基于PI3K/AKT 信號通路探討益氣養(yǎng)陰活血利水方抑制早期糖尿病視網膜病變大鼠微血管周細胞凋亡的作用機制

鐘 緣，蔣鵬飛，趙 盼，譚 詩，彭 俊，彭清華*

1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007；3.湖南省中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病與視功能保護工程技術研究中心，湖南 長沙410208

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy, DR）是糖尿病中常見的微血管并發(fā)癥，是機體持續(xù)糖代謝紊亂和微循環(huán)障礙在眼部的表現，是20～60 歲勞動人群致盲的首要原因，也是世界范圍內重要的致盲眼病[1]。 目前，DR 的治療方法主要包括視網膜激光治療、激素治療、玻璃體內注藥及玻璃體切割手術等[2]，但這些治療措施主要應用于晚期增生性DR。 對于早期DR，目前臨床上尚無療效確切的治療方案。

中醫(yī)藥治療早期DR 具有獨到優(yōu)勢，彭清華教授認為目絡阻滯、血水溢出脈外是早期DR 發(fā)病的重要病理因素，氣陰兩虛、目絡瘀滯、血水溢出脈外是重要病機，并針對該病機創(chuàng)制了益氣養(yǎng)陰活血利水方[3]。 全方由黃芪、黃精、生地黃、墨旱蓮、茯苓、蒲黃、蠐螬、葛根、益母草、車前子、甘草組成，共奏益氣養(yǎng)陰、活血利水之功。 前期研究表明，益氣養(yǎng)陰活血利水方能減輕早期DR 患者的臨床癥狀，能提高視力、減少微血管瘤、減少眼底出血滲出、改善毛細血管通透性、降低血液黏稠度，從而改善微循環(huán)[4]。

早期DR 最具特征的組織學改變是視網膜微血管周細胞的選擇性喪失[5]，周細胞喪失引起血-視網膜屏障（blood-retinal barrier, BRB）受損無法修復，故應重視DR 的早期干預治療。 早期防治的關鍵在于減少微血管周細胞的丟失，防止無細胞新生血管的形成，阻止病情進展[6]。 多項研究發(fā)現，磷酸肌醇3-激酶蛋白（phosphatidylinositol 3-kiases, PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（phospho-alpha serine/threonine-protein kinase, AKT） 信號通路在維持BRB完整性、抑制視網膜新生血管生成和調控視網膜微血管周細胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用，與DR 的發(fā)生與發(fā)展關系密切[7-9]。 本研究擬在前期研究基礎上， 進一步以PI3K/AKT 信號通路及其下游凋亡蛋白為切入點，探討益氣養(yǎng)陰活血利水方治療早期DR的作用機制， 以期為治療早期DR 找到有效的候選藥物。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級SD 雄性大鼠138 只，體質量（200±20） g，購自湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心，實驗動物質量合格證號：ZS-202106150022。 實驗動物購入后飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學SPF 級實驗動物中心，實驗單位使用許可證號：SYXK（湘）2020-0005。 自由飲食飲水，12 h 晝夜節(jié)律。 實驗經湖南中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會批準（LL2021061607）。

1.2 主要藥物與試劑

益氣養(yǎng)陰活血利水方組成：黃芪20 g、生地黃10 g、黃精10 g、墨旱蓮10 g、蒲黃10 g（包煎）、蠐螬3 g（磨粉沖服）、葛根10 g、茯苓10 g、益母草10 g、車前子10 g、甘草5 g。 總藥量為108 g，為50 kg體質量成人量。 由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科提供，按傳統(tǒng)工藝煎煮一次，并濃縮成85 mL的混懸液，濃度為1.27 g/mL；羥苯磺酸鈣膠囊（貴州天安藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格0.5 g/粒，國藥準字：H20110031，批號：14201658642）。

鏈脲佐菌素（streptozocin, STZ）（北京索萊寶科技有限公司，批號：301V021）；梓檬酸、檸檬酸三鈉（上海展云化工有限公司，批號：01B221210、03A221023）；伊紅、蘇木精染液（長沙艾碧維生物科技有限公司，批號：06K230425、11Q230210）；蛋白酶抑制劑（中國北 京 金泰宏達公司，批號：583794）；Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl2-associated X protein, Bax）、胱天蛋白酶-8（cysteine aspartic acid specific protease-8, Caspase-8）、胱天蛋白酶-3（cysteine aspartic acid specific protease-3, Caspase-3）、細胞凋亡死亡激動劑BID 蛋白（apoptotic death agonist BID protein, Bid）、PI3K、AKT 抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：AC220112006、AC210828016、AC220128020、AC210823018、AC2110 15003、AC220122010）；mRNA 逆轉錄試劑盒、miRNA 逆轉錄試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司，批號：09623、25722）；Trizol（美國Thermo 公司，批號：3877101223）；瓊脂糖（長沙艾碧維生物科技有限公司，批號：02C230423）。

1.3 主要儀器

電子天平（美國雙杰，型號：JJ224BC）；精密pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司，型號：PHS-3C）；手術顯微鏡（蘇州六六視覺科技股份有限公司，型號：YZ20T4）；超薄切片機（中國浙江金華益迪醫(yī)療設備有限公司，型號：YD-315）；包埋機（常州市中威電子儀器有限公司，型號：BMJ-A）；實時熒光定量PCR儀、LD5-10B 低速離心機、熒光PCR 板（美國Thermo公司，型號：PIKOREAL96、Fresco 17、TSPL0960）；紫 外可見分光光度計（上海Spectrum 公司，型號：SP-752）；臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，型號：H1650R）；恒溫水浴箱（河南金博儀器制造有限公司，型號：THH-S2）。

1.4 分組、造模及給藥

SPF 級SD 雄性大鼠138 只，適應性飼養(yǎng)7 d 后隨機分成6 組，空白組、模型組、羥苯磺酸鈣組及益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中、高劑量組。 每組23 只，并進行編號。 除空白組外，其余各組進行早期DR 模型造模。

參照高玉等[10]早期DR 模型建立方法。 除空白組外，其余各組均以1% STZ 溶液按照60 mg/kg 體質量腹腔注射，72 h 后尾靜脈采血測定其空腹血糖值（每次測血糖前禁食過夜），血糖≥16.7 mmol/L提示糖尿病模型造模成功，血糖不達標或死亡大鼠予以剔除。 空白組大鼠腹腔注射相同劑量的檸檬酸鈉緩沖液。 造模成功后，維持高血糖狀態(tài)10 周。 檢測大鼠血糖和體質量變化，每周檢測1 次。 灌胃4周后再次測量，記錄所有大鼠的血糖及體質量。

在模型組、羥苯磺酸鈣組及益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中、高劑量組維持高血糖10 周后，益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中、高劑量組予以不同濃度益氣養(yǎng)陰活血利水方混懸液連續(xù)干預4 周，每日灌胃1 次。給藥劑量計算方式參照《中醫(yī)科研設計與統(tǒng)計學》[11]中實驗動物給藥方法部分，D2=D1×R2/R1 （D1 為50 kg 成人的劑量（108 g），查表得R2為200 g 大鼠對應體表面積（7.040），R1 為50 kg 成人對應體表面積（307.00），計算得到D2 約為12.4 g/(kg·d)。 結合文獻及實際給藥合理性[12]，低劑量組、高劑量組以中劑量組的1/2 倍、2 倍劑量給藥， 分別為6.2、24.8 g/(kg·d)?？瞻捉M、模型組給予3 mL 蒸餾水灌胃，羥苯磺酸鈣組予羥苯磺酸鈣150 mg/（kg·d）灌胃治療，實驗過程中出現死亡的大鼠予以剔除并根據要求進行補充。

1.5 取材

藥物干預4 周后開始取材，以3%戊巴比妥鈉30 mg/kg 腹腔注射后處死大鼠，取帶有視神經的大鼠眼球，用4%多聚甲醛固定12 h 以上，于-80 ℃液氮下冷凍儲存。

1.6 指標檢測

1.6.1 HE 染色觀察視網膜組織形態(tài)結構 各組取材后，置于多聚甲醛固定，蔗糖脫水后置于石蠟中包埋，將包埋視網膜的石蠟塊切成4 μm 的切片，經二甲苯和梯度乙醇常規(guī)脫蠟至水，自來水沖洗，經蘇木精初染5 min 和伊紅復染4 min，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察視網膜組織形態(tài)結構。

1.6.2 TUNEL 染色檢測視網膜微血管周細胞凋亡取大鼠眼球，將組織進行脫水、透明、浸蠟、包埋，制成石蠟切片，對其進行TUNEL 染色。 根據細胞凋亡檢測試劑盒說明書，將切片進行脫蠟、潤洗等步驟后，蘇木精復染核，梯度乙醇脫水，二甲苯15 min透明，中性樹膠封片，置于光學顯微鏡下觀察并采集圖像，凋亡細胞的陽性細胞核呈棕褐色，計數每平方毫米微血管周細胞調亡數目。

1.6.3 免疫組織化學法檢測視網膜血管Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid、PI3K、AKT 表達 切片經脫臘、復水、通透及抗原修復后行標準的免疫組織化學染色，使用單克隆抗平滑肌肌動蛋白抗體標記周細胞。每張切片隨機取2 個視野，應用MIAS 2000型圖像分析系統(tǒng)測定Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-8、PI3K 及AKT 在視網膜血管周細胞的免疫反應強度（灰度值）。

1.6.4 RT-PCR 檢 測 視 網 膜 組 織Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid、PI3K、AKT mRNA 表達 取各組大鼠眼球，剝離視網膜，采用Trizol 法提取總RNA，通過逆轉錄制備cDNA，聚合酶鏈反應擴增cDNA。 反應條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s。 Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid、PI3K、AKT 引物序列如下。Bax：正向5'-ACGCATCCACCAAGAAGC-3'，反向5'-GCCACACGGAAGAAGACC-3'；Caspase-8：正向5'-CACCCGGACCCAGAATACC-3'，反向5'-TGTTGCTGGTGAGTGTGCATT-3'；Caspase-3：正向5'-TTAATAAAGGTATCCATGGA-3'，反向5-TTAGTGATAAAAATAGAGTT-3；Bid：正向5'-TGGTCTCGGTGGTCTTGGTA-3'，反向5'-CGTTGTTGGTCGGGGATTTG-3'；PI3K：正向5'-AATGGCGACGATTTGCGG-3'，反向5-CAGCCATAGGGGAGCATTCG-3'；AKT：正向5'-CAGACCCACGACCGCCTC-3'，反向5'-GACACAATCTCCGCACCGTAG-3'；內參β-actin：正向5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'，反向5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'。 采用瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)進行灰度掃描，分別記錄Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid、PI3K、AKT 及相應β-actin 的 光 密 度 值（A），以β-actin 為內參進行半定量，分析Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid、PI3K、AKT mRNA 表達。

1.7 統(tǒng)計學方法

本實驗數據采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行處理。 符合正態(tài)分布的計量資料以“±s”表示，采用t檢驗；非正態(tài)分布的計量數據采用Wilcoxon 秩和檢驗；計數資料采用χ2檢驗。 P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 益氣養(yǎng)陰活血利水方對大鼠體質量的影響

治療前，與空白組比較，其余各組大鼠體質量均明顯降低（P<0.01）。 治療4 周后，與模型組比較，各用藥組大鼠體質量均明顯上升（P＜0.01）；與羥苯磺酸鈣組、益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水方中、高劑量組大鼠體質量明顯增加（P<0.01）；與益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組大鼠體質量明顯增加（P<0.01）。 詳見表1。

表1 各組大鼠體質量比較（±s，g，n=23）

表1 各組大鼠體質量比較（±s，g，n=23）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與羥苯磺酸鈣組比較，△△P<0.01；與益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組比較，□□P＜0.01；與益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組比較，■■P＜0.01。

組別空白組模型組羥苯磺酸鈣組益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組治療前231.63±10.29 189.65±4.81**186.93±5.45**186.65±7.98**187.34±8.93**187.07±6.79**治療4 周后309.20±9.58 204.97±6.62**217.05±9.08**##220.03±9.75**##231.62±8.99**##△△□□245.70±9.04**##△△□□■■

2.2 益氣養(yǎng)陰活血利水方對大鼠血糖的影響

治療前，與空白組比較，其余各組大鼠血糖明顯升高（P<0.01）。 治療4 周后，與模型組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水方中、高劑量組血糖明顯降低（P＜0.01）；與羥苯磺酸鈣組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水方中、高劑量組血糖明顯降低（P＜0.05）；與益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組血糖明顯降低（P＜0.05）。 詳見表2。

表2 各組大鼠血糖比較（±s，mmol/L，n=23）

表2 各組大鼠血糖比較（±s，mmol/L，n=23）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與羥苯磺酸鈣組比較，△P<0.05；與益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組比較，□P＜0.05。

組別空白組模型組羥苯磺酸鈣組益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組治療前3.25±0.66 26.55±2.01**25.59±3.25**26.23±1.746**25.84±2.05**26.13±1.78**治療4 周后3.55±0.86 26.03±2.64**26.14±1.69**25.09±1.26**23.85±1.96**##△22.49±2.09**##△□

2.3 益氣養(yǎng)陰活血利水方對大鼠視網膜組織結構的影響

空白組大鼠視網膜各層結構清晰，視網膜各層細胞連續(xù)，細胞核數量正常；模型組大鼠視網膜各層紊亂變性；羥苯磺酸鈣組大鼠視網膜各層結構紊亂；益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中劑量組大鼠視網膜結構較模型組清晰；益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組大鼠視網膜連續(xù)，各層視網膜結構較清晰。 詳見圖1。

圖1 各組大鼠視網膜HE 染色結果（×400）

2.4 益氣養(yǎng)陰活血利水方對大鼠視網膜周細胞凋亡的影響

空白組大鼠視網膜微血管未見明顯周細胞凋亡；模型組大鼠視網膜可見大量周細胞凋亡，呈棕褐色；羥苯磺酸鈣組及益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中劑量組大鼠視網膜周細胞凋亡數雖高于空白組，但較模型組有減少；益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組大鼠視網膜微血管周細胞凋亡數較模型組明顯減少。 詳見圖2。

圖2 各組大鼠視網膜TUNEL 染色結果（×400）

與空白組比較，模型組凋亡細胞數增加（P＜0.05）；與模型組比較，各用藥組凋亡細胞數減少（P＜0.05）；與羥苯磺酸鈣組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中、高劑量組凋亡細胞數減少（P＜0.05）；與益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中劑量組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組凋亡細胞數減少（P＜0.05）。 詳見表3。

表3 各組視網膜周細胞凋亡細胞數比較（±s，n=8）

表3 各組視網膜周細胞凋亡細胞數比較（±s，n=8）

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與羥苯磺酸鈣組比較，△P<0.05；與益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組比較，□P＜0.05；與益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組比較，■P＜0.05。

組別空白組模型組羥苯磺酸鈣組益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組凋亡細胞數/個12.27±1.24 36.85±6.71*30.56±8.42*#26.27±7.21*#△27.84±5.19*#△19.56±4.33*#△□■

2.5 益氣養(yǎng)陰活血利水方對大鼠視網膜微血管周細胞中PI3K、AKT 蛋白表達水平的影響

與空白組比較，模型組、羥苯磺酸鈣組及益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中劑量組大鼠視網膜微血管周細胞中PI3K、AKT 蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中、高劑量組大鼠視網膜微血管周細胞中AKT 蛋白相對表達量升高（P＜0.01），益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組大鼠視網膜微血管周細胞中PI3K 蛋白相對表達量升高（P＜0.01）；與益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中劑量組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組大鼠視網膜微血管周細胞中AKT 蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.05）。詳見表4、圖3—4。

圖3 各組大鼠視網膜PI3K 表達情況（免疫組織化學，×400）

圖4 各組大鼠視網膜AKT 表達情況（免疫組織化學，×400）

表4 各組大鼠視網膜微血管周細胞PI3K、AKT 蛋白相對表達量比較（±s，n=6）

表4 各組大鼠視網膜微血管周細胞PI3K、AKT 蛋白相對表達量比較（±s，n=6）

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，##P<0.01；與益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組比較，□P＜0.05；與益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組比較，■P＜0.05。

組別空白組模型組羥苯磺酸鈣組益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組PI3K 0.38±0.03 0.30±0.03*0.31±0.12*0.33±0.03*0.33±0.05*0.35±0.03##AKT 0.44±0.04 0.29±0.04*0.32±0.11*0.36±0.03*##0.36±0.03*##0.40±0.04##□■

2.6 益氣養(yǎng)陰活血利水方對大鼠視網膜微血管周細胞PI3K、AKT mRNA 表達水平的影響

與空白組比較，模型組、羥苯磺酸鈣組及益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中劑量組大鼠視網膜微血管周細胞PI3K、AKT mRNA 相對表達量明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，羥苯磺酸鈣組大鼠視網膜微血管周細胞AKT mRNA 相對表達量升高（P＜0.05），益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中、高劑量組大鼠視網膜微血管周細胞中PI3K、AKT mRNA 相對表達量明顯升高（P＜0.01）；與益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中劑量組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組大鼠視網膜微血管周細胞中PI3K、AKT mRNA 相對表達量明顯升高（P＜0.05）。 詳見表5。

表5 各組大鼠視網膜微血管周細胞PI3K、AKT mRNA 相對表達量比較（±s，n=6）

表5 各組大鼠視網膜微血管周細胞PI3K、AKT mRNA 相對表達量比較（±s，n=6）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組比較，□P＜0.05；與益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組比較，■P＜0.05。

組別空白組模型組羥苯磺酸鈣組益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組PI3K 0.54±0.21 0.12±0.03**0.14±0.05**0.29±0.07**##0.31±0.06**##0.42±0.11##□■AKT 1.59±0.46 0.36±0.10**0.55±0.16**#0.68±0.23**##0.64±0.26**##1.25±0.44##□■

2.7 益氣養(yǎng)陰活血利水方對大鼠視網膜微血管周細胞Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid 蛋白表達水平的影響

與空白組比較，模型組、羥苯磺酸鈣組及益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中劑量組大鼠視網膜微血管周細胞Bax、Bid 蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.05），各用藥組大鼠視網膜微血管周細胞Caspase-8、Caspase-3蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，羥苯磺酸鈣組大鼠視網膜周細胞Bid、Caspase-3 蛋白相對表達量降低（P＜0.05），益氣養(yǎng)陰活血利水方組低、中、高劑量組大鼠視網膜周細胞中Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid 蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.05）；與益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水高劑量組大鼠視網膜微血管周細胞Bax、Bid 蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.05）；與益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組大鼠視網膜微血管周細胞中Caspase-3 蛋白相對表達量明顯下降（P＜0.05）。 詳見表6、圖5—8。

圖5 各組大鼠視網膜Bax 表達情況（免疫組織化學，×400）

圖6 各組大鼠視網膜Caspase-3 表達情況（免疫組織化學，×400）

圖7 各組大鼠視網膜Caspase-8 表達情況（免疫組織化學，×400）

圖8 各組大鼠視網膜Bid 表達情況（免疫組織化學，×400）

表6 各組大鼠視網膜微血管周細胞Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid 蛋白相對表達量比較（±s，n=6）

表6 各組大鼠視網膜微血管周細胞Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid 蛋白相對表達量比較（±s，n=6）

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組比較，□P＜0.05；與益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組比較，■P＜0.05。

組別空白組模型組羥苯磺酸鈣組益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組Bax 0.31±0.02 0.42±0.02*0.38±0.06*0.35±0.03*#0.36±0.06*#0.32±0.02#□Caspase-3 0.30±0.02 0.39±0.03*0.35±0.04*#0.35±0.04*#0.37±0.03*#0.33±0.03*#■Caspase-8 0.29±0.03 0.44±0.04*0.38±0.07*0.36±0.03*#0.35±0.07*#0.33±0.04*#Bid 0.28±0.04 0.41±0.04*0.36±0.03*#0.37±0.03*#0.37±0.06*#0.32±0.04#□

2.8 益氣養(yǎng)陰活血利水方對大鼠視網膜微血管周細胞Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid mRNA 相對表達水平的影響

與空白組比較，其余各組大鼠視網膜微血管周細胞中Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid mRNA 相對表達量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，羥苯磺酸鈣組大鼠視網膜微血管周細胞Bax、Caspase-8 mR-NA 相對表達量降低（P＜0.05），益氣養(yǎng)陰活血利水方低、中、高劑量組大鼠視網膜微血管周細胞中Bax、Caspase-8、Caspase-3 mRNA 相對表達量明顯降低（P＜0.05），益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組大鼠視網膜微血管周細胞Bid mRNA 相對表達量降低（P＜0.05）；與益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組大鼠視網膜微血管周細胞Bax、Caspase-8、Caspase-3 mRNA 相對表達量明顯降低（P＜0.05）；與益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組大鼠視網膜微血管周細胞中Bax、Caspase-3 mRNA 相對表達量明顯降低（P＜0.05）。 詳見表7。

表7 各組大鼠視網膜微血管周細胞Caspase-8、Caspase-3、Bax、Bid mRNA 相對表達量比較（±s，n=6）

表7 各組大鼠視網膜微血管周細胞Caspase-8、Caspase-3、Bax、Bid mRNA 相對表達量比較（±s，n=6）

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組比較，□P＜0.05；與益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組比較，■P＜0.05。

Bid 0.11±0.04 0.73±0.27*0.66±0.24*0.53±0.17*0.52±0.21*0.23±0.08*#組別空白組模型組羥苯磺酸鈣組益氣養(yǎng)陰活血利水方低劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方中劑量組益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組Bax 0.07±0.02 0.92±0.33*0.57±0.24*#0.39±0.12*#0.32±0.15*#0.14±0.07*#□■Caspase-3 0.09±0.02 1.28±0.36*0.94±0.41*0.44±0.20*#0.39±0.16*#0.25±0.07*#□■Caspase-8 0.06±0.02 1.29±0.42*0.87±0.26*#0.54±0.15*#0.43±0.11*#0.35±0.09*#□

3 討論

隨著物質生活水平的提升以及人口老齡化比例的不斷升高，糖尿病發(fā)病率逐年增加[13]，糖尿病人群中DR 患病率達31.8%[14]，DR 的致盲率也呈上升趨勢[15]，早期防治DR 顯得尤為重要。研究表明，DR 早期的組織學病理改變之一是視網膜微血管周細胞的消失[5]，且周細胞缺失引起的BRB 功能受損是永久性的[16]。 因此，靶向減少微血管周細胞的丟失是治療早期DR 的關鍵。 目前對于早期DR 尚無療效確切的藥物。前期臨床研究表明，益氣養(yǎng)陰活血利水方能有效改善早期DR 患者的臨床癥狀[4]。

DR 屬中醫(yī)學“視瞻昏渺”“云霧移睛”等內障眼病范疇。消渴病久傷陰，氣陰虧虛，氣虛帥血無力，無力運化水濕，陰虛血行滯澀，脈絡不暢，致眼部血絡瘀阻或血溢脈外，引起微血管瘤、滲出、出血、水腫等眼底改變。根據早期DR 的病機特點，彭清華教授提出在辨證上須抓住“虛、瘀、水”三要點，以益氣養(yǎng)陰活血利水方加減治療。方中黃芪補脾益氣利水，氣行則血行，生地黃滋腎養(yǎng)陰，黃精平補氣陰，三藥合為君藥，共奏益氣養(yǎng)陰、補脾益腎之功；臣以葛根生津活血，蠐螬活血通絡，蒲黃活血止血，墨旱蓮滋補肝腎、涼血止血；佐以茯苓健脾利水，益母草活血利水，車前子利水滲濕，甘草調和諸藥。 全方共奏益氣養(yǎng)陰、活血利水之功[4]。

PI3K/AKT 信號通路是調控胰島素傳導信號的經典途徑之一[17]，其下游多種靶蛋白參與調節(jié)視網膜微血管周細胞的凋亡，現已被證實調控該通路靶基因的表達能在一定程度上預防DR 的進展[18]。PI3K/AKT 信號通路在視網膜微血管周細胞中被激活后，驅動血管內皮生長因子的細胞因子信號，介導內皮細胞增殖、遷移及新生血管生成過程，導致DR進展[19]。 同時，PI3K/AKT 信號激活后可作用于下游靶基因和靶蛋白，調控細胞凋亡[20]。 田麗珍等[21]發(fā)現，大黃庶蟲廣蟲丸能夠上調PI3K、AKT，降低Caspase-9 的表達，抑制糖尿病大鼠視網膜微血管周細胞的凋亡。CHENG 等[18]證實，DR 小鼠模型中發(fā)生了早發(fā)性周細胞丟失和細胞凋亡水平增加，并發(fā)現地諾前列素可以通過激活PI3K/AKT 信號通路來改善周細胞凋亡，阻止疾病進展。

細胞凋亡主要由外源性和內源性兩種途徑啟動[22]，其中執(zhí)行凋亡的關鍵元素為Caspase 家族和Bcl-2家族。 Caspase-8 是外源性途徑中關鍵的啟動型蛋白酶，而Caspase-3 是最終的凋亡執(zhí)行因子[23]，可被多種因素活化，引起激酶級聯反應，促進細胞凋亡。Bcl-2 家族成員則在內源性細胞凋亡途徑中發(fā)揮重要作用[24]，凋亡級聯中Bcl-2 蛋白活化，激活下游Caspase 家族蛋白，作用于相應底物，引起細胞凋亡。 Bax和Bid 是Bcl-2 家族促凋亡成員代表，Bax 通過與線粒體上的膜通道結合，促使細胞色素C 的釋放而促進凋亡，并可與Bcl-2 形成異二聚體阻斷其抗凋亡作用，另一方面，凋亡過程啟動后，被激活的Caspase-8 將Bid 切割為活性tBid，進入線粒體后使得細胞色素C 高效釋放，細胞色素C 與胞漿中的凋亡酶激活因子結合，活化Caspase-9，進而激活Caspase-3，促使細胞凋亡[25]。

本研究發(fā)現，在益氣養(yǎng)陰活血利水方干預4 周后，與模型組比較，益氣養(yǎng)陰活血利水方中、高劑量組大鼠血糖均降低；益氣養(yǎng)陰活血利水方各劑量組大鼠體質量均升高，大鼠視網膜微血管周細胞凋亡數減少；益氣養(yǎng)陰活血利水方高劑量組大鼠視網膜微血管周細胞中PI3K、AKT 蛋白和mRNA 表達水平均 升 高，Bax、Caspase-8、Caspase-3 及Bid 蛋 白 和mRNA 表達水平均降低。 說明益氣養(yǎng)陰活血利水方能夠降低早期DR 大鼠血糖、穩(wěn)定體質量，上調早期DR 大鼠視網膜微血管中PI3K、AKT 表達，下調Bax、Caspase-8、Caspase-3 及Bid 表達，從而減少周細胞的凋亡，改善視網膜組織結構紊亂。

綜上所述，本研究結果表明，益氣養(yǎng)陰活血利水方能夠減少早期DR 大鼠視網膜微血管周細胞的凋亡，改善視網膜組織結構紊亂，延緩DR 視網膜微血管病變的發(fā)生發(fā)展，可能是通過激活PI3K/AKT通路，下調Bax、Caspase-8、Caspase-3 及Bid 基因表達水平發(fā)揮作用。 DR 的發(fā)病機制極為復雜，本研究通過動物實驗明確了益氣養(yǎng)陰活血利水方對PI3K/AKT 信號通路的部分調控作用，希望能為未來DR的早期防治提供實踐依據。