葉長(zhǎng)文，周 蕓，李 棟，崔中月，趙婉霞，黃 闊，胡中軍，周 曉*

1.中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號(hào) 4500012.廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，南寧市西鄉(xiāng)塘區(qū)北湖南路28 號(hào) 530001

煙用香精香料種類繁多，組分復(fù)雜，富含微生物生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)成分，易受污染變質(zhì)［1-4］。菌落總數(shù)是影響煙用香精香料質(zhì)量穩(wěn)定的重要因素之一［5］，也是評(píng)價(jià)煙用香精香料衛(wèi)生狀況的重要指標(biāo)。目前，食品樣品的菌落總數(shù)檢測(cè)常參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.2—2022［6］中的平板計(jì)數(shù)法或測(cè)試片法進(jìn)行。平板計(jì)數(shù)法為傳統(tǒng)的菌落總數(shù)檢測(cè)方法，但該方法操作復(fù)雜，且對(duì)檢測(cè)環(huán)境要求較高［7］。測(cè)試片法是以凝膠或無(wú)紡布為培養(yǎng)基載體代替瓊脂培養(yǎng)微生物的一種新型檢測(cè)方法，具有操作快速、易于判讀、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)［8］。采用測(cè)試片法檢測(cè)各類食品樣品菌落總數(shù)的研究已有報(bào)道［9-10］。王曦等［11］采用測(cè)試片法與平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)了30個(gè)糕點(diǎn)樣品的菌落總數(shù)，發(fā)現(xiàn)2種方法檢測(cè)的菌落總數(shù)無(wú)顯著差異；林杰等［12］采用測(cè)試片法和平板計(jì)數(shù)法分別檢測(cè)了沙拉、茶葉、明蝦等15 種食品樣品的菌落總數(shù)，發(fā)現(xiàn)2 種方法的菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異；趙立冬等［13］采用測(cè)試片法與平板計(jì)數(shù)法對(duì)129 個(gè)熟肉樣品的菌落總數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)測(cè)試片法與平板計(jì)數(shù)法的檢測(cè)結(jié)果一致性較好。然而，測(cè)試片法檢測(cè)煙用香精香料菌落總數(shù)的相關(guān)研究還鮮見報(bào)道。為此，使用3種測(cè)試片以及PCA培養(yǎng)基檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)菌株樣品、菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品和煙用香精香料樣品的菌落總數(shù)，評(píng)價(jià)3種測(cè)試片檢測(cè)煙用香精香料菌落總數(shù)的適用性，旨在為測(cè)試片用于煙用香精香料菌落總數(shù)檢測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

供試的17株標(biāo)準(zhǔn)菌株（表1）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，為菌落總數(shù)測(cè)定過程中常見的可培養(yǎng)細(xì)菌［7，14］，也是變質(zhì)煙用香精香料中常見的優(yōu)勢(shì)菌［2，4］。菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品（QC-FD-002）購(gòu)自中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院。標(biāo)準(zhǔn)菌株和菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品均保存于-20 ℃冰箱。代表性煙用香精香料樣品采集于廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司倉(cāng)庫(kù)，共計(jì)56個(gè)。其中，1～53號(hào)樣品為煙用香料（含單體香料、香基、浸膏、酊劑、凈油等），54～56號(hào)樣品為煙用香精。煙用香精香料樣品均保存于4 ℃冰箱。

表1 標(biāo)準(zhǔn)菌株名稱和編號(hào)Tab.1 Name and number of standard strains

3M PetrifilmTM菌落總數(shù)測(cè)試片（3M-AC 測(cè)試片，3M 中國(guó)有限公司）；DNP 菌落總數(shù)測(cè)試片［DNP-AC測(cè)試片，安科生物制品（上海）有限公司］；MC-Media 菌落總數(shù)測(cè)試片（MC-AC 測(cè)試片，德國(guó)Merck公司）。

平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基和腦心浸出液肉湯（BHI）（北京陸橋技術(shù)有限公司）；無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.2，山東微色譜生物科技有限公司）。

Bio II Advance 生物安全柜（西班牙Telstar 公司）；BagMixer 400 均質(zhì)器（法國(guó)Interscience 公司）；CTHI-250B2H 恒溫恒濕箱［施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司］；CL-40M 高壓滅菌鍋（日本ALP 公司）；ZQZY-C58F 恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株樣品菌懸液制備

分別挑取17株標(biāo)準(zhǔn)菌株的單菌落接種于10 mL BHI培養(yǎng)基中，36 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化。取10 μL活化后的菌液加入含有9 mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液的試管中，充分混勻后對(duì)所得液體進(jìn)行梯度稀釋，得到7個(gè)稀釋梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7）的標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液。

1.2.2 菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品菌懸液制備

參照菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品說明書制備菌懸液原液。使用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液對(duì)菌懸液原液進(jìn)行梯度稀釋，得到4個(gè)稀釋梯度（10-2、10-3、10-4、10-5）的菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品菌懸液。

1.2.3 煙用香精香料樣品勻液制備

稱取25 g或量取25 mL煙用香精香料樣品放入無(wú)菌均質(zhì)袋中，加入225 mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液后使用拍擊式均質(zhì)器（2 擋）均質(zhì)1～2 min。將所得液體進(jìn)行梯度稀釋，得到4 個(gè)稀釋梯度（10-1、10-2、10-3、10-4）的煙用香精香料樣品勻液。

1.2.4 菌落總數(shù)檢測(cè)方法

1.2.4.1 平板計(jì)數(shù)法

在無(wú)菌條件下分別取10-1～10-7稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液、10-2～10-5稀釋梯度的菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品菌懸液和10-1～10-4稀釋梯度的煙用香精香料樣品勻液1 mL滴至無(wú)菌培養(yǎng)皿上，然后加入15～20 mL冷卻至46～50 ℃的PCA培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使其充分混勻，每個(gè)稀釋梯度設(shè)置3次重復(fù)。待瓊脂凝固后將培養(yǎng)皿倒置，（36±1）℃培養(yǎng)48 h后觀察PCA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，參照文獻(xiàn)［6］計(jì)算菌落總數(shù)。

1.2.4.2 測(cè)試片法

在無(wú)菌條件下分別取10-1～10-7稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液、10-2～10-5稀釋梯度的菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品菌懸液和10-1～10-4稀釋梯度的煙用香精香料樣品勻液1 mL滴至測(cè)試片中央，每個(gè)稀釋梯度重復(fù)3次。（36±1）℃培養(yǎng)24 h后觀察MC-AC測(cè)試片上的菌落形態(tài)，并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；在培養(yǎng)48 h后觀察3M-AC和DNP-AC測(cè)試片上的菌落形態(tài)，并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。測(cè)試片法的詳細(xì)操作和菌落總數(shù)的計(jì)算參照3M-AC、DNP-AC和MC-AC測(cè)試片使用說明書進(jìn)行。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 軟件將菌落總數(shù)轉(zhuǎn)換為10 的對(duì)數(shù)值，再用SPSS 24.0軟件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株和煙用香精香料樣品的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，并對(duì)煙用香精香料的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)。

菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品的結(jié)果通過計(jì)算Z比分?jǐn)?shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。Z比分?jǐn)?shù)計(jì)算公式：

式中：x為實(shí)驗(yàn)室菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果對(duì)數(shù)值，lgCFU/mL；X為特性值；s為能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差。本實(shí)驗(yàn)中菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品的特性值和能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差分別為3.370 lgCFU/mL 和0.182 lgCFU/mL。當(dāng)|Z|≤2時(shí)，評(píng)價(jià)結(jié)果為“滿意”；2＜|Z|＜3時(shí)，評(píng)價(jià)結(jié)果為“有問題”；|Z|≥3時(shí)，評(píng)價(jià)結(jié)果為“不滿意”。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株樣品菌落形態(tài)和菌落總數(shù)

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株樣品菌落形態(tài)

17株標(biāo)準(zhǔn)菌株在PCA培養(yǎng)基和3種測(cè)試片上的菌落形態(tài)描述見表2。在3種測(cè)試片上，所有標(biāo)準(zhǔn)菌株菌落均為紅色；在PCA培養(yǎng)基上，除金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）為黃色外，其他標(biāo)準(zhǔn)菌株菌落均為白色。在PCA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，同一標(biāo)準(zhǔn)菌株在PCA培養(yǎng)基表面和內(nèi)部的菌落大小和形狀差異較大。17 株標(biāo)準(zhǔn)菌株在3M-AC 測(cè)試片上培養(yǎng)48 h后，枯草芽胞桿菌（Bacillussubtilis）、解淀粉芽胞桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）和多黏類芽胞桿菌（Paenibacilluspolymyxa）的菌落有明顯的液化現(xiàn)象（圖1），影響計(jì)數(shù)，其他標(biāo)準(zhǔn)菌株菌落一般為圓形或近似圓形，菌落形態(tài)清晰，便于計(jì)數(shù)。在DNP-AC測(cè)試片上培養(yǎng)48 h后，標(biāo)準(zhǔn)菌株菌落一般為圓形，菌落形態(tài)清晰，便于計(jì)數(shù)。在MC-AC測(cè)試片上培養(yǎng)24 h后，標(biāo)準(zhǔn)菌株菌落形狀多不規(guī)則，但菌落形態(tài)清晰，無(wú)液化現(xiàn)象，便于計(jì)數(shù)。

圖1 3M-AC測(cè)試片上有明顯液化現(xiàn)象的標(biāo)準(zhǔn)菌株Fig.1 Standard strains with visible liquefaction on 3M-AC count plates

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果

表3為17株標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌落總數(shù)和菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值。其中，大腸桿菌（Escherichiacoli）、腸沙門氏菌腸亞種鼠傷寒血清型（Salmonellaentericasupbsp.entericaserovarTyphimurium）、塞氏檸檬酸桿菌（Citrobactersedlakii）、鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumnnii）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）和緩慢葡萄球菌（Staphylococcuslentus）6株標(biāo)準(zhǔn)菌株的3種測(cè)試片與PCA培養(yǎng)基菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果均為同一數(shù)量級(jí)；蠟樣芽胞桿菌（Bacilluscereus）的3M-AC 和DNP-AC 測(cè)試片菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果與PCA培養(yǎng)基菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果存在2個(gè)數(shù)量級(jí)的差異；蘇云金芽胞桿菌（Bacillusthuringiensis）的3M-AC測(cè)試片菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果與PCA培養(yǎng)基菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果存在2個(gè)數(shù)量級(jí)的差異。由圖2可見，PCA培養(yǎng)基與3M-AC、DNP-AC和MC-AC測(cè)試片的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值呈極顯著（P＜0.01）正相關(guān)。其中，MC-AC測(cè)試片的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值與PCA培養(yǎng)基的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值相關(guān)性（R2=0.997 7，P＜0.01）最好。

圖2 不同檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)菌株菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis between logarithmic values of aerobic plate counts of standard bacterial strains obtained by different methods

表3 標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌落總數(shù)和菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值Tab.3 Aerobic plate counts and the logarithmic values of aerobic plate counts of standard strains

2.2 定量質(zhì)控樣品菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果和評(píng)價(jià)

使用PCA培養(yǎng)基和3種測(cè)試片對(duì)菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品進(jìn)行檢測(cè)，PCA 培養(yǎng)基、3M-AC、DNP-AC和MC-AC測(cè)試片的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值如表4所示。Z比分?jǐn)?shù)的評(píng)價(jià)結(jié)果均為“滿意”。

表4 菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品檢測(cè)結(jié)果和評(píng)價(jià)Tab.4 Determination results and evaluation of quality control sample for aerobic plate count

2.3 煙用香精香料樣品菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果

使用PCA培養(yǎng)基和3種測(cè)試片分別檢測(cè)56個(gè)煙用香精香料樣品的菌落總數(shù)，部分樣品檢測(cè)結(jié)果見表5。其中，39個(gè)樣品的菌落總數(shù)小于10 CFU/mL（g），17 個(gè)樣品的菌落總數(shù)大于10 CFU/mL（g）。由圖3可見，采用測(cè)試片法和平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)煙用香精香料樣品菌落總數(shù)，2種方法的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值呈正相關(guān)。其中，MC-AC測(cè)試片與PCA培養(yǎng)基的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值相關(guān)性（R2=0.922 8，P＜0.01）最好。煙用香精香料樣品菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果（表6）表明，PCA 培養(yǎng)基與3 種測(cè)試片的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值差異均不顯著（P＞0.05）。

表5 煙用香精香料樣品的菌落總數(shù)和菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值①Tab.5 Aerobic plate counts and logarithmic values of aerobic plate counts of tobacco flavor samples

表6 煙用香精香料樣品菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值配對(duì)t檢驗(yàn)①Tab.6 Paired t-test for logarithmic values of aerobic plate counts of tobacco flavor samples

2.4 平板計(jì)數(shù)法和測(cè)試片法操作過程比較

由表7可見，相比平板計(jì)數(shù)法，在前期準(zhǔn)備時(shí)，測(cè)試片法無(wú)需清洗培養(yǎng)皿和配制培養(yǎng)基。在接種樣品勻液時(shí)，平板計(jì)數(shù)法將樣品勻液滴至培養(yǎng)皿后需傾注PCA培養(yǎng)基（46～50 ℃），而測(cè)試片法只需滴加樣品勻液即可。其中，樣品勻液滴至3M-AC測(cè)試片中央后，需用壓板將樣品勻液壓至規(guī)定大小，操作不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致樣品勻液接種區(qū)大小不一致，影響判讀，而樣品勻液滴至MC-AC 和DNP-AC 測(cè)試片中央后無(wú)需壓板按壓，樣品勻液因毛細(xì)管作用將自動(dòng)擴(kuò)散至測(cè)試片的整個(gè)接種區(qū)。在培養(yǎng)過程中，平板計(jì)數(shù)法使用的培養(yǎng)皿所占空間較大，而測(cè)試片體積小，可堆疊，移動(dòng)方便；PCA 培養(yǎng)基、3M-AC 和DNP-AC 測(cè)試片的培養(yǎng)時(shí)間均為48 h，而MC-AC測(cè)試片的培養(yǎng)時(shí)間為24 h。在結(jié)果判讀時(shí)，PCA 培養(yǎng)基上的菌落顏色和培養(yǎng)基接近，部分菌落較小，難以觀察和計(jì)數(shù)，而測(cè)試片上的菌落為紅色，菌落清晰，便于計(jì)數(shù)，但當(dāng)3M-AC測(cè)試片上出現(xiàn)明顯的液化現(xiàn)象時(shí)，可能會(huì)影響菌落計(jì)數(shù)。

表7 平板計(jì)數(shù)法和測(cè)試片法的操作過程Tab.7 Procedures of plate count method and count plate method

綜上，在進(jìn)行菌落總數(shù)檢測(cè)時(shí)，測(cè)試片法比平板計(jì)數(shù)法更簡(jiǎn)便、快速。其中，使用MC-AC 測(cè)試片進(jìn)行菌落總數(shù)檢測(cè)的前期準(zhǔn)備、樣品勻液接種和培養(yǎng)過程耗時(shí)均最短。

3 討論

3 種測(cè)試片與PCA 培養(yǎng)基的計(jì)數(shù)結(jié)果無(wú)顯著（P＞0.05）差異，這與徐蕾蕊等［14］和孫霞等［15］的研究結(jié)果一致。枯草芽胞桿菌（Bacillussubtilis）、解淀粉芽胞桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）和多黏類芽胞桿菌（Paenibacilluspolymyxa）在3M-AC 測(cè)試片上菌落邊緣模糊，液化現(xiàn)象明顯，這與謝范英［7］和王杰偉等［16］的研究結(jié)果一致。液化現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是因?yàn)檫@些菌株的代謝能力較強(qiáng)，分解了測(cè)試片中的凝膠。在使用PCA 培養(yǎng)基和3 種測(cè)試片對(duì)煙用香精香料菌落總數(shù)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)54號(hào)樣品在PCA培養(yǎng)基上的檢測(cè)結(jié)果比3M-AC 和DNP-AC 測(cè)試片高4 個(gè)數(shù)量級(jí)，這與張建軍等［9］報(bào)道的3M-AC 測(cè)試片和PCA 培養(yǎng)基檢測(cè)同一濃縮果汁樣品時(shí)，PCA 培養(yǎng)基上的菌落總數(shù)比測(cè)試片上菌落總數(shù)高的結(jié)果相似。

4 結(jié)論

17 株標(biāo)準(zhǔn)菌株中的枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽胞桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）和多黏類芽胞桿菌（Paenibacilluspolymyxa）在3M-AC 測(cè)試片上有明顯的液化現(xiàn)象，其余標(biāo)準(zhǔn)菌株在PCA 培養(yǎng)基和3 種測(cè)試片上的菌落形態(tài)均較清晰，便于計(jì)數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)菌株3種測(cè)試片的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值與PCA 培養(yǎng)基的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值呈極顯著（P＜0.01）正相關(guān)。對(duì)菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品的PCA 培養(yǎng)基與3 種測(cè)試片的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值進(jìn)行Z比分?jǐn)?shù)評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)結(jié)果均為“滿意”。煙用香精香料樣品的3種測(cè)試片與PCA培養(yǎng)基的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值間差異不顯著（P＞0.05），且MC-AC 測(cè)試片與PCA 培養(yǎng)基的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值相關(guān)性（R2=0.922 8，P＜0.01）最好。測(cè)試片法比平板計(jì)數(shù)法更簡(jiǎn)便、快速。其中，使用MC-AC測(cè)試片檢測(cè)菌落總數(shù)耗時(shí)最短。