★ 蘇星 陳劍平 胡嬌嬌 黃靜萍 黃恩堂（.鷹潭市綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心 江西 鷹潭 335000；.江西省藥品檢查員中心 南昌 33009）

痢瀉靈片是由拳參、穿心蓮、苦參3 味中藥組成的中成藥，具有清熱解毒、止痢、止瀉的功效，用于熱瀉、濕熱痢疾等癥［1］。痢瀉靈片現(xiàn)收載于國(guó)家衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)《中藥成方制劑》（第二冊(cè)），僅有檢查項(xiàng)目，無(wú)專屬鑒別檢查和含量測(cè)定方法。近些年對(duì)痢瀉靈片的檢驗(yàn)方法研究較少，文獻(xiàn)也并不多見(jiàn)?，F(xiàn)行的痢瀉靈片文獻(xiàn)報(bào)道多針對(duì)其中的1~2 種成分進(jìn)行含量測(cè)定研究［2-5］，而中成藥復(fù)方制劑具有多成分、多靶點(diǎn)，成分間相互協(xié)調(diào)、相互制約，整體作用等特點(diǎn)，現(xiàn)有的單成分質(zhì)量控制方法難以全面反映其整體質(zhì)量。

中藥指紋圖譜是目前綜合評(píng)價(jià)中藥及其制劑的常用方法，具有整體性好、信息量大、特征性強(qiáng)等特點(diǎn)［6］，結(jié)合聚類分析、主成分分析等化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法可為中藥、特別是中成藥復(fù)方制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供更多的、更多維的信息。

本研究首次將中藥指紋圖譜技術(shù)與HPLC 法定量測(cè)定及化學(xué)計(jì)量學(xué)分析法相結(jié)合，用于痢瀉靈片的質(zhì)量控制，通過(guò)中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件對(duì)不同廠家不同批次的痢瀉靈片指紋圖譜相似度進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)采用聚類分析和主成分分析法對(duì)10 批痢瀉靈片的質(zhì)量進(jìn)行分析。在此基礎(chǔ)上建立了一個(gè)同時(shí)測(cè)定痢瀉靈片中苦參堿、氧化苦參堿、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量測(cè)定方法，為更好地對(duì)痢瀉靈片質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)管和控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（四元泵，UV檢測(cè)器，美國(guó)Agilent 公司）；MSE125P-1CE-DU型電子天平（精度0.01 mg，賽多利斯科學(xué)儀器〈北京〉有限公司）；MSE224S-1CE-DU 型電子天平（精度0.1 mg，賽多利斯科學(xué)儀器〈北京〉有限公司）；KQ-500DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與試藥

甲醇、乙腈均為色譜純；其他試劑均為分析純，水為超純水。對(duì)照品：苦參堿（批號(hào)：110805-201709，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.7%）、氧化苦參堿（批號(hào)：110780-201508，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為92.5%）、穿心蓮內(nèi)酯（批號(hào)：110797-201609，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%）、脫水穿心蓮內(nèi)酯（批號(hào)：110854-201710，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.4%）。對(duì)照藥材：苦參（批號(hào)：121019-201708）、穿心蓮（批號(hào)：121082-201706）、拳參（批號(hào)：121569-201602）。對(duì)照品及對(duì)照藥材均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，10 批痢瀉靈片均購(gòu)自市場(chǎng)。見(jiàn)表1。

表1 10批痢瀉靈片的具體信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse plus C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）；以乙腈-0.01 mol/L 乙酸銨溶液（濃氨試液調(diào)pH 8.1）（3∶2）為流動(dòng)相A，0.01 mol/L醋酸銨溶液（用氨試液調(diào)pH 8.1）為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0~10 min，5%~10%A；10~30 min，10%~25%A；30~45 min，25%~40%A；45~70 min，40%~50%A；70~80 min，50%~55%A；80~90 min，55%~60%A；90~95 min，60%~5%A）；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為225 nm；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。在該條件下，混合對(duì)照品溶液及痢瀉靈片樣品溶液的HPLC 色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 典型液相色譜圖

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

取苦參堿、氧化苦參堿、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋成濃度分別為0.098 5、0.076 7、0.018 4、0.020 2 mg/mL 的對(duì)照品混合溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品20 片，除去包衣，研成細(xì)粉，精密稱取2.400 g，置具塞錐形瓶中，精密加入三氯甲烷50 mL及氨水1 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用三氯甲烷補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液10 mL，加在中性氧化鋁柱（200~300 目，8 g，內(nèi)徑15 mm）上，用15 mL 三氯甲烷洗脫后，繼續(xù)用三氯甲烷-甲醇（3∶7）15 mL 洗脫，合并洗脫液，揮去溶劑，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜?0 mL，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 苦參和穿心蓮陰性樣品的制備

按處方比例分別配制苦參和穿心蓮陰性樣品，照“2.3”項(xiàng)下的供試品制備方法進(jìn)行處理，即得苦參和穿心蓮陰性樣品。

2.5 單味藥材供試品溶液的制備

取苦參、穿心蓮、拳參粉末各2.4 g，按照“2.3”項(xiàng)下的供試品制備方法進(jìn)行處理，即得各單味藥材供試品溶液。

2.6 指紋圖譜研究

2.6.1 精密度試驗(yàn) 取同一痢瀉靈片供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄色譜圖，以9 號(hào)穿心蓮內(nèi)酯色譜峰為參照峰，計(jì)算得到各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0.11%~4.76%之間，相對(duì)峰面積RSD值在1.30%~3.06%之間，均＜5%，表明儀器精密度良好。

2.6.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取痢瀉靈片適量，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以9 號(hào)穿心蓮內(nèi)酯色譜峰為參照峰，計(jì)算得到各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0.18%~4.58%之間，相對(duì)峰面積RSD值在0.44%~1.05%之間，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一痢瀉靈片供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣，記錄色譜圖，以9 號(hào)穿心蓮內(nèi)酯色譜峰為參照峰，計(jì)算得到各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0.40%~4.68%之間，相對(duì)峰面積RSD值在1.13%~3.67%之間，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.4 指紋圖譜的建立 取10 批痢瀉靈片樣品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，以1 號(hào)樣品色譜圖為參照?qǐng)D譜，采用平均數(shù)法，經(jīng)全譜峰匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜（R），10 批痢瀉靈片指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度分別為0.996、0.996、0.963、0.921、0.996、0.996、0.997、0.997、0.997、0.997，符合指紋圖譜研究要求。見(jiàn)圖2。

圖2 10批痢瀉靈片HPLC指紋圖譜（S1～S10）和對(duì)照指紋圖譜（R）

取單味藥材溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖3。結(jié)合前述苦參與穿心蓮陰性樣品的色譜圖，對(duì)痢瀉靈片樣品溶液色譜圖中的峰進(jìn)行歸屬，共確定了13 個(gè)共有峰，其中1~8 來(lái)自苦參，9~12 來(lái)自穿心蓮，13 號(hào)峰未進(jìn)行歸屬。

圖3 單味藥材溶液的HPLC色譜圖

2.6.5 聚類分析 將10 批痢瀉靈片的共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 25.0 軟件進(jìn)行聚類分析［6-7］，采用系統(tǒng)聚類法，10 批痢瀉靈片可以分為3 類，S4、S5、S6、S7為第1 類，S3、S8、S9、S10為第2 類，S1和S2為第3 類，這與表1 中10 批樣品的生產(chǎn)廠家來(lái)源相符，說(shuō)明相同廠家生產(chǎn)的痢瀉靈片的質(zhì)量穩(wěn)定，而不同生產(chǎn)廠家不同批次痢瀉靈片的質(zhì)量存在差異，這可能與廠家所用中藥材的產(chǎn)地、采收時(shí)間、加工、運(yùn)輸、存儲(chǔ)有關(guān)。見(jiàn)圖4。

圖4 10批痢瀉靈片的聚類分析圖

2.6.6 主成分分析 采用 SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件將10 批痢瀉靈片13 個(gè)共有峰的峰面積做標(biāo)準(zhǔn)化處理后，以主成分的特征值和貢獻(xiàn)率為依據(jù)，對(duì)其進(jìn)行主成分分析［7］。為使分析結(jié)果更加直觀，主成分分析選取3個(gè)主成分，特征值分別為7.141、4.465、1.159，累積方差貢獻(xiàn)率分別是54.929%、89.272%、98.184%。見(jiàn)表2。

表2 特征值和方差貢獻(xiàn)率

10 批痢瀉靈片根據(jù)主成分得分Z1、Z2、Z3作散點(diǎn)圖分析其聚類結(jié)果。主成分分析聚類結(jié)果見(jiàn)圖5，在主成分空間中距離較近的為同類樣本，距離較遠(yuǎn)的為不同類樣本。結(jié)果表明10 批痢瀉靈片中，S4~S7聚在一起為一類，S8、S9、和S10距離極近，歸為一類，S3距離S8~S10更近，S1和S2距離其他樣本均較遠(yuǎn)，此結(jié)果與聚類分析結(jié)果較一致。

圖5 10批痢瀉靈片主成分分析散點(diǎn)圖

2.7 4 種組分的含量測(cè)定

2.7.1 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件依次進(jìn)樣2、5、10、15、20、25 μL，記錄色譜峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所測(cè)的4 種成分在各自的進(jìn)樣量范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。見(jiàn)表3。

表3 痢瀉靈片中4種成分的線性關(guān)系

2.7.2 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄色譜圖，計(jì)算得到苦參堿、氧化苦參堿、穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積的RSD值分別為0.53%、0.92%、0.36%、0.53%，表明儀器的精密度良好。

2.7.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取痢瀉靈片適量，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算得到上述4 種成分含量，RSD值分別為2.65%、2.14%、2.32%和2.33%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取痢瀉靈片供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算得到上述4種成分峰面積RSD分別為0.99%、1.71%、0.64%、0.68%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 稱取已知含量的樣品6 份（1 號(hào)樣品，含量為含苦參堿0.287 mg/g，含氧化苦參堿0.129 mg/g，穿心蓮內(nèi)酯0.125 mg/g，脫水穿心蓮內(nèi)酯0.012 mg/g），每份1.200 g（供試品稱樣量的1/2），分別精密加入適量濃度的混合對(duì)照品溶液（含0.387 7 mg/mL 苦參堿，0.178 7 mg/mL 氧化苦參堿，0.183 4 mg/mL 穿心蓮內(nèi)酯和0.013 1 mg/mL 脫水穿心蓮內(nèi)酯）1 mL，按供試品溶液的制備方法操作，并按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算回收率，苦參堿、氧化苦參堿、穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的平均回收率分別為104.7%、96.1%、108.2%、92.2%，RSD分別為2.76%、2.27%、3.25%和1.97%，符合《中國(guó)藥典》要求，表明該方法準(zhǔn)確性良好。見(jiàn)表4。

表4 4種成分加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.7.6 樣品測(cè)定 精密稱取痢瀉靈片粉末，按“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品中苦參堿、氧化苦參堿、穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量。見(jiàn)表5。

表5 痢瀉靈片中4種成分的含量測(cè)定結(jié)果 μg/g

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

查閱文獻(xiàn)［2-4］，并進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，痢瀉靈片中苦參堿、氧化苦參堿、穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的最大吸收波長(zhǎng)在219、339、224、249、214 nm，通過(guò)比較各波長(zhǎng)下的色譜圖發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)波長(zhǎng)為225 nm 時(shí)，痢瀉靈片色譜圖中色譜峰最多，分離度也適合，并且各特征峰的峰型較好，故而在進(jìn)行指紋圖譜研究時(shí)選擇225 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 色譜條件的選擇

前期查閱文獻(xiàn)，2015 年版《中國(guó)藥典》一部中苦參的含量測(cè)定采用的是氨基柱，而2020 年版《中國(guó)藥典》一部采用的是C18柱梯度洗脫，嘗試藥典的兩種方法以及一些文獻(xiàn)方法［2-5］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用氨基柱的方法重現(xiàn)性差，而C18柱梯度洗脫法的結(jié)果重現(xiàn)性較好，結(jié)果較為穩(wěn)定，根據(jù)峰分離情況，選擇C18柱及梯度洗脫的方法。

3.3 供試品制備方法的選擇

分別對(duì)提取溶劑（甲醇、乙醇或三氯甲烷）、提取方法（加熱回流或超聲）和最后中性氧化鋁柱的洗脫溶劑（不同比例甲醇和三氯甲烷混合溶液）進(jìn)行考察，比較4 個(gè)待測(cè)組分的峰面積，最終選定“2.3”項(xiàng)下的樣品制備方法。

3.4 指紋圖譜及含量測(cè)定

本研究建立了痢瀉靈片的HPLC 指紋圖譜，共發(fā)現(xiàn)13 個(gè)共有峰，與對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)，指認(rèn)出其中的4 個(gè)，10 批痢瀉靈片與對(duì)照?qǐng)D譜之間的相似度均高于0.9，所建立的指紋圖譜方法穩(wěn)定可靠。10 批痢瀉靈片的含量測(cè)定結(jié)果存在較大的差異，苦參堿、氧化苦參堿、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量分別是77.5~302.8 μg/g、4.0~171.7 μg/g、86.0~160.7 μg/g、2.9~40.3 μg/g。從結(jié)果來(lái)看，不同樣品間4 種成分的含量差別較大，其中樣品3 的氧化苦參堿含量極低，樣品8~10 的脫水穿心蓮內(nèi)酯含量也極低，提示不同廠家生產(chǎn)中投料的藥材質(zhì)量參差不齊，該品種的質(zhì)量需要得到更為嚴(yán)格的控制。

綜上，本研究所建立的用于控制痢瀉靈片質(zhì)量的HPLC 指紋圖譜和含量測(cè)定方法穩(wěn)定可靠，可為其質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。