分離出52個峰,并鑒定出38種成分;從藥材細辛中分離出45個峰,并鑒定出33種成分;各成分總量分別占總揮發(fā)性成分的96.31%,95.13%和97.69%。見表1,圖1。

干姜、細辛藥對中揮發(fā)性成分含量最高的為(+)-1,7-二表-α-雪松烯(46.3%),其次為B-倍半水芹烯(16.94%)、(-)-β-花柏烯(13.65%)、黃樟醚(3.4%)、香樹烯(3.2%)、甲基丁香酚(2.52%)、3,5-二甲氧基甲苯(2.28%)、(-)-α-蒎烯(2.01%)等;藥材干姜中揮發(fā)性成分含量最高的為(-)-α-雪松烯(49.57%),其次為α-姜黃烯(24.76%)、B-倍半水芹烯(5.11%)、(5-甲基-1-亞甲基-4-己烯基)環(huán)己烯(5.08%)、香樹烯(2.38%)、α-法呢烯(2.29%)、(-)-α-蒎烯(0.71%)等;藥材細辛中揮發(fā)性成分含量最高的為甲基丁香酚(31.18%),其次為肉豆蔻醚(16.59%)、正十五烷(11.2%)、黃樟醚(10%)、3,5-二甲氧基甲苯(6.45%)、(-)-α-雪松烯(49.57%)、B-倍半水芹烯(2.57%)、卡枯醇(2.27%)等。

2.4.2 干姜、細辛及藥對的揮發(fā)性成分中共有成分和特有成分分析 干姜、細辛及藥對揮發(fā)性成分中有6種共有成分,分別為冰片、3,5-二甲氧基甲苯、黃樟醚、(-)-α-蒎烯、甲基丁香酚、B-倍半水芹烯。三者共有成分中(-)-α-蒎烯和B-倍半水芹烯的含量相對于干姜、細辛配伍前上升較為明顯;冰片、3,5-二甲氧基甲苯、黃樟醚和甲基丁香酚的含量相對于干姜、細辛配伍前下降。共有成分中部分成分差異較大,如藥材細辛中甲基丁香酚的相對含量為31.18%,而藥對和干姜藥材中占比分別為2.52%和0.13%;藥對中B-倍半水芹烯的相對含量為16.94%,而干姜和細辛單味藥材中占比分別為5.11%和2.57%。

將干姜、細辛及藥對的揮發(fā)性成分進行比較,藥對中有16種特有成分,占總揮發(fā)性成分含量的16.58%,主要特有成分有(-)-β-花柏烯(13.65%)、β-石竹烯(1.34%)、橙花樹醇(0.58%)等;干姜中有20種特有成分,占總揮發(fā)性成分含量的29.78%,主要特有成分有α-姜黃烯(24.76%)、α-法呢烯(2.29%)、(E)-β-金合歡烯(0.67%)等;細辛中有20種特有成分,占總揮發(fā)性成分含量的33.31%,主要特有成分有肉豆蔻醚(16.59%)、正十五烷(11.2%)、3,4-(亞甲基二氧)苯丙酮(2.07%)等。

2.4.3 干姜、細辛及藥對揮發(fā)性成分種類和含量的差異 表1中的揮發(fā)性成分大致可分為8類,包括烯類、醇類、醚類、酚類、酮類、芳烴類、烷烴類和其他類化合物。藥對揮發(fā)性成分中烯類成分相對含量最高為86.01%;干姜藥材揮發(fā)性成分中同樣也是烯類成分相對含量最高為92.15%;細辛藥材揮發(fā)性成分中酚類成分相對含量最高為31.18%,其次為醚類成分為26.95%。三者的揮發(fā)性成分種類和含量的具體信息見表2。

表2 干姜、細辛以及藥對揮發(fā)性成分種類和相對含量的分析

2.4.4 干姜、細辛及藥對揮發(fā)性成分PCA 由表1可知,3組樣品的揮發(fā)性成分含量數(shù)據(jù)離散,PCA結(jié)果顯示前2個主成分的初始特征值均>1,其方差貢獻率分別為37.552%、33.525%,2個主成分累計貢獻率達到了71.077%,能夠反映樣品的整體信息，故取這2個主成分作為數(shù)據(jù)分析的有效成分。見表3。由表4可知，主成分綜合評價中，藥對與單味藥材的評分差異較大，干姜、細辛藥對揮發(fā)性成分的綜合得分較高。

表3 主成分的特征值及其貢獻率

表4 干姜、細辛及藥對揮發(fā)性成分主成分得分和綜合得分(分)

3 討論

通過比較分析,藥對中的揮發(fā)性成分并不是兩味藥材揮發(fā)性成分簡單相加,干姜、細辛配伍后產(chǎn)生了許多新的成分且含量較高,同時單味藥中有許多揮發(fā)性成分在藥對中未被檢出。結(jié)合三者的共有成分推測,干姜、細辛配伍前后揮發(fā)性成分變化可能是因為混合藥材粉末在高溫萃取過程中發(fā)生以化學變化為主的一系列反應(yīng),導致醚類和酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)變成烯類物質(zhì)。細辛中含量較高的毒性物質(zhì)如黃樟醚、肉豆蔻醚、甲基丁香酚等成分在與干姜配伍后含量大幅度減少,提高了用藥的安全性[9-11]。藥對中揮發(fā)性成分相對含量上升的β-石竹烯具有抗炎抑菌的作用[12-13];B-倍半水芹烯具有抗腫瘤的藥理作用[14];4-蒈烯和香樹烯具有抑菌的作用[15-16];橙花叔醇具有抗瘧疾、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理作用[17];(-)-α-蒎烯具有抗氧化的作用[18]。根據(jù)PCA結(jié)果顯示,干姜、細辛藥對評分最高。綜上所述,干姜、細辛藥對的配伍具有協(xié)同增效減毒的作用。

中藥藥對研究是闡明中醫(yī)用藥原則的重要途徑,干姜、細辛藥對是經(jīng)過長期實踐得出的經(jīng)典藥方,臨床應(yīng)用廣泛。但是對干姜、細辛藥對的揮發(fā)性成分研究較少。HS-SPME與傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法等提取方法比較,操作更簡單、費用低廉且減少了煎煮過程中造成的揮發(fā)性成分的流失;PCA通過對數(shù)據(jù)降維等分析,在中藥成分分析鑒定中起到重要作用,PCA將數(shù)據(jù)進行標準化處理,進而便于對樣品間的相似性和差異性進行科學準確的評價,主成分的特征值及方差貢獻率是選擇主成分的依據(jù)。通過SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對3組樣品的78種揮發(fā)性成分及其含量進行PCA,對干姜、細辛及其藥對的揮發(fā)性成分進行綜合評價[19-20]。本研究首次采用HS-SPME-GC-MS結(jié)合化學計量法對干姜、細辛藥對的揮發(fā)性成分進行比對分析,既拓展了其藥效成分的研究方法,同時也為干姜、細辛藥對發(fā)揮協(xié)同增效的臨床應(yīng)用提供了科學依據(jù)。

本研究采用HS-SPME-GC-MS聯(lián)用分析干姜、細辛藥對配伍前后的揮發(fā)性成分。共鑒定出78種成分,其中烯類成分占比最大。鑒定出干姜、細辛藥對揮發(fā)性成分37種,干姜揮發(fā)性成分38種,細辛揮發(fā)性成分33種,各定性組分分別占總揮發(fā)性成分的96.31%,95.13%和97.69%。藥對中新增16種成分,包括(-)-β-花柏烯、β-石竹烯、4-蒈烯、(-)-莰烯等。

同時,藥對與干姜共有的揮發(fā)性成分為15種,與細辛共有的揮發(fā)性成分為10種,單味藥材干姜和細辛共有的揮發(fā)性成分為9種,3組數(shù)據(jù)共有成分為6種。

利益沖突聲明:無。