辣木葉多酚提取及抗氧化能力研究

李天嬌，程碧君，張芳瑋，張峻旗，董禹辰

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林吉林 132101）

辣木，廣泛分布于熱帶地區(qū)，在廣東、海南等地區(qū)有種植區(qū)。種子可以提取高級(jí)潤(rùn)滑油，辣木葉子可以作為湯的調(diào)味料，味道鮮美。新采摘的辣木葉還可以作為野菜食用[1]。辣木有許多藥用價(jià)值，如用于治療偏頭痛、頭暈、呼吸不暢、上火、尿黃、胃脹氣、食欲不振、胃腸區(qū)痙攣，以及各種癌癥[2-3]。辣木葉富含礦質(zhì)元素、維生素、糖苷和多酚類化合物等活性物質(zhì)。辣木葉具有良好的抗氧化、抑菌、降低血壓、血脂和血糖，并改善機(jī)體的內(nèi)臟器官、抑制人體內(nèi)的DNA 分子損傷、良好的調(diào)節(jié)胃腸道微生物等多種生物活性[4-5]。選擇辣木葉為研究對(duì)象對(duì)辣木葉多酚進(jìn)行提取。經(jīng)過試驗(yàn)獲得了最佳工藝條件，采用DPPH 自由基清除、羥自由基清除試驗(yàn)研究辣木葉多酚抗氧化性能。探索辣木葉多酚的提取方法，并研究辣木葉多酚的抗氧化能力，對(duì)辣木葉多酚的開發(fā)利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木葉，市售；沒食子酸、福林酚、DPPH、鄰苯三酚等，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204 型電子天平，梅特勒- 托利公司產(chǎn)品；ST-02A 型多功能粉碎機(jī)，上海樹立儀器儀表有限公司產(chǎn)品；DHG-9240A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；UV-8000A 型可見分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 辣木葉多酚的提取

將新買的新鮮辣木葉子洗凈，除去表面的異物，放在托盤中，用保鮮膜包起來，在表面上打幾個(gè)小孔，保持通風(fēng)。最后，放入干燥箱中，干燥至恒定質(zhì)量，取出干燥的辣木葉子，用破碎機(jī)粉碎，過篩（40 目），放入密封袋中，放在陰涼干燥地方備用。稱取辣木葉粉1.0 g，按不同的料液比加入不同體積分?jǐn)?shù)乙醇。放入試管中，用玻璃棒攪拌均勻，在恒溫水浴中振蕩提取。然后放入離心機(jī)中，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min。上清液放入50 mL 容量瓶中為后續(xù)測(cè)試做準(zhǔn)備[6]。

1.3.2 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，取出6 個(gè)15 mL 比色管，6 個(gè)比色管依次加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 沒食子酸溶液，各管補(bǔ)加蒸餾水至1 mL，然后在每個(gè)比色管中加入1.5 mL 福林酚試劑，加入3 mL 的質(zhì)量濃度為75 g/mL 碳酸鈉試劑，最后加入蒸餾水至體積為10 mL，靜置2 h，在波長(zhǎng)752 nm 處測(cè)定其吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以1 號(hào)管測(cè)得的吸光度為空白，以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，最后得到多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y[7]。

1.3.3 多酚得率計(jì)算

辣木葉多酚產(chǎn)量按照以下公式計(jì)算[8]：

式中：C——提取液中多酚的質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——提取液的體積，mL；

M——稱取的辣木葉粉的質(zhì)量，mg。

1.3.4 單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)

分別考查乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、浸提時(shí)間、浸提溫度對(duì)辣木葉多酚得率的影響。根據(jù)單因素結(jié)果，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，根據(jù)辣木葉片多酚的得率，確定最佳提取條件。

辣木葉多酚提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 辣木葉多酚提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.5 體外抗氧化試驗(yàn)

（1） DPPH 自由基清除試驗(yàn)。準(zhǔn)確配制DPPH 濃度為0.2 mo1/L，辣木葉多酚溶液1 mL 加入到干凈的試管中，加入3 mL DPPH 溶液，混合均勻，放在黑暗中靜置30 min，在波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)得吸光度為A1。另一試管中加入3 mL 無水乙醇溶液，并將1 mL不同質(zhì)量濃度的辣木葉多酚溶液加入試管中，混合均勻后，在黑暗中靜置30 min，在波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定吸光度為A2。另取試管放入3 mL DPPH 溶液和1 mL無水乙醇溶液，混合后，將其置于黑暗中30 min，在波長(zhǎng)517 nm 處的吸光度為A0，以相同濃度的維C 作為對(duì)照試驗(yàn)[9]。

（2） 羥基自由基清除試驗(yàn)。量取1 mL 不同質(zhì)量濃度的辣木葉多酚溶液，分別加入5 個(gè)試管中，依次加入濃度為9 mmol/L 的FeSO4溶液1 mL 和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.8%的H2O2溶液1 mL，濃度為9 mmol/L 的水楊酸溶液1 mL，振蕩至完全混合，然后在37 ℃的水浴中放置30 min，在波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)量吸光度為A1，另外取5 個(gè)試管用蒸餾水代替H2O2，其他條件不變，吸光度為A2。取另一試管用蒸餾水代替辣木葉多酚溶液，其他條件不變，測(cè)定吸光度為A0，以相同濃度的維C 代替作為對(duì)照試驗(yàn)[10]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±s） 表示，使用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，以p＜0.05差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

線性回歸方程：Y=9.628 6X-0.004 8，R2=0.998 5。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 辣木葉多酚提取結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)辣木葉多酚得率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)辣木葉多酚得率的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)辣木葉多酚得率的影響

由圖2 可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%時(shí)，辣木葉片中的多酚被提取。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于65%時(shí)，可以連續(xù)提取辣木葉片中的多酚，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于65%時(shí)，從辣木葉片中提取多酚的量減少，而不是先前的增加?？赡苁怯捎谝掖俭w積分?jǐn)?shù)增加，從辣木葉中提取其他物質(zhì)，類似脂類或醇溶性物質(zhì)，與多酚競(jìng)爭(zhēng)溶解，導(dǎo)致多酚溶解的最終原因[11]。

2.2.2 料液比對(duì)辣木葉多酚得率的影響

料液比對(duì)辣木葉多酚得率的影響見圖3。

圖3 料液比對(duì)辣木葉多酚得率的影響

由圖3 可知，當(dāng)料液比為1∶20（g∶mL） 時(shí)，辣木葉中多酚的得率最大，料液比為1∶10～1∶15（g∶mL） 時(shí)，辣木葉片中的多酚可以連續(xù)提取，當(dāng)料液比1∶20（g∶mL） 時(shí)，辣木葉片中多酚的得率會(huì)下降，可能是由于料液比增加，乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，更多的乙醇可溶性物質(zhì)被提取出來，會(huì)減少多酚溶于乙醇的量[12]。

2.2.3 提取溫度對(duì)辣木葉多酚得率的影響

提取溫度對(duì)辣木葉多酚得率的影響見圖4。

圖4 提取溫度對(duì)辣木葉多酚得率的影響

由圖4 可知，辣木葉片中的多酚在35～65 ℃的提取溫度下可以連續(xù)提取，在65～75 ℃時(shí)，辣木葉片中的多酚得率減少?？赡苁怯捎诶蹦救~中物質(zhì)的破壞或辣木葉中多酚的破壞，導(dǎo)致辣木葉中多酚的得率降低[13]。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)辣木葉多酚得率的影響

提取時(shí)間對(duì)辣木葉多酚得率的影響見圖5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)辣木葉多酚得率的影響

由圖5 可知，提取時(shí)間為30～120 min 時(shí)，辣木葉片中的多酚可以連續(xù)提取，在120～150 min 時(shí)，辣木葉片中的多酚得率減少?？赡苁怯捎谔崛r(shí)間太長(zhǎng)而無法破壞辣木葉片中的物質(zhì)或辣木葉片中的多酚，導(dǎo)致從辣木葉片中提取多酚得率降低[14]。

2.2.5 辣木葉多酚提取正交試驗(yàn)結(jié)果

辣木葉多酚提取正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 辣木葉多酚提取正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2 可知，影響辣木葉片多酚得率的因素為A＞B＞D＞C，說明最佳提取條件為A3B1C3D2，即最佳條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶15（g∶mL），提取時(shí)間120 min，提取溫度65 ℃。根據(jù)這種組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。此時(shí)得率為0.515 4%。

2.3 辣木葉多酚體外抗氧化試驗(yàn)

2.3.1 DPPH 自由基清除測(cè)定

DPPH 自由基清除測(cè)定見圖6。

圖6 DPPH 自由基清除測(cè)定

由圖6 可知，在不同質(zhì)量濃度的辣木葉多酚條件下，清除率呈現(xiàn)良好的上升狀態(tài)，且無拐點(diǎn)出現(xiàn)。選擇抗氧化劑維C 作為試驗(yàn)的對(duì)照品。在維C的質(zhì)量濃度逐漸提高，清除率呈上升狀態(tài)，說明維C具有一定的清除DPPH 的能力，但辣木葉多酚清除DPPH 的效果優(yōu)于維C。因此可以看出，辣木葉多酚溶液具有很強(qiáng)的清除DPPH 自由基的能力。

2.3.2 羥基自由基清除測(cè)定

羥基自由基清除測(cè)定見圖7。

圖7 羥基自由基清除測(cè)定

由圖7 可知，在不同質(zhì)量濃度的辣木葉多酚條件下，清除率呈良好的上升狀態(tài)。維C的質(zhì)量濃度逐漸提高，清除率呈上升狀態(tài)，表明維C對(duì)羥基自由基具有一定的清除能力，但維C對(duì)羥基自由基的清除效果不如辣木葉多酚。

3 結(jié)論

選用辣木葉片為原料，采用乙醇提取辣木葉片中的多酚。試驗(yàn)表明，乙醇提取辣木葉多酚的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶15（g∶mL），提取時(shí)間120 min，提取溫度65 ℃。在此條件下，多酚的得率可達(dá)0.515 4%。經(jīng)過DPPH 自由基和羥自由基清除抗氧化能力試驗(yàn)表明，辣木葉片多酚具有較強(qiáng)的抗氧化能力，為辣木葉片多酚的體外抗氧化試驗(yàn)提供了應(yīng)用指導(dǎo)，為抗氧化產(chǎn)品的開發(fā)提供了技術(shù)依據(jù)，為合理開發(fā)辣木葉資源提供了有效途徑。