假節(jié)桿菌PL-410產(chǎn)軟骨素裂解酶制備條件優(yōu)化

肖夢(mèng)圓　李平蘭　武瑞赟

摘 要：為確定獲得軟骨素裂解酶產(chǎn)生菌的分類地位及提高菌株產(chǎn)酶水平，通過形態(tài)學(xué)和16S rRNA基因序列分析鑒定菌株P(guān)L-410，并采用單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化菌株P(guān)L-410的產(chǎn)酶條件。結(jié)果表明，菌株P(guān)L-410為假節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter sp.），命名為假節(jié)桿菌PL-410；優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基為牛軟骨硫酸軟骨素添加量7.5 g/L、胰蛋白胨添加量2.5 g/L、NaCl添加量5 g/L、KH2PO4添加量

0.3 g/L、培養(yǎng)基初始pH 6.53，最佳發(fā)酵條件為接種量2.98%、搖瓶裝液量8%、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min、發(fā)酵溫度24 ℃、發(fā)酵時(shí)間27.63 h，在此條件下軟骨素裂解酶的活力（2 531.765 U/L）比優(yōu)化前（85.229 U/L）提高28.7 倍，可更有效地降解牛軟骨硫酸軟骨素。

關(guān)鍵詞：假節(jié)桿菌；軟骨素裂解酶；產(chǎn)酶條件優(yōu)化

Optimization of Fermentation Conditions for Chondroitinase Production by Pseudarthrobacter sp. PL-410

XIAO Mengyuan1， LI Pinglan1， WU Ruiyun1，2，*

（1. College of Food Science and Nutritional Engineering， China Agricultural University， Beijing 100083， China;

2. Integrated Laboratory of Processing Technology for Chinese Meat and Dish Products， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Institute of Food Science and Technology， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract： In order to determine its taxonomic status and to improve its enzyme production level， the chondroitinase-producing strain PL-410 was identified based on morphology and 16S rRNA gene sequence analysis， and the fermentation conditions for chondroitinase production by this strain were optimized by single factor experiments， Plackett-Burman design， the steepest ascent method and Box-Behnken design combined with response surface methodology. The results showed that the strain PL-410 was identified as Pseudarthrobacter sp. The optimal medium was composed of chondroitin sulfate from bovine cartilage 7.5 g/L， tryptone 2.5 g/L， NaCl 5 g/L， KH2PO4 0.3 g/L， and initial pH 6.53. The optimal fermentation conditions were as follows： inoculum volume 2.98%， medium volume in shaking flasks 8%， shaker rotation speed 160 r/min，

fermentation temperature 24 ℃， and fermentation time 27.63 h. The chondroitinase activity under these conditions was

2 531.765 U/L， which was 29.7 times higher than that before optimization （85.229 U/L）.

Keywords： Pseudarthrobacter sp.; chondroitinase; optimization of enzyme production conditions

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230714-070

中圖分類號(hào)：TS201.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2023）09-0021-09

引文格式：

肖夢(mèng)圓， 李平蘭， 武瑞赟， 等. 假節(jié)桿菌PL-410產(chǎn)軟骨素裂解酶制備條件優(yōu)化[J]. 肉類研究， 2023， 37（9）： 21-29. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230714-070.? ? http：//www.rlyj.net.cn

XIAO Mengyuan， LI Pinglan， WU Ruiyun， et al. Optimization of fermentation conditions for chondroitinase production by Pseudarthrobacter sp. PL-410[J]. Meat Research， 2023， 37（9）： 21-29. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230714-070.? ? http：//www.rlyj.net.cn

硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）是一類以

D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-半乳糖胺通過β-1，3糖苷鍵連接為基本二糖單位的線性多糖，二糖單位之間通過β-1，4糖苷鍵連接，分子質(zhì)量為50～100 kDa[1]。CS廣泛存在于哺乳動(dòng)物中，在骨骼、軟骨、皮膚、肌腱、臍帶和血管中含量豐富[2]。CS通常與核心蛋白共價(jià)連接，形成不同生理功能的蛋白聚糖[3]，還可以通過與各種關(guān)鍵元素（如生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子、黏附因子和脂蛋白）相互作用調(diào)節(jié)生命過程[4]。因此，CS具有多種生物活性，包括抗氧化、抗動(dòng)脈粥狀硬化、抗血栓、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等[5-7]。但由于其分子質(zhì)量大、表觀黏度高、水溶性低，難以通過腸黏膜、胃黏膜等生理黏膜，導(dǎo)致其生物利用率較低，限制其生物活性的發(fā)揮[8]。低分子質(zhì)量CS（低于10 kDa）具有黏度低、水溶性高、易吸收等優(yōu)點(diǎn)，生物利用率提高，可有效發(fā)揮其生物活性[9]。

軟骨素裂解酶（chondroitinase，Chase）是一類可降解CS的裂解酶，通過β-消除機(jī)制作用于CS多糖鏈的β-1，4糖苷鍵，形成在232 nm波長處有吸收的C4＝C5雙鍵的不飽和寡糖和二糖[10]。Chase可用來制備高生物活性的低分子質(zhì)量CS，酶解過程無污染，反應(yīng)條件溫和，催化效率高，且獲得的低分子質(zhì)量CS的分子質(zhì)量

可控[11]。Chase也可用于構(gòu)建寡糖文庫，研究CS的結(jié)構(gòu)、二糖組成、確定來源及檢測(cè)含量[12]；此外，Chase本身具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，如修復(fù)脊髓損傷[13]、減輕腰椎間盤突出[14]、治療瘢痕疙瘩[15]、抑制腫瘤發(fā)展[16]、治療弱視[17]等。因此，制備高純度、高活力的Chase具有廣闊的前景。微生物是Chase的來源，目前已篩選出多株產(chǎn)Chase的菌株，包括普通變形桿菌NCTC4636[18]、肝素黃桿菌ATCC13125[19]、多形擬桿菌ATCC29148[20]、弧菌FC509[21]、溫和氣單胞菌YH311[22]、黏質(zhì)沙雷氏菌GT596[23]、節(jié)桿菌MAT3885[24]等。雖然產(chǎn)Chase菌株眾多，但由于低酶活力的瓶頸制約，不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求。

本研究從土壤中篩選、分離、鑒定得到一株產(chǎn)Chase的假節(jié)桿菌（Pseudarthrobacter sp.），通過單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)假節(jié)桿菌產(chǎn)Chase的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，提高產(chǎn)酶水平，為Chase的工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株P(guān)L-410分離自河邊潮濕土壤中；牛軟骨CS

曲阜圣嘉德生物科技有限公司；葡萄糖、蔗糖、（NH4）2SO4、MgSO4（均為分析純） 西隴科學(xué)股份有限公司；可溶性淀粉、NaCl、KH2PO4、濃鹽酸（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛肉膏、胰蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；酵母浸粉

英國Oxoid公司；牛肉浸粉 安琪酵母股份有限公司；CS-A（高純，98%） 上海源葉生物科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris） 寶如億（北京）生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生物科技有限公司；戊二醛固定液（電鏡專用，2.5%） 北京索萊寶科技有限公司。

LB培養(yǎng)基（種子培養(yǎng)基）：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 7.2。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：NaCl 5 g/L、KH2PO4 0.3 g/L、MgSO4 2 g/L、牛軟骨CS 5 g/L、酵母浸粉10 g/L，pH 7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

XSZ-HS3生物顯微鏡 重慶光電儀器有限公司；ML54/02電子天平、FE28 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-1800紫外-可見分光光度計(jì)

上海美譜達(dá)儀器有限公司；IMJ-85A高壓滅菌鍋 施都

凱儀器設(shè)備（上海）有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)

蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DK-8B電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；3K15臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；MQD-S3R振蕩培養(yǎng)箱 上海旻泉儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定

1.3.1.1 形態(tài)學(xué)觀察

挑取菌株P(guān)L-410于LB培養(yǎng)基平板上劃線，30 ℃倒置培養(yǎng)72 h，觀察菌株的菌落形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色。挑取菌株P(guān)L-410于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)。取培養(yǎng)時(shí)間為12、48、72 h的菌液，離心后棄上清液，向菌體中加入戊二醛固定液，于4 ℃固定2 h，利用掃描電鏡觀察菌體的形態(tài)特征。

1.3.1.2 16S rRNA基因分析

挑取菌株P(guān)L-410于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、

200 r/min振蕩培養(yǎng)18 h。吸取菌液，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書，提取菌株的基因組DNA，由北京諾賽基因組研究中心有限公司對(duì)菌株P(guān)L-410的16S rRNA基因進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交至NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫，與數(shù)據(jù)庫中已知菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，并利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 種子液培養(yǎng)

挑取假節(jié)桿菌PL-410單菌落，接種于種子培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600 nm為0.6左右（菌體數(shù)約為6×108 CFU/mL），制得種子液。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別考察碳源種類（葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉和牛軟骨CS）、碳源添加量（0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 g/L）、氮源種類（牛肉膏、胰蛋白胨、酵母浸粉和牛肉浸粉）、氮源添加量（5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、20.0 g/L）、MgSO4添加量（0、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 g/L）、培養(yǎng)基初始pH（pH 5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、接種量（0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%）、搖瓶裝液量（10%、20%、25%、30%、40%、50%）、發(fā)酵溫度（23、26、28、30、32 ℃）和發(fā)酵時(shí)間（0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 h）對(duì)假節(jié)桿菌PL-410產(chǎn)Chase的影響。通過單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇Plackett-Burman試驗(yàn)的影響因素和水平。

1.3.4 Plackett-Burman試驗(yàn)

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取7 個(gè)因素，每個(gè)因素取高低兩個(gè)水平，利用Design-Expert 11.0軟件設(shè)計(jì)Plackett-Burman試驗(yàn)，試驗(yàn)次數(shù)選擇Run=12，以Chase活力為響應(yīng)值。通過比較各因素的顯著性水平，篩選出對(duì)Chase活力影響比較顯著的3 個(gè)因素，具體設(shè)計(jì)的試驗(yàn)因素和水平如表1所示。

1.3.5 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)分析的因素顯著性及效應(yīng)值，設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)的變化方向和步長。若不顯著（P＞0.05）因素的效應(yīng)值為正，則該因素取高水平值，若效應(yīng)值為負(fù)，則該因素取低水平值。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示。

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，確定Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)與響應(yīng)區(qū)間，利用Design-Expert 11.0軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，以Chase活力為響應(yīng)值，進(jìn)行17 組試驗(yàn)，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表3所示。模型對(duì)Chase活力進(jìn)行二次多元回歸擬合，生成響應(yīng)面曲線圖和等高線圖，獲得最佳發(fā)酵參數(shù)。并在最佳發(fā)酵參數(shù)下進(jìn)行驗(yàn)證，比較試驗(yàn)值與模型預(yù)測(cè)值，驗(yàn)證模型的可靠性。

1.3.7 Chase活力測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵液1 mL，4 ℃、8 000 r/min離心5 min，取上清液棄沉淀。參考Fu Jingyun等[25]的方法，測(cè)定發(fā)酵上清液中Chase活力。Chase活力單位的定義為：在37 ℃條件下，每分鐘降解CS產(chǎn)生1 μmol不飽和二糖所需的酶量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，利用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并利用Origin 2019b軟件作圖。Plackett-Burman試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)通過Design-Expert 11.0軟件設(shè)計(jì)和分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 軟骨素裂解酶產(chǎn)生菌的分類鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)觀察

如圖1a所示，菌株P(guān)L-410在LB固體培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)72 h后，形成直徑1～2 mm的圓形菌落，菌落中心凸起，表面光滑，邊緣較規(guī)則，不透明，呈乳白色。如

圖1b所示，革蘭氏染色觀察菌株P(guān)L-410菌體呈現(xiàn)紫色，為革蘭氏陽性菌。如圖2所示，在LB液體培養(yǎng)基中，菌株P(guān)L-410在生長過程中的形狀會(huì)經(jīng)歷一個(gè)“桿-球”形狀的變化。培養(yǎng)時(shí)間為12 h時(shí)，菌體長1.4～3.0 μm，呈細(xì)長、不規(guī)則的桿狀（圖2a）；培養(yǎng)時(shí)間為48 h時(shí)，菌體長0.5～1.5 μm，桿狀細(xì)胞縮短，菌體短小，近于橢圓形（圖2b）；培養(yǎng)時(shí)間為72 h時(shí)，菌體長0.5～1.0 μm，菌體細(xì)胞進(jìn)一步縮短，近于球形（圖2c）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌株生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)愈發(fā)匱乏，同時(shí)累積大量代謝產(chǎn)物造成惡劣的生長環(huán)境。菌體由桿狀轉(zhuǎn)化為球狀，有助于其在惡劣環(huán)境中生存，因?yàn)榍驙罴?xì)胞呈休眠狀態(tài)，對(duì)逆境具有極強(qiáng)的耐受能力[26]。

2.1.2 16S rRNA基因序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

使用NCBI網(wǎng)站的BLASTn對(duì)菌株P(guān)L-410的16S rRNA基因序列進(jìn)行在線分析，比對(duì)結(jié)果顯示菌株P(guān)L-410與假節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter sp.）的序列高度一致?；诰關(guān)L-410的16S rRNA基因序列及其同源性序列，利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示。綜合形態(tài)學(xué)和16S rRNA基因序列同源性分析，確定菌株P(guān)L-410屬于假節(jié)桿菌屬，命名為假節(jié)桿菌PL-410。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 培養(yǎng)基成分對(duì)假節(jié)桿菌PL-410產(chǎn)酶能力的影響

由圖4A可知，在葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉為碳源時(shí)，假節(jié)桿菌PL-410產(chǎn)Chase的水平較低，和不添加碳源（對(duì)照）組的產(chǎn)酶水平?jīng)]有顯著差異；當(dāng)牛軟骨CS為碳源時(shí)，假節(jié)桿菌PL-410的產(chǎn)酶水平最高，達(dá)到85.229 U/L，

顯著高于其他組（P＜0.05）。這可能是因?yàn)镃hase為一種誘導(dǎo)酶，只有當(dāng)生長環(huán)境中有誘導(dǎo)物（CS）存在時(shí)才能生成，CS脅迫假節(jié)桿菌PL-410產(chǎn)生Chase，降解利用CS滿足自身的生長[27]。故以牛軟骨CS為碳源研究碳源添加量對(duì)假節(jié)桿菌PL-410產(chǎn)酶能力的影響。如圖4B所示，牛軟骨CS添加量由0 g/L增加到5.0 g/L時(shí)，菌株產(chǎn)酶水平逐漸升高，其中添加量為5.0 g/L時(shí)，產(chǎn)酶水平最高，為114.510 U/L。當(dāng)牛軟骨CS添加量繼續(xù)增加時(shí)，菌株產(chǎn)酶水平緩慢下降。這可能是因?yàn)檫^多碳源導(dǎo)致菌株前期快速生長，累積大量毒性因子等代謝產(chǎn)物，造成惡劣的培養(yǎng)基環(huán)境，使Chase喪失部分酶活力，導(dǎo)致Chase活力降低。根據(jù)以上結(jié)果確定牛軟骨CS添加量為2.5～7.5 g/L為Plackett-Burman試驗(yàn)的因素水平。

由圖4C可知，胰蛋白胨和酵母浸粉更能促進(jìn)假節(jié)桿菌PL-410產(chǎn)生Chase，其中當(dāng)胰蛋白胨為氮源時(shí)，菌株的產(chǎn)酶水平最高，為191.111 U/L。故選擇胰蛋白胨為氮源，探究氮源添加量對(duì)假節(jié)桿菌PL-410產(chǎn)酶能力的影響。如圖4D所示，胰蛋白胨添加量為5.0～15.0 g/L時(shí)，菌株的產(chǎn)酶水平?jīng)]有顯著差異；當(dāng)胰蛋白胨添加量高于15.0 g/L時(shí)，菌株的產(chǎn)酶能力下降，這可能是因?yàn)檫^多胰蛋白胨誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生蛋白酶降解Chase。胰蛋白胨添加量為5.0 g/L時(shí)，菌株的產(chǎn)酶水平最高，為238.431 U/L，故確定胰蛋白胨添加量2.5～7.5 g/L為Plackett-Burman試驗(yàn)的因素水平。

由圖4E可知，Mg2＋添加量對(duì)菌株產(chǎn)酶水平影響不顯著，可能是因?yàn)橐鹊鞍纂酥写嬖诘奈⒘縈g2＋可以滿足假節(jié)桿菌PL-410生長代謝，無需額外添加Mg2＋。因此

Mg2＋添加量不作為Plackett-Burman試驗(yàn)的影響因素，選擇不添加Mg2＋繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。由圖4F可知，隨著培養(yǎng)基初始pH值由酸性向堿性變化，菌株產(chǎn)酶水平先升高后下降，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為6.0時(shí)，菌株的產(chǎn)酶水平最高，為343.529 U/L。故選擇培養(yǎng)基初始pH 5.5～6.5為Plackett-Burman試驗(yàn)的因素水平。

小寫字母不同，表示差異顯著（P＜0.05）。圖5同。

2.2.2 發(fā)酵條件對(duì)假節(jié)桿菌PL-410產(chǎn)酶能力的影響

由圖5A可知，隨著接種量的增加，菌株的產(chǎn)酶水平先升高后下降。造成此現(xiàn)象的原因可能是過低的接種量會(huì)延長培養(yǎng)時(shí)間，而過高的接種量導(dǎo)致溶氧不足，從而影響Chase的合成。當(dāng)接種量為1%～10%時(shí)，菌株的產(chǎn)酶水平較高，組間沒有顯著差異，從縮小成本的角度出發(fā)，選擇接種量1%～3%為Plackett-Burman試驗(yàn)的因素水平。

由圖5B可知，菌株產(chǎn)酶水平隨著裝液量的增加而降低。當(dāng)裝液量為10%時(shí)，菌株產(chǎn)酶水平最高（352.157 U/L），因?yàn)榧俟?jié)桿菌PL-410為需氧菌，裝液量越少培養(yǎng)基溶氧越多，越有利于假節(jié)桿菌PL-410發(fā)酵產(chǎn)酶。故選擇搖瓶裝液量8%～12%為Plackett-Burman試驗(yàn)的因素水平。

由圖5C可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，菌株的產(chǎn)酶水平先升高后下降。當(dāng)發(fā)酵溫度為26～28 ℃時(shí)，菌株產(chǎn)酶水平最高，故選擇發(fā)酵溫度24～28 ℃為Plackett-Burman試驗(yàn)的因素水平。

由圖5D可知，菌株培養(yǎng)8 h后，開始產(chǎn)生Chase，隨后Chase產(chǎn)量迅速增加，在24 h達(dá)到最大值，Chase活力為1 660.588 U/L，表現(xiàn)出與菌株生長曲線相似的趨勢(shì)；24 h后Chase產(chǎn)量無明顯增加，因?yàn)?4 h后培養(yǎng)基pH值從7.79逐漸升高到8.36，pH值升高改變了Chase活性中心構(gòu)象，使Chase喪失部分活力。因此選擇發(fā)酵時(shí)間20～28 h為Plackett-Burman試驗(yàn)的因素水平。

2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

Plackett-Burman試驗(yàn)是一種能夠從眾多影響因素中篩選出可信度大于95%主效應(yīng)因素的試驗(yàn)方法。如表4所示，利用Design-Expert 11.0軟件對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行效應(yīng)分析和方差分析，結(jié)果如表5所示。模型方差P＜0.05，說明數(shù)據(jù)模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，試驗(yàn)結(jié)果具有可信度。牛軟骨CS添加量（A）、培養(yǎng)基初始pH（C）、接種量（D）和發(fā)酵時(shí)間（G）這4 個(gè)因素為正效應(yīng)，應(yīng)增加；胰蛋白胨添加量（B）、搖瓶裝液量（E）和發(fā)酵溫度（F）這3 個(gè)因素為負(fù)效應(yīng)，應(yīng)減少。其中培養(yǎng)基初始pH（C）、接種量（D）與發(fā)酵時(shí)間（G）貢獻(xiàn)率最高，P值均小于0.05，表明這3 個(gè)因素對(duì)假節(jié)桿菌PL-410產(chǎn)Chase的能力具有顯著影響，因此選擇這3 個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)確定響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。其余4 個(gè)因素則根據(jù)各自效應(yīng)值進(jìn)行取值，即選擇牛軟骨CS添加量7.5 g/L、胰蛋白胨添加量2.5 g/L、搖瓶裝液量8%、發(fā)酵溫度24 ℃。

2.4 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

如圖6所示，隨著培養(yǎng)基初始pH值的升高、接種量的增加和發(fā)酵時(shí)間的延長，Chase活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。Chase活力在3號(hào)試驗(yàn)點(diǎn)出現(xiàn)最大值，此時(shí)培養(yǎng)基初始pH值為6.5、接種量為3%、發(fā)酵時(shí)間為28 h，Chase活力為2 301.373 U/L。最終確定該點(diǎn)為下一步

2.5 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表6所示。利用Design-Expert 11.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，（表7），回歸模型顯著（P=0.000 3），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.110 4），表明回歸模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果具有極顯著影響，且未知因素對(duì)結(jié)果影響較小，模型選擇恰當(dāng)；回歸模型決定系數(shù)R2=0.963 2，表明模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間具有較高相關(guān)性，擬合程度較好[28]；回歸模型的信噪比為12.957 4，大于4，表明模型可信度高，模型可用。

利用回歸模型對(duì)表6的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合，得到假節(jié)桿菌PL-410的Chase活力對(duì)培養(yǎng)基初始pH值（A）、接種量（B）和發(fā)酵時(shí)間（C）的多元二次回歸方程：

Y=－56 745.89＋10 508.56A＋798.56B＋1 727.35C＋549.68AB＋133.44AC－14.29BC－1 212.99A2－669.24B2－46.26C2。

根據(jù)多元二次回歸方程，繪制響應(yīng)面試驗(yàn)的三維曲面圖和等高線圖。由圖7可知，培養(yǎng)基初始pH值、接種量和發(fā)酵時(shí)間之間交互作用響應(yīng)面較為陡峭，等高線橢圓程度較為明顯，表明二者間交互作用對(duì)Chase活力的影響顯著（P＜0.05）。等高線圖呈圓形表明兩因素間交互作用不顯著，呈橢圓形表明兩因素間交互作用顯著，越“扁”交互作用越顯著[29]。由圖可以看出，培養(yǎng)基初始pH值和接種量間的等高線圖相比之下更“扁”，表明這兩者的交互作用對(duì)菌株產(chǎn)酶能力影響更顯著。

利用Design-Expert 11.0軟件分析計(jì)算，預(yù)測(cè)出最優(yōu)參數(shù)分別為培養(yǎng)基初始pH 6.53、接種量2.98%、發(fā)酵時(shí)間27.63 h，此時(shí)預(yù)測(cè)假節(jié)桿菌PL-410的Chase活力為2 598.77 U/L。在上述最優(yōu)參數(shù)下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得Chase活力為（2 531.765±52.373）U/L，與預(yù)測(cè)值擬合度達(dá)97.4%，表明優(yōu)化模型可靠。優(yōu)化后假節(jié)桿菌PL-410的Chase活力（2 531.765 U/L）比優(yōu)化前（85.229 U/L）

提高28.7 倍，說明本試驗(yàn)優(yōu)化的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件顯著提高了Chase的產(chǎn)量。

劉萬順等[30]從土壤中篩選的少動(dòng)鞘氨醇單胞菌產(chǎn)Chase活力最高為1 200 U/L（發(fā)酵周期36 h）；蘇昕等[31]利用溫和氣單胞菌YH311產(chǎn)Chase活力最高為920 U/L（發(fā)酵周期36 h）；陶科等[32]從土壤中篩選的彭氏變形桿菌產(chǎn)Chase活力最高為322 U/L（發(fā)酵周期10 h）。相比之下，本研究篩選的假節(jié)桿菌PL-410具有酶活力較高、發(fā)酵周期較短的優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié) 論

本研究分離鑒定了一株具有產(chǎn)Chase的假節(jié)桿菌屬PL-410，并對(duì)產(chǎn)Chase條件進(jìn)行優(yōu)化，最終得到優(yōu)化最佳培養(yǎng)條件為：最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為牛軟骨CS添加量7.5 g/L、

胰蛋白胨添加量2.5 g/L、NaCl添加量5 g/L、KH2PO4添加量0.3 g/L、培養(yǎng)基初始pH 6.53，最佳發(fā)酵條件為接種量2.98%、搖瓶裝液量8%、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min、發(fā)酵溫度24 ℃、發(fā)酵時(shí)間27.63 h。在此條件下Chase活力比優(yōu)化前提高28.7 倍，優(yōu)化效果顯著，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為假節(jié)桿菌PL-410工業(yè)化應(yīng)用及Chase在工業(yè)、醫(yī)藥的應(yīng)用提供良好的技術(shù)基礎(chǔ)和支撐。但目前的研究處于初級(jí)階段，要實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，還需進(jìn)一步發(fā)酵工藝研究，酶的分離純化工藝、酶學(xué)特性及酶的重組表達(dá)等也有待進(jìn)一步研究。

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收稿日期：2023-07-14

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市漁業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（BAIC07-2023-13）

第一作者簡介：肖夢(mèng)圓（1996—）（ORCID： 0000-0002-5641-8049），女，碩士研究生，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物。

E-mail： 15216605538@163.com

*通信作者簡介：武瑞赟（1990—）（ORCID： 0000-0003-1030-4561），女，助理研究員，博士，研究方向?yàn)楣δ苄砸嫔睦碚撆c應(yīng)用。E-mail： wuruiyun814@163.com