冬凌草甲素聯(lián)合免疫因子TRAF4 對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬和凋亡的影響及機(jī)制研究

羅帥，陳勇

（上海健康醫(yī)學(xué)院附屬崇明中心醫(yī)院，上海 202150）

根據(jù)病理表現(xiàn)可以將肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌全部的80%～85%[1]。雖然醫(yī)學(xué)上已經(jīng)取得了進(jìn)步，但是非小細(xì)胞肺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍是當(dāng)前其治療的難點(diǎn)[2-3]。冬凌草又稱為冰凌草，性微寒，甘微苦，常用于治療咽喉腫痛、蛇蟲咬傷和扁桃體炎等疾病[4]，具有多種化學(xué)活性，如冬凌草甲素具有明顯的抗腫瘤效果[5]。有研究結(jié)果顯示，冬凌草甲素抑制肺癌細(xì)胞A549 的增殖[6]，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的自噬小體的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子4（TRAF4）位于染色體17q11-12 上，與腫瘤壞死受體家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-370 通過靶向負(fù)調(diào)控TRAF4 抑制肺癌細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[9]。但是關(guān)于冬凌草甲素是否能夠聯(lián)合TRAF4 影響非小細(xì)胞肺癌的研究尚不明確，因此，本研究通過體外培養(yǎng)A549 細(xì)胞，探討冬凌草甲素聯(lián)合TRAF4 對(duì)細(xì)胞自噬和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 A549 細(xì)胞購自美國(guó)ATCC公司；冬凌草甲素購于成都普菲德公司；DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購于Hyclone 公司；噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒購于北京索萊寶公司；Lipofectamine 2000 試劑盒購于賽默飛世爾公司；si-NC、si-TRAF4、pcDNA、TRAF4 購于廣州銳博生物公司；凋亡試劑盒購于江蘇凱基生物公司；B 細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）相關(guān)X 蛋白（Bax）抗體、Bcl-2 抗體、微管相關(guān)蛋白1 的輕鏈3（LC3）Ⅱ抗體、LC3Ⅰ抗體、Beclin 1 抗體、ATG7 抗體、TRAF4 抗體、GAPDH 抗體購于美國(guó)Abcam 公司；熒光定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol試劑購于Promega 公司；引物購于上海吉瑪公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，A549細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基。細(xì)胞匯合率為80%時(shí)，采用胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。

1.3 噻唑藍(lán)（MTT）檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549 細(xì)胞并接種在96 孔板中。過夜培養(yǎng)后，細(xì)胞與0、1、5、10、20、50 μmol/L 的冬凌草甲素孵育48 h。隨后，細(xì)胞與MTT 試劑孵育4 h，然后用二甲基亞砜（DMSO）試劑溶解結(jié)晶。利用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值，評(píng)估細(xì)胞活力。

1.4 細(xì)胞分組 A549 細(xì)胞接種6孔板內(nèi)（1×105個(gè)/mL），細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后加入0、20 μmol/L 的冬凌草甲素，記為對(duì)照組、冬凌草甲素組。按照Lipofectamine 2000 說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。A549 細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-TRAF4和si-NC，記為si-TRAF4 組、si-NC 組；將pcDNA和TRAF4 轉(zhuǎn)染至A549 細(xì)胞后，采用20 μmol/L 的冬凌草甲素處理，記為冬凌草甲素+pcDNA 組、冬凌草甲素+TRAF4 組。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取1．4 各組A549細(xì)胞，取1 mL 細(xì)胞液添加至500 μL 結(jié)合緩沖液內(nèi)，用于制備細(xì)胞懸液。細(xì)胞與Annexin V-FITC 和PI試劑孵育，利用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.6 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)蛋白表達(dá) 取1．4 中各組A549 細(xì)胞4 ℃裂解30 min，然后經(jīng)過12 000 r/min（離心半徑為15 cm）離心10 min，收集細(xì)胞上清液，根據(jù)BCA 法定量蛋白濃度，在95 ℃變性7 min。取蛋白樣品經(jīng)過凝膠電泳處理，轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后封閉培養(yǎng)1．5 h，洗膜3 次，加入Bax、Bcl-2、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin 1、ATG7 和TRAF4 抗體于4 ℃過夜培養(yǎng)，洗膜3 次，加入二抗，室溫培養(yǎng)1．5 h，滴加提前配置的顯影液，顯色、曝光。用Image J 軟件分析蛋白條帶。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)mRNA 表達(dá) 利用Trizol 試劑提取總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 樣品的濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄法合成cDNA，然后根據(jù)熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。以GAPDH 為內(nèi)參，分析采用2-ΔΔCt公式計(jì)算TRAF4 mRNA 表達(dá)量。TRAF4 上游引物為：5’-CATCCACAGTGAGGAGGGCT-3’，下游引物為：5’-TTCATGGGGCAGCGATTAG-3’；GAPDH 上游引物為：5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’，下游引物為：5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21．0 軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0．05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度冬凌草甲素對(duì)A549 細(xì)胞活力的影響 評(píng)估濃度為0、1、5、10、20、50 μmol/L 的冬凌草甲素對(duì)A549 細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示，A549 細(xì)胞活力隨著冬凌草甲素濃度的上升而逐漸下降（P＜0．05）。A549 細(xì)胞半數(shù)抑制率（IC50）為22．4 μmol/L，因此本研究選擇20 μmol/L 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表1。

表1 不同濃度冬凌草甲素對(duì)A549 細(xì)胞活力的影響（±s）Tab.1 Effects of different concentrations of oridonin on A549 cell viability（±s）

表1 不同濃度冬凌草甲素對(duì)A549 細(xì)胞活力的影響（±s）Tab.1 Effects of different concentrations of oridonin on A549 cell viability（±s）

注：與0 μmol/L 組比較，*P＜0．05

冬凌草甲素濃度細(xì)胞活力0 μmol/L99．2±8．7 1 μmol/L91．2±8．2*5 μmol/L83．2±7．9*10 μmol/L68．4±7．2*20 μmol/L46．5±5．3*50 μmol/L32．4±3．8*F 124．516 P 0．000

2.2 冬凌草甲素對(duì)A549 細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組相比，冬凌草甲素組的細(xì)胞凋亡率、Bax 水平顯著升高（P＜0．05），Bcl-2 水平顯著下降（P＜0．05）。見圖1、表2。

圖1 冬凌草甲素對(duì)A549 細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effect of oridonin on apoptosis of A549 cells

表2 冬凌草甲素對(duì)A549 細(xì)胞凋亡的影響（±s）Tab.2 Effect of oridonin on the apoptosis of A549 cells（±s）

表2 冬凌草甲素對(duì)A549 細(xì)胞凋亡的影響（±s）Tab.2 Effect of oridonin on the apoptosis of A549 cells（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0．05。

組別細(xì)胞凋亡率（%）BaxBcl-2對(duì)照組7．5±0．90．23±0．020．85±0．06冬凌草甲素組23．4±1．9*0．77±0．07*0．35±0．04*t 22．68922．25220．801 P 0．0000．0000．000

2.3 冬凌草甲素對(duì)A549 細(xì)胞自噬的影響 與對(duì)照組相比，冬凌草甲素組的Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和ATG7 蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0．05）。見圖2、表3。

圖2 冬凌草甲素對(duì)A549 細(xì)胞自噬的影響Fig.2 Effect of oridonin on autophagy in A549 cells

表3 冬凌草甲素對(duì)A549 細(xì)胞自噬的影響（±s）Tab.3 Effect of oridonin on autophagy in A549 cells（±s）

表3 冬凌草甲素對(duì)A549 細(xì)胞自噬的影響（±s）Tab.3 Effect of oridonin on autophagy in A549 cells（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0．05。

組別Beclin 1LC3Ⅱ/LC3ⅠATG7對(duì)照組0．27±0．030．32±0．040．22±0．02冬凌草甲素組0．68±0．06*1．25±0．11*0．64±0．05*t 18．33623．83723．398 P 0．0000．0000．000

2.4 冬凌草甲素對(duì)A549 細(xì)胞中TRAF4 表達(dá)的影響 qRT-PCR 和Western Blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，冬凌草甲素組的TRAF4 mRNA 和蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0．05）。見圖3、表4。

圖3 冬凌草甲素對(duì)TRAF4 蛋白水平的影響Fig.3 Effect of oridonin on TRAF4 protein level

表4 冬凌草甲素對(duì)TRAF4 水平的影響（±s）Tab.4 Effect of oridonin on TRAF4 levels（±s）

表4 冬凌草甲素對(duì)TRAF4 水平的影響（±s）Tab.4 Effect of oridonin on TRAF4 levels（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0．05。

組別TRAF4 mRNATRAF4 蛋白對(duì)照組0．95±0．070．71±0．07冬凌草甲素組0．41±0．04*0．33±0．03*t 20．09414．969 P 0．0000．000

2.5 干擾TRAF4 對(duì)A549 細(xì)胞凋亡和自噬的影響 與si-NC 組相比，si-TRAF4 組的TRAF4 mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0．05），細(xì)胞凋亡率、Bax、Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和ATG7 水平顯著上升（P＜0．05），Bcl-2 水平顯示下降（P＜0．05）。見圖4、表5。

圖4 干擾TRAF4 對(duì)A549 細(xì)胞凋亡和自噬的影響Fig.4 Effect of interference TRAF4 on apoptosis and autophagy in A549 cells

表5 干擾TRAF4 對(duì)A549 細(xì)胞凋亡和自噬的影響（±s）Tab.5 Effects of interfering with TRAF4 on apoptosis and autophagy in A549 cells（±s）

表5 干擾TRAF4 對(duì)A549 細(xì)胞凋亡和自噬的影響（±s）Tab.5 Effects of interfering with TRAF4 on apoptosis and autophagy in A549 cells（±s）

注：與si-NC 組比較，*P＜0．05。

組別TRAF4 mRNA TRAF4 蛋白 細(xì)胞凋亡率（%）BaxBcl-2Beclin 1LC3Ⅱ/LC3IATG7 si-NC0．92±0．070．77±0．057．3±0．70．32±0．040．63±0．060．30±0．020．44±0．050．36±0．03 si-TRAF40．37±0．04*0．35±0．03*22．4±2．1*0．59±0．06*0．34±0．03*0．61±0．05*1．32±0．13*0．65±0．06*t 20．46621．60920．46411．23312．96917．27018．95412．969 P 0．0000．0000．0000．0000．0000．0000．0000．000

2.6 冬凌草甲素聯(lián)合免疫因子TRAF4 對(duì)A549 細(xì)胞凋亡和自噬的影響 與冬凌草甲素+pcDNA 組相比，冬凌草甲素+TRAF4 組的TRAF4 mRNA 和蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0．05），細(xì)胞凋亡率、Bax、Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和ATG7 水平顯著下降（P＜0．05），Bcl-2 水平顯示上升（P＜0．05）。見圖5、表6。

圖5 冬凌草甲素聯(lián)合免疫因子TRAF4 對(duì)A549 細(xì)胞凋亡和自噬的影響Fig.5 Effect of oridonin combined with immunizing factor TRAF4 on apoptosis and autophagy in A549 cells

表6 冬凌草甲素聯(lián)合免疫因子TRAF4 對(duì)A549 細(xì)胞凋亡和自噬的影響（±s）Tab.6 Effects of oridonin combined with immunizing factor TRAF4 on apoptosis and autophagy in A549 cells（±s）

注：與冬凌草甲素+pcDNA 組比較，*P＜0．05。

組別TRAF4 mRNA TRAF4 蛋白細(xì)胞凋亡率（%）BaxBcl-2Beclin 1LC3Ⅱ/LC3ⅠATG7冬凌草甲素+pcDNA0．36±0．030．29±0．0222．7±2．10．82±0．070．33±0．030．72±0．061．29±0．130．68±0．06冬凌草甲素+TRAF40．68±0．07*0．52±0．04*14．3±1．2*0．47±0．05* 0．66±0．05* 0．47±0．04*0．85±0．07*0．40±0．04*t 12．60515．42910．41912．20616．97810．4018．94011．649 P 0．0000．0000．0000．0000．0000．0000．0000．000

3 討論

冬凌草甲素是從冬凌草二萜類化合物內(nèi)提取分離而來的，具有明顯的抗腫瘤作用，如抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等[10]。吳楠等[11]研究結(jié)果顯示，冬凌草甲素通過抑制TPX2 促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的凋亡，阻滯細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素在宮頸癌研究中可以抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)線粒體凋亡[12]。黃陳翼等[13]在研究骨髓瘤中發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素通過抑制磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞的凋亡和抑制細(xì)胞增殖。本研究采用不同濃度（0、1、5、10、20、50 μmol/L）冬凌草甲素作用A549 細(xì)胞，MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的活力，結(jié)果顯示，冬凌草甲素呈劑量效應(yīng)降低，因此本研究采用20 μmol/L（接近IC50濃度）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)冬凌草甲素作用A549細(xì)胞后的機(jī)制研究。

凋亡在癌癥的發(fā)展中具有重要的作用，Bax 和Bcl-2 是Bcl-2 家族的成員，Bax 在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)起到促進(jìn)作用，其過度表達(dá)可與Bcl-2 拮抗促使細(xì)胞發(fā)生凋亡[14]。自噬在細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)發(fā)育中至關(guān)重要，是一個(gè)進(jìn)化保守的饑餓應(yīng)答過程，Beclin 1 是一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可將LC3 自噬蛋白轉(zhuǎn)移至自噬體膜內(nèi)間接促進(jìn)細(xì)胞的自噬[15-16]。LC3 是自噬標(biāo)志的相關(guān)蛋白，主要兩種亞型LC3Ⅱ、LC3Ⅰ，LC3Ⅰ沒有活性，LC3Ⅱ可與線粒體受體蛋白結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞的自噬；LC3Ⅱ與LC3Ⅰ比值可以反映自噬體情況[17-18]。此外，LC3-I 被Atg7 活化，然后在膜內(nèi)與磷脂酰乙醇胺（PE）偶聯(lián)生成被加工的LC3-Ⅱ。本研究結(jié)果顯示，冬凌草甲素能促進(jìn)細(xì)胞的凋亡率，上調(diào)Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1、ATG7 蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，提示冬凌草甲素可以誘導(dǎo)A549 細(xì)胞的凋亡和自噬。

TRAF4 在多種細(xì)胞高表達(dá)，是一種致癌基因，最早在乳腺癌內(nèi)發(fā)現(xiàn)，可以廣泛參與癌細(xì)胞的發(fā)展，通過抑制TRAF4 抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡等[19-20]。陳剛等[21]研究結(jié)果顯示，TRAF4 在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)上調(diào)，生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)顯示TRAF4 是miR-615-5p 的靶標(biāo)，miR-615-5p 通過靶向負(fù)調(diào)控TRAF4 發(fā)揮在非小細(xì)胞肺癌中的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，利用干擾沉默技術(shù)，干擾TRAF4通過抑制Notch1 通路促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡和抑制細(xì)胞增殖[22]。本研究結(jié)果顯示，冬凌草甲素作用A549 細(xì)胞后，TRAF4 mRNA 和蛋白表達(dá)下調(diào)，抑制TRAF4 明顯增加細(xì)胞凋亡率，下調(diào)TRAF4 mRNA 和蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1、ATG7蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2 蛋白表達(dá)，說明抑制TRAF4可以促進(jìn)A549 細(xì)胞的凋亡和自噬。深一步研究結(jié)果顯示，過表達(dá)TRAF4 可以逆轉(zhuǎn)冬凌草甲素對(duì)A549細(xì)胞的凋亡和自噬的影響，提示冬凌草甲素通過聯(lián)合TRAF4 發(fā)揮在非小細(xì)胞肺癌中的作用。

綜上所述，冬凌草甲素能夠促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡和自噬，其作用機(jī)制可能與下調(diào)TRAF4有關(guān)。本研究探究了冬凌草甲素靶向治療非小細(xì)胞肺癌的分子理論基礎(chǔ)，然而，其是否還有其他途徑參與冬凌草甲素的抗癌作用仍需要深入探索。