黃芪建中湯對脾胃虛寒證胃潰瘍大鼠胃黏膜保護作用的機制研究

周賽男，劉 琴，周 姝，韓運宗，陳思清，符 佳*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410208

胃潰瘍（gastric ulcer, GU）是常見的胃腸道疾病之一，每年影響全球超過1 萬人口，其嚴(yán)重則可能引起胃出血、胃穿孔，甚至也有產(chǎn)生癌變的傾向[1]。近年，由于生活水平的提高以及飲食習(xí)慣的改變，GU 的發(fā)病趨于年輕化，并且發(fā)病率有所上升。 盡管目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療GU 的手段能在一定程度上緩解胃黏膜損傷的狀況，但仍有復(fù)發(fā)率高、不良反應(yīng)明顯的局限性[2]。

黃芪建中湯是記載于《金匱要略》的經(jīng)典方劑，其基于GU 脾胃虛寒之病機和“脾主衛(wèi)”的理論組方，臨床治療GU 效果滿意[3-4]。 研究發(fā)現(xiàn)，黃芪建中湯有抗炎和促進胃黏膜修復(fù)與愈合的作用[5-6]，然而其具體機制有待進一步研究。

GU 發(fā)病機制尚未完全明了，胃黏膜防御機制和攻擊機制的失衡是誘導(dǎo)其發(fā)病的關(guān)鍵[7]。 研究表明[8-10]，HGF/c-Met 通路在胃上皮細(xì)胞廣泛分布，是介導(dǎo)PI3K/AKT 信號途徑的起始點；HGF 與c-Met受體結(jié)合后，c-Met 自身的酪氨酸發(fā)生磷酸化，進而激活PI3K/AKT 信號通路中的關(guān)鍵分子，進而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移及有絲分裂等多個過程，發(fā)揮修復(fù)黏膜損傷、調(diào)節(jié)免疫的功能。 研究證實[11]，白細(xì)胞介素-18（interleukin-18, IL-18）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）均為促炎因子，其釋放過多可產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，誘發(fā)或加重GU。 本研究旨在通過檢測GU 模型大鼠血清炎癥因子及胃組織中HGF、c-Met、PI3K、AKT、EGFR 等的表達，探討黃芪建中湯治療GU 的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

7 周齡Wistar 大鼠60 只，均為雄性，體質(zhì)量190～210 g。實驗動物購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK（湘）2019-0004]。 分籠喂養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心（清潔級），溫度為24～26 ℃且濕度維持在50%～70%，明暗各12 h/d，喂普通的飼料，自由攝水。本研究由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（ZYFY20190120）。

1.2 藥物及制備

奧美拉唑腸溶片（阿斯利康制藥有限公司，批號：02002750）。 黃芪建中湯（飴糖30 g、大棗6 枚、生姜9 g、炙甘草6 g、桂枝9 g、芍藥18 g、黃芪22 g）；小承氣湯（大黃12 g、厚樸6 g、枳實9 g），全部中藥均來自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。 藥物經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院龍紅萍副研究員進行鑒定，均符合《中華人民共和國藥典》要求。 中藥湯液制備法：將上述藥材使用蒸餾水浸泡30 min 后，再煎煮2 次，混合后趁熱過濾，最后對藥液進行濃縮（每1 mL 藥液含1 g 生藥），低溫存放。

1.3 主要試劑

HGF 抗體（英國Abcam 公司，批號：ab134152）；c-Met 抗體、ERK1/2 抗體（美國affinity 公司，批號：25869-1-AP）；TNF-α、IL-1β、IL-6 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號分別為CSB-E11987r、CSB-E08055r、CSB-E04640r）；PI3K 抗體（美國CST公司，批號：4249）；p-AKT 抗體、AKT 抗體（美國Proteintech 公司，批號分別為66444-1-Ig、10176-2-AP）；EGFR 抗體（英國abcam 公司，批號：ab52894）；瓊脂糖（西班牙BIOWEST 公司，批號：111860）。

1.4 主要儀器

光學(xué)顯微鏡（Motic 儀器公司，型號：B10T）；酶標(biāo)儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，型號：MB-530）；水平瓊脂糖電泳槽（中國北京六一公司， 型號：DY CP-31DN）；精密pH 計（中國雷磁公司，型號：PHS-3C）；切片刀（萊卡公司，型號：M199）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司，型號：DHP-500）。

2 方法

2.1 分組

將實驗大鼠隨機分成正常組、模型組、中藥組和西藥組。 每組15 只。

2.2 造模

據(jù)參考文獻[12]復(fù)制模型，對大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，先以小承氣湯隔日灌胃1 次，灌胃當(dāng)天不喂食，次日不限飲食，共10 d。 于第11 日時，禁食但允許自由飲水24 h 后，用耗氣破氣法+饑飽失常法+冰醋酸法建立GU 大鼠模型，即將大鼠用戊巴比妥（30 mg/kg）麻醉處理后固定在鼠板上，在無菌操作下，從左肋下縱行切開腹壁，輕拉出全胃，把一根塑料管（直徑約6 mm）垂直放在胃前壁漿膜面與竇體交匯處，倒入冰醋酸灼燒胃1 min，使用適量生理鹽水輕輕擦拭后，還納胃至腹腔，縫合傷口，同時涂紅霉素眼膏抗感染。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)[13]：胃黏膜損傷指數(shù)升高、胃黏膜絨毛間有明顯的出血發(fā)生，伴有黏液細(xì)胞嚴(yán)重脫落。

2.3 給藥

中藥組灌以黃芪建中湯10 mL/（kg·d），即6.8 g/（kg·d）， 劑量根據(jù)人類劑量33 g/d 以及人和大鼠體表面積換算；西藥組灌以奧美拉唑10 mL/（kg·d），即4.2 mg/（kg·d），劑量根據(jù)人類40 mg/d 以及人和大鼠體表面積換算。 另外兩組則灌以等體積蒸餾水。 用10 mL/kg 的體積喂各組大鼠，1 次/d，共持續(xù)藥物干預(yù)20 d。

2.4 標(biāo)本采集

結(jié)束藥物干預(yù)后，每組大鼠禁食但準(zhǔn)許攝水24 h。首先麻醉各組大鼠，從腹主動脈收集到血以后，逐層剪開腹腔，取胃剪開，去除內(nèi)容物后將其清洗干凈，胃組織一半采取多聚甲醛固定，另一半直接存放到-80 ℃冰箱。

2.5 指標(biāo)檢測

2.5.1 一般狀態(tài)觀察及體質(zhì)量變化 觀察各組大鼠的活動度、精神狀態(tài)、糞便狀況等一般狀態(tài)，同時記錄大鼠體質(zhì)量的增長情況。

2.5.2 胃潰瘍指數(shù)（ulcel index, UI）的計算 應(yīng)用10 倍放大鏡觀察記錄潰瘍灶的大小，同時采取Guth[14]標(biāo)準(zhǔn)以計算胃UI。 具體算法：（1）黏膜出現(xiàn)斑點或者糜爛，1 分；（2）黏膜糜爛長度<1 mm，1 分；（3）黏膜損傷長度達l～2 mm，3 分；（4）黏膜損傷長度達2～3 mm，4分；（5）損傷長度>4 mm，5 分。 損傷的寬度>2 mm，總評分加倍。 由兩人同時完成評估，UI 取二人計算結(jié)果的平均值。

2.5.3 HE 染色檢測胃組織病理變化 胃組織通過脫水、石蠟包埋、切成大小約4 μm 的切片，再采用HE 染色常規(guī)方法規(guī)范進行，在顯微鏡下觀察。

2.5.4 ELISA 檢測血清TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平

將收集到的腹主動脈血放在室溫下待其凝固，再以3 500 r/min 離心20 min，離心半徑為5.5 cm，獲得上清液，對應(yīng)ELISA 試劑盒說明書仔細(xì)操作檢測炎癥介質(zhì)的含量。

2.5.5 免疫組織化學(xué)檢測胃組織HGF、c-Met 蛋白表達水平 取各組的胃組織，經(jīng)石蠟包埋、切片、二甲苯脫蠟、脫水，再進行熱修復(fù)抗原，然后漂洗3 次后封閉。 先滴加稀釋后的一抗（HGF、c-Met 抗體稀釋比例均為1∶50），4 ℃條件下處理過夜。 沖洗3 次后加入二抗（100 μL 左右）。經(jīng)DAB 顯色后，將細(xì)胞核復(fù)染蘇木素、返藍(lán)、脫水，再封片處理，采取顯微鏡收集圖像并分析。

2.5.6 RT-PCR 檢 測 胃 組 織HGF、c-Met、PI3K 和EGFR 的mRNA 表達水平 取每組約0.02 g 的胃組織，采用Trizol 提取出總RNA，再用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成產(chǎn)物cDNA。 擴增條件：預(yù)變性：95 ℃30 s；循環(huán)反應(yīng)：95 ℃10 s，60 ℃30 s，循環(huán)40 次；熔解曲線：95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s。根據(jù)2-△△Ct法計算目標(biāo)mRNA 的相對表達量。 引物序列（由上海生工合成）見表1。

表1 引物序列表

2.5.7 Western blot 檢測胃組織PI3K、p-AKT、EGFR的蛋白表達水平 取適量胃組織，向其中加入RIPA裂解液并反復(fù)研磨至組織溶解，離心后獲取上清液。SDS-PAGE 變性電泳將蛋白按分子量大小分開，完成蛋白轉(zhuǎn)膜，再采取封閉液把膜封閉。然后滴加稀釋后的一抗（PI3K、AKT、p-AKT、EGFR、β-actin 分別以1∶1 000、1∶1 000、1∶15 000、1∶2 000、1∶5 000 稀釋），孵育過后進行封閉，孵育二抗之后再次進行顯色。 經(jīng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)收集圖像，借助Quantity one軟件算出灰度值。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究的全部數(shù)據(jù)的分析均應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。 計量資料采取“±s”表示。 符合正態(tài)性分布和方差齊性，多組間的比較則采用單因素方差分析，若符合正態(tài)性分布但不符合方差齊性，則選用LSD法，若不符合正態(tài)性分布和方差齊性，則采用秩和檢驗。 以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃芪建中湯對模型大鼠一般情況及體質(zhì)量增長情況的影響

正常組大鼠的精神狀態(tài)和活動程度從造模到取材前情況均良好，毛發(fā)正常，糞便成形，同時體質(zhì)量進行性增加；與正常組比，模型組大鼠精神狀態(tài)較差，反應(yīng)不靈敏，毛發(fā)稀疏且萎黃，糞便不成形，體質(zhì)量增長率明顯降低（P＜0.05）；與模型組比，中藥組和西藥組精神欠佳、毛發(fā)稀疏、稀便、反應(yīng)遲鈍等情況均改善，體質(zhì)量增長速度也有所加快（P＜0.05）；兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 詳見表2。

表2 各組大鼠體質(zhì)量變化情況（±s，n=3）

表2 各組大鼠體質(zhì)量變化情況（±s，n=3）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別正常組模型組中藥組西藥組取材當(dāng)天442.17±8.64 304.83±13.90*339.50±9.40#340.77±6.60#干預(yù)前263.90±6.22 262.97±6.64 263.67±3.84 264.10±6.17第10 天307.57±11.45 264.47±5.03*266.33±2.06 265.40±4.85第17 天359.70±9.00 274.03±3.45*284.97±4.05 291.53±6.54第24 天399.70±5.45 292.73±5.71*309.17±7.44 315.50±6.18

3.2 黃芪建中湯對模型大鼠UI 的影響

相比正常組，模型組大鼠的UI 明顯升高（P＜0.05）；中藥組UI 較模型組下降（P<0.05）。詳見表3。

表3 黃芪建中湯對模型大鼠UI 的影響（±s，n=3）

表3 黃芪建中湯對模型大鼠UI 的影響（±s，n=3）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別正常組模型組中藥組西藥組UI 0.00±0.00 7.27±1.03*3.87±1.10#3.63±1.36#

3.3 各組大鼠胃組織形態(tài)的觀察

正常組大鼠胃黏膜上皮組織的形態(tài)完整，單層柱狀細(xì)胞相互之間排列規(guī)整，沒有出血或脫落；與正常組比，模型組大鼠胃黏膜絨毛間有明顯的出血發(fā)生，伴有黏液細(xì)胞嚴(yán)重脫皮。與模型組相比，中藥組和西藥組的黏膜損傷程度均有明顯的改善；中藥組與西藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 詳見圖1。

圖1 各組大鼠胃組織形態(tài)（HE 染色）

3.4 黃芪建中湯對模型大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1β 含量的影響

與正常組比較，模型組TNF-α、IL-6 及IL-1β顯著升高（P<0.05）；與模型組比，中藥組與西藥組TNF-α、IL-6 及IL-1β 顯著下降（P<0.05）;中藥組與西藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 詳見表4。

表4 黃芪建中湯對模型大鼠血清炎性因子的影響（±s，ng/mL，n=3）

表4 黃芪建中湯對模型大鼠血清炎性因子的影響（±s，ng/mL，n=3）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別正常組模型組西藥組中藥組TNF-α 7.46±0.59 29.04±2.77*13.29±2.14#19.10±1.46#IL-6 38.57±3.24 90.40±5.18*53.10±3.52#72.84±3.81#IL-1β 215.78±8.30 1 045.45±55.09*433.88±21.13#582.73±22.80#

3.5 黃芪建中湯對模型大鼠胃組織中HGF、c-Met的蛋白表達水平的影響

與正常組比較，模型組胃HGF 蛋白表達顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組的HGF蛋白表達明顯增加（P<0.05）；中藥組與西藥組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；各組間c-Met 水平無明顯差異（P>0.05）。 詳見表5 和圖2—3。

圖2 黃芪建中湯對模型大鼠胃組織HGF 表達的影響（免疫組織化學(xué)）

圖3 黃芪建中湯對模型大鼠胃組織c-Met 表達的影響（免疫組織化學(xué)）

表5 黃芪建中湯對模型大鼠胃組織中HGF、c-Met 的蛋白表達水平的影響（±s，n=3）

表5 黃芪建中湯對模型大鼠胃組織中HGF、c-Met 的蛋白表達水平的影響（±s，n=3）

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，P<0.05。

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3.6 黃芪建中湯對模型大鼠HGF、c-Met、PI3K、AKT 和EGFR 的mRNA 表達水平的影響

與正常組比較，模型組胃HGF、c-Met mRNA表達水平顯著上升（P<0.05），PI3K、EGFR mRNA 表達水平顯著下降（P<0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組胃HGF、c-Met、PI3K 和EGFR mRNA 表達水平均上升（P<0.05），且中藥組與西藥組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；各組間AKT mRNA 水平無明顯差異（P>0.05）。 詳見表6。

表6 黃芪建中湯對模型大鼠HGF、c-Met、PI3K、AKT 及EGFR 的mRNA 表達水平的影響（±s，n=3）

表6 黃芪建中湯對模型大鼠HGF、c-Met、PI3K、AKT 及EGFR 的mRNA 表達水平的影響（±s，n=3）

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

組別正常組模型組西藥組中藥組HGF 0.33±0.05 0.72±0.04*0.99±0.03#0.86±0.01#c-Met 0.26±0.03 0.49±0.06*0.97±0.04#0.72±0.02#PI3K 3.80±0.17 0.97±0.03*1.97±0.15#2.20±0.42#AKT 3.24±0.43 3.09±0.45 3.21±0.19 3.32±0.33 EGFR 1.02±0.03 0.31±0.00*0.82±0.04#0.65±0.04#

3.7 黃芪建中湯對模型大鼠胃組織PI3K、p-AKT和EGFR 蛋白表達水平的影響

與正常組比，模型組胃PI3K、p-AKT 和EGFR蛋白表達明顯降低（P<0.05）；與模型組比，中藥組和西藥組胃PI3K、p-AKT 和EGFR 蛋白表達明顯上升（P<0.05）；中藥組與西藥組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 詳見表7、圖4。

圖4 各組大鼠PI3K、p-AKT 及EGFR 的蛋白表達

表7 黃芪建中湯對模型大鼠胃組織PI3K、p-AKT 和EGFR 蛋白表達水平的影響（±s，n=3）

表7 黃芪建中湯對模型大鼠胃組織PI3K、p-AKT 和EGFR 蛋白表達水平的影響（±s，n=3）

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

組別正常組模型組黃芪建中湯組奧美拉唑組PI3K/β-actin 0.63±0.04 0.23±0.02*0.50±0.05#0.48±0.04#p-AKT/β-actin 0.61±0.04 0.20±0.02*0.49±0.04#0.44±0.04#EGFR/β-actin 0.47±0.02 0.18±0.03*0.28±0.02#0.32±0.02#

4 討論

GU 是一種以胃黏膜深度壞死性缺損為主要病理表現(xiàn)的消化疾病。確切的發(fā)病機制不明，可能與幽門螺桿菌感染、胃酸分泌過多、黏膜修復(fù)功能下降、非甾體抗炎藥等造成黏膜損傷有關(guān)[15]。目前，西醫(yī)主要治療藥物有抗酸藥、質(zhì)子泵抑制劑、胃黏膜保護劑等，但都存在不良反應(yīng)等缺陷。近年研究中，中醫(yī)藥治療GU 優(yōu)勢顯著[16]。 中醫(yī)學(xué)認(rèn)為GU 屬于“胃脘痛”“痞滿”等疾病范疇，脾胃虛寒證為其常見證型之一。寒邪侵犯胃脘致氣血失養(yǎng)、陽氣受損，不榮則痛。黃芪建中湯具有溫脾暖胃、補中益氣及止痛的功效，可針對脾胃虛寒之病機改善胃部痛證。 方中黃芪補氣升陽，飴糖健脾，共為君藥；桂枝驅(qū)風(fēng)寒，白芍止痛，共為臣藥；生姜溫中散寒，大棗補血，同為佐藥；炙甘草解中焦脾胃之痛，調(diào)和諸藥，為使藥。 現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實[17-18]，黃芪、甘草具有保護胃黏膜的作用，桂枝、芍藥具有抑制胃酸分泌的作用。 本實驗中GU 模型大鼠在給予黃芪建中湯灌胃之后，其一般狀態(tài)好轉(zhuǎn)，體質(zhì)量增長速度加快，UI 降低，胃組織病理改變改善，表明黃芪建中湯對GU 大鼠胃黏膜損傷具有一定的修復(fù)作用。

最新研究表明[19]，胃黏膜上皮細(xì)胞增殖與凋亡失衡在GU 的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。正常狀態(tài)下，胃黏膜上皮細(xì)胞的凋亡與增殖保持平衡。 而炎性介質(zhì)、胃酸、幽門螺桿菌感染等各類刺激因素均可加速細(xì)胞凋亡，損害增殖和凋亡的平衡，進而引起胃黏膜損傷、GU 發(fā)生[20]。 HGF/c-Met、PI3K/AKT 信號途徑被抑制是誘發(fā)GU 發(fā)病的兩條重要信號通路[21]。HGF 屬于一種多效能的生長因子，其與受體c-Met結(jié)合后，能激活PI3K/AKT 通路促進上皮細(xì)胞增殖、遷移、再上皮化和胃腺重建[22]。 PI3K 屬于一種脂質(zhì)激酶，其激活后能磷酸化AKT，使其具有活性，且動物實驗表明，激活PI3K/AKT 途徑能發(fā)揮促進胃上皮細(xì)胞增殖、抑制凋亡的作用[23-24]。 EGFR 是一種跨膜糖蛋白，可與EGF 結(jié)合構(gòu)成二聚體，發(fā)揮減少胃酸分泌、促進胃潰瘍愈合、修復(fù)黏膜損傷的生物功能[25]。本實驗結(jié)果也顯示，模型組大鼠胃組織HGF、c-Met mRNA 及HGF 蛋白表達顯著升高，PI3K mRNA 及PI3K、p-AKT、EGFR 蛋白表達水平顯著降低；而經(jīng)黃 芪 建 中 湯 干 預(yù) 后HGF、c-Met、PI3K mRNA 及HGF、PI3K、p-AKT、EGFR 蛋白表達水平顯著高于模型組；但各組間c-Met 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 以上表明黃芪建中湯對GU 胃上皮細(xì)胞增殖有明顯的促進作用。 修復(fù)GU 黏膜損傷。

炎癥亦是GU 發(fā)病機制中的關(guān)鍵因素，且多種炎癥細(xì)胞因子參與其中[26]。正常情況下，巨噬細(xì)胞應(yīng)答炎癥信號處在較低水平。 研究發(fā)現(xiàn)[27-29]，在有害因素刺激下，巨噬細(xì)胞功能發(fā)生改變，分泌促炎因子TNF-α；TNF-α 可進一步促進IL-1β、IL-6 等其他促炎因子的產(chǎn)生，直接引起胃黏膜損傷，亦可促進中性粒細(xì)胞聚集在炎癥部位，從而分解連接蛋白、破壞黏膜屏障，誘發(fā)或加重GU。 本次研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)黃芪建中湯灌胃給藥后，GU 大鼠血清中IL-6、IL-β、TNF-α 含量顯著降低，提示黃芪建中湯能有效抑制GU 大鼠炎癥反應(yīng)。

綜上所述，黃芪建中湯能有效改善GU 大鼠胃黏膜損傷，其機制可能與激活HGF/c-Met、PI3K/AKT信號途徑以促進胃上皮細(xì)胞增殖及減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究為臨床防治GU 提供新的思路與靶點，但黃芪建中湯治療GU 的分子機制仍需進一步探索。