HPLC法測(cè)定地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷的含量*

鄭雪媚，蔣順進(jìn)，林 昊，劉宗新

(1 廣東容大生物股份有限公司，廣東 清遠(yuǎn) 511500；2 清遠(yuǎn)一生自然生物研究院有限公司，廣東 清遠(yuǎn) 511500)

地頂孢霉培養(yǎng)物是從野生蟲(chóng)草中分離得到的地頂孢霉菌株，通過(guò)人工發(fā)酵的方式生產(chǎn)出的一種新型綠色的飼料添加劑，富含腺苷、蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草多糖、蟲(chóng)草酸、甾醇等多種活性成分，被譽(yù)為動(dòng)物可以食用的“冬蟲(chóng)夏草”[1-2]。腺苷是一種嘌呤核苷，對(duì)動(dòng)物的心肌具有保護(hù)作用，其含量被用作蟲(chóng)草類(lèi)產(chǎn)品的質(zhì)控指標(biāo)，因此建立完善準(zhǔn)確的質(zhì)量檢測(cè)方法是很有必要的[3]。本研究利用高效液相色譜法測(cè)定地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷的含量，旨在為地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷含量的測(cè)定及蟲(chóng)草類(lèi)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控提供技術(shù)支撐。

參照蟲(chóng)草制品中蟲(chóng)草素和腺苷的測(cè)定高效液相色譜法[4]，根據(jù)腺苷的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，建立測(cè)定地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷含量的HPLC法。該方法具有定量檢測(cè)準(zhǔn)確度高、線(xiàn)性范圍廣、重現(xiàn)性好、分析時(shí)間短、樣品處理簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，為地頂孢霉培養(yǎng)物的質(zhì)量控制提供可靠的依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器和材料

G7111AAgilent液相色譜儀；CTO-20AC柱溫箱；UPR-5T超純水儀；KQ-500DE超聲波清洗器；METTLER MS105DU天平；腺苷標(biāo)準(zhǔn)品(來(lái)源：中國(guó)食品藥品檢定研究院(含量99.4%))；地頂孢霉培養(yǎng)物(來(lái)源：廣東容大生物股份有限公司提供)，水為超純水(來(lái)源：廣東容大生物股份有限公司提供)，乙腈(來(lái)源：科魯?shù)禄す煞萦邢薰?。

1.2 色譜條件

流動(dòng)相：乙腈-水(5∶95)為流動(dòng)相；

色譜柱：菲羅門(mén) C185 μm，4.6 mm×250 mm；

檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；

流速：1.0 mL/min；

柱溫：35 ℃；

進(jìn)樣量：10 μL。

1.3 溶液的配制

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取20 mg腺苷對(duì)照品，置200 mL容量瓶，加超純水至刻度，搖勻，精密移取上述溶液5 mL，置于100 mL容量瓶，加超純水至刻度，搖勻，過(guò)濾，即得。

1.3.2 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取1 g地頂孢霉培養(yǎng)樣品，置100 mL容量瓶，加適量超純水，超聲30 min后定容至刻度，搖勻，過(guò)濾，即得。

1.4 陰性干擾測(cè)定

以相同的處方比例，按照地頂孢霉培養(yǎng)物的制備工藝，制得地頂孢霉培養(yǎng)物的陰性制劑。取地頂孢霉培養(yǎng)物的陰性顆粒適量，按1.3.2項(xiàng)下制成地頂孢霉培養(yǎng)物陰性溶液。進(jìn)樣測(cè)試，結(jié)果陰性溶液無(wú)干擾。證明本方法用于腺苷的含量測(cè)定具有專(zhuān)屬性。

圖1 腺苷對(duì)照品Fig.1 Adenosine reference

圖2 地頂孢霉培養(yǎng)物陰性樣品Fig.2 Acremonium terricola culture negative sample

圖3 地頂孢霉培養(yǎng)物樣品Fig.3 Sample of acremonium terricola culture

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

表1 腺苷對(duì)照品溶液濃度及峰面積Table 1 Adenosine reference solution concentration and peak area

精密稱(chēng)取腺苷對(duì)照品100.4 mg，置1 000 mL容量瓶中，加純化水至刻度使溶解，搖勻，作為對(duì)照品貯備液；分別移取對(duì)照品貯備液0.5、1、2、5、20、100 mL置100 mL容量瓶中，加純化水至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。對(duì)以上6種對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定。記錄色譜圖，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

圖4 腺苷的線(xiàn)性關(guān)系圖Fig.4 Linear plot of adenosine

以腺苷濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，在0.499 0～99.797 6 μg/mL范圍內(nèi)，腺苷濃度與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，其回歸方程為y=26.144x-1.811 9，R2=1。

1.6 精密度試驗(yàn)

精密稱(chēng)取腺苷對(duì)照品20.11 mg，按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含4.997 3 μg腺苷對(duì)照品溶液。連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 腺苷精密度試驗(yàn)Table 2 Adenosine precision test

結(jié)果表明，腺苷峰面積RSD為0.3%，證明本方法的精密度良好。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

1.7.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)定腺苷對(duì)照品20.43 mg，按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含5.076 9 μg腺苷對(duì)照品溶液。

1.7.2 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)定地頂孢霉培養(yǎng)，按1.3.2項(xiàng)下制備供試品溶液，平行處理6份，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 腺苷含量測(cè)定重復(fù)性試驗(yàn)Table 3 Repeatability test for determination of adenosine content

結(jié)果表明，腺苷含量RSD為0.2%，證明本測(cè)試方法重復(fù)性良好。

1.8 回收率試驗(yàn)

1.8.1 對(duì)照品母液的制備

精密稱(chēng)取腺苷對(duì)照品20.17 mg，置200 mL棕色容量瓶中，加純化水至刻度使溶解，作為腺苷對(duì)照品母液。

1.8.2 對(duì)照品溶液的制備

取對(duì)照品母液5 mL，置100 mL容量瓶中，加純化水至刻度，搖勻，過(guò)濾，即得。

精密稱(chēng)取已知含量的同一批地頂孢霉培養(yǎng)樣品約0.5 g(共9份)置于100 mL容量瓶中，分別加入上述對(duì)照品母液1.5 mL、2.5 mL、3.5 mL，加適量超純水，超聲30 min后定容至刻度，過(guò)濾，進(jìn)樣測(cè)定。進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 腺苷回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 4 Adenosine recovery test data

結(jié)果顯示，腺苷回收率的平均值為98.70%，RSD值為0.8%，表明本方法回收率較好。

1.9 腺苷測(cè)定方法的耐用性研究

本試驗(yàn)考察色譜柱溫度、流速、波長(zhǎng)、不同品牌色譜柱及流動(dòng)相比例對(duì)地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷含量測(cè)定的影響。

1.9.1 不同的色譜柱溫度

對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)定腺苷對(duì)照品20.18 mg，按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含5.014 7 μg腺苷對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：取地頂孢霉培養(yǎng)物，按1.3.2項(xiàng)下制備地頂孢霉培養(yǎng)物供試品溶液。

在其它色譜條件不變的情況下，色譜柱溫度分別設(shè)定為30、35、40 ℃，對(duì)同一樣品進(jìn)行含量測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算腺苷含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同色譜柱溫度對(duì)腺苷含量測(cè)定的影響Table 5 Effects of different chromatographic column temperatures on the determination of adenosine content

結(jié)果表明，色譜柱溫度的微小變化對(duì)腺苷含量測(cè)定無(wú)明顯影響。

1.9.2 不同的流速

(1)對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)定腺苷對(duì)照品20.20 mg，按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含5.019 7 μg腺苷對(duì)照品溶液。

(2)供試品溶液的制備

取地頂孢霉培養(yǎng)物，按1.3.2項(xiàng)下制備地頂孢霉培養(yǎng)物供試品溶液。

在其它色譜條件不變的情況下，流動(dòng)相流速分別設(shè)定為0.8、1.0、1.2 mL/min，對(duì)同一樣品進(jìn)行含量測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算腺苷含量，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 不同流動(dòng)相速度對(duì)腺苷含量測(cè)定的影響Table 6 Effect of the velocity of different mobile phases on the determination of adenosine content

結(jié)果表明，流動(dòng)相速度的微小變化對(duì)腺苷含量測(cè)定無(wú)明顯影響。

1.9.3 不同的色譜柱

(1)對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)定腺苷對(duì)照品20.41 mg，按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含5.071 9 μg腺苷對(duì)照品溶液。

(2)供試品溶液的制備：

取地頂孢霉培養(yǎng)物，按1.3.2項(xiàng)下制備地頂孢霉培養(yǎng)物供試品溶液。

在其它色譜條件不變的情況下，使用不同的色譜柱，對(duì)同一樣品進(jìn)行含量測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算腺苷含量，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 不同品牌色譜柱對(duì)腺苷含量測(cè)定的影響Table 7 Effect of different brands of chromatographic columns on the determination of adenosine content

結(jié)果證實(shí)，不同品牌色譜柱對(duì)腺苷的含量測(cè)定無(wú)明顯影響。

1.9.4 不同的測(cè)定波長(zhǎng)

(1)對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)定腺苷對(duì)照品20.25 mg，按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含5.032 1 μg腺苷對(duì)照品溶液。

(2)供試品溶液的制備：

取地頂孢霉培養(yǎng)物，按1.3.2項(xiàng)下制備地頂孢霉培養(yǎng)物供試品溶液。

在其它色譜條件不變的情況下，測(cè)定波長(zhǎng)分別設(shè)定為257、258、259、260、261、262、263 nm，對(duì)同一樣品進(jìn)行含量測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算腺苷含量，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 不同測(cè)定波長(zhǎng)對(duì)腺苷含量測(cè)定的影響Table 8 Effect of different determination wavelengths on the determination of adenosine content

結(jié)果表明，測(cè)定波長(zhǎng)的微小變化對(duì)腺苷含量測(cè)定無(wú)明顯影響。

1.9.5 不同的流動(dòng)相比例

(1)對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)定腺苷對(duì)照品20.63 mg，按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含5.126 6 μg腺苷對(duì)照品溶液。

(2)供試品溶液的制備

表9 不同流動(dòng)相比例對(duì)腺苷含量測(cè)定的影響Table 9 Effect of the proportions of different mobile phases on the determination of adenosine content

取地頂孢霉培養(yǎng)物，按1.3.2項(xiàng)下制備地頂孢霉培養(yǎng)物供試品溶液。

在其他色譜條件不變的情況下，流動(dòng)相乙腈-水比例分別設(shè)定為2.5∶97.5、5∶95、7.5∶92.5，對(duì)同一樣品進(jìn)行含量測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算腺苷含量，結(jié)果見(jiàn)表9。

結(jié)果表明，流動(dòng)相比例的微小變化對(duì)腺苷含量測(cè)定無(wú)明顯影響。

小結(jié)：采用本方法能準(zhǔn)確測(cè)定地頂孢霉培養(yǎng)物中的腺苷的含量，方法的耐用性較好。

2 結(jié) 論

徐娟娟等[5]建立了測(cè)定地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷含量的高效液相色譜法，該方法對(duì)地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷含量檢測(cè)方法的波長(zhǎng)、線(xiàn)性、精密度、回收率等進(jìn)行了研究，在此基礎(chǔ)上，本方法增加了專(zhuān)屬性、耐用性(色譜柱溫度、流速、波長(zhǎng)、不同品牌色譜柱及流動(dòng)相比例對(duì)地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷含量測(cè)定的影響)等的研究。劉書(shū)余等[6]建立了同時(shí)測(cè)定地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷、蟲(chóng)草素和麥角甾醇含量的高效液相色譜法，但該方法采用梯度洗脫，分析時(shí)間較長(zhǎng)。本研究建立了HPLC法測(cè)地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷的含量，測(cè)定色譜條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相為乙腈-水(5∶95)；檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。本方法定量檢測(cè)準(zhǔn)確度高、線(xiàn)性范圍廣、重現(xiàn)性好、分析時(shí)間短、樣品處理簡(jiǎn)單，為地頂孢霉培養(yǎng)物質(zhì)量控制提供了依據(jù)。