炎調方維持肺泡上皮細胞水液代謝平衡減輕肺損傷的機制研究*

徐夢菡 施 榮 熊旭東

（上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海 201203）

膿毒癥是引起急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征（ALI/ARDS）重癥的常見病因，肺部大量滲出性病變引起的肺水腫是其主要病理生理表現(xiàn)［1］，治療存在難點。肺泡內外的液體平衡因多種因素被破壞從而引發(fā)肺水腫，肺泡上皮細胞（AEC）上的鈉水轉運系統(tǒng)維持肺泡內外液體平衡［2］。

課題組經過多年臨床和基礎實驗，制定了炎調方用于治療膿毒癥急性肺損傷。臨床研究顯示，炎調方能夠減輕膿毒癥致急性肺損傷（ALI）患者的炎癥反應，提高患者氧合水平?；A研究也顯示，炎調方能減輕膿毒癥致ALI大鼠炎癥介質釋放，減輕肺部滲出，但其作用機制尚未完全清楚。本實驗擬通過觀察炎調方對維持肺泡上皮細胞水液代謝平衡的影響，探討其對膿毒癥誘發(fā)急性肺損傷的可能機制，為進一步闡明炎調方治療膿毒癥致ALI的作用機制提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞

72 只清潔級SD 成年雄性大鼠（由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供），體質量200～220 g，由上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供并飼養(yǎng)。大鼠肺泡Ⅱ型細胞RLE-6TN購自中國科學院細胞庫。

1.2 試藥與儀器

炎調方由赤芍、當歸、生大黃、芒硝、桃仁、玄參等組成，以上飲片均由上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院提供，制備成含生藥1.0 g/mL 的黃棕色透明液體，4 ℃保存?zhèn)溆?。表面活性蛋白（SP-D）ELISA檢測試劑盒（上海臻科生物，ZK-5092）；ENaC、NKAα1、NKAβ1、AQP1、AQP5 和GAPDH 一抗（美國CST 公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（南京建成生物工程研究所）；RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國GIBCO 公司）。藥物血清制備：正常大鼠進行炎調方灌服，連續(xù)3 d，每日1 次，在末次灌胃1 h 后從進行腹腔動脈取血，在無菌條件下進行分離血清、加熱滅活備用。CO2細胞恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermoforma 公司），Healforce 生物安全柜（香港力康發(fā)展有限公司），倒置顯微鏡（CKX41）（日本Olympus 公司），勻漿器Polytron PT10-35 組織擴散儀（瑞士Kinematica 公司），WH-861漩渦混合器（上?？七_測試儀器廠）。

1.3 模型制備

膿毒癥模型采用盲腸結扎穿孔術（CLP）制備：大鼠用2% 戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，在腹正中行1.5 cm切口，找到盲腸并在根部進行結扎，用18號針穿孔3 次，擠出少量腸內容物，留置2 mm 皮瓣防止針孔閉合，將盲腸回納入腹腔，縫合腹壁，術后在皮下注射生理鹽水（30 mL/kg）抗休克。

1.4 分組與給藥

72 只雄性SD 大鼠隨機分為4 組。正常對照組6只，麻醉后腹主動脈采血。假手術組6 只，麻醉后開腹后僅翻動腸道，然后關腹，12 h后麻醉并腹主動脈采血致死。模型組24 只，分別在CLP 后的2、8、12、24、48 h麻醉并腹主動脈采血致死，每個時間點6 只。炎調方組：造模前進行炎調方灌胃（9.9 g/kg）3 d，每日1 次，第3 次灌胃后2 h 行CLP 術造模，分別于CLP 后2、8、12、24 h麻醉并腹主動脈采血致死，每個時間點6只。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 肺濕/干重比 將大鼠的左肺取出，使用干燥濾紙吸去組織表面的多余水分，放置在電子天平上稱重（濕重），后置于60 ℃烤箱內進行干烤處理，持續(xù)時間為72 h，干烤結束后待其冷卻再次稱重（干重），計算肺的濕/干重比（濕/干重比=濕重÷干重）。

1.5.2 血氣指標 在CLP后的2、8、12、24、48 h麻醉大鼠并穿刺腹主動脈采血2 mL，立即將血樣轉移到血氣分析儀中進行分析，以測量大鼠動脈血液中的氧分壓（PO2）和二氧化碳分壓（PCO2）。

1.5.3 細胞存活率 采用MTT 比色法檢測炎調方含藥血清10%、20%、30%濃度對LPS 誘導的大鼠肺泡Ⅱ型細胞RLE-6TN 存活率的影響。LPS 100 ng/mL 預處理細胞2 h，再加入不同濃度的炎調方含藥血清，培養(yǎng)2、12 h，避光環(huán)境下每孔加入5 g/L MTT 溶液20 μL，37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清，每孔加入DMSO 150 μL。觀察490 nm 波長處的吸光度OD。細胞存活率=OD藥物組÷OD空白組×100%。

1.5.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 按照ELISA試劑盒說明書進行大鼠血清和細胞上清液中SP-D的含量檢測。

1.5.5 免疫細胞化學檢測 制備細胞爬片，經磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗、4%多聚甲醛固定、3%過氧化氫處理、血清封閉等步驟，加入一抗，4 ℃孵育過夜。次日，PBS沖洗，滴加熒光二抗，讀片。免疫印跡法檢測：配制蛋白裂解液RIPA∶PMSF（100∶1），加入肺組織碎塊中，蛋白裂解液與組織體積比為9∶1，勻漿，12 000 r/min，4 ℃條件下離心15 min，取上清。提出蛋白，BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度，計算各組蛋白上樣體積。SDSPAGE，濃縮膠80 V，分離膠恒壓110 V，待溴酚藍至凝膠底部停止電泳。轉膜、封閉、一抗（1∶1 000）孵育4 ℃過夜，二抗（1∶10 000）稀釋，室溫下孵育2 h 后?；瘜W發(fā)光成像系統(tǒng)進行檢測、拍照。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠肺濕重/干重（W/D）比較

見表1。造模后2 h和8 h，炎調方低、中、高劑量組的大鼠肺濕重/干重與模型組無顯著差異（P＞0.05）；造模后12 h，僅炎調方高劑量組能顯著降低膿毒癥大鼠肺濕重/干重（P＜0.05），而在24 h 和48 h，與模型組比較，炎調方中、高劑量組均降低了膿毒癥大鼠肺濕重/干重（P＜0.05）。

表1 各組膿毒癥大鼠肺濕重/干重比較（±s）

表1 各組膿毒癥大鼠肺濕重/干重比較（±s）

注：與模型組比較，*P ＜0.05。下同。

組 別假手術組模型組低劑量組中劑量組高劑量組2 h 3.73±0.29 4.19±0.58 4.25±0.51 4.17±0.52 4.11±0.25 8 h 3.69±0.29 4.87±0.63 4.40±0.36 4.33±0.45 4.33±0.27 12 h 3.75±0.29 5.27±0.27 5.12±0.15 4.86±0.18 4.31±0.15*24 h 3.77±0.29 5.65±0.19 5.64±0.25 5.02±0.14*4.60±0.15*48 h 3.67±0.29 5.70±0.58 5.46±0.68*5.01±0.30*4.49±0.26*

2.2 各組大鼠血氣指標比較

見表2。造模后2 h、8 h 和12 h，炎調方低、中、高劑量組PO2與模型組無顯著差異（P＞0.05）；而在造模后24 h 和48 h，與模型組比較，炎調方中、高劑量組均升高了膿毒癥大鼠PO2（P＜0.05）。造模后2 h和8 h，炎調方低、中、高劑量組PCO2與模型組無顯著差異（P＞0.05）；造模后12、24、48 h，炎調方低、中、高劑量組顯著降低了膿毒癥大鼠PCO2（P＜0.05）。

表2 各組大鼠PO2、PCO2比較（mmHg，±s）

表2 各組大鼠PO2、PCO2比較（mmHg，±s）

組 別假手術組模型組低劑量組中劑量組高劑量組PO2 PCO2 PO2 PCO2 PO2 PCO2 PO2 PCO2 PO2 PCO2 2 h 98.15±1.41 44.15±1.41 90.56±3.72 48.55±3.72 89.87±2.08 48.87±2.08 91.56±3.41 47.59±3.41 91.57±0.75 47.57±0.70 8 h 99.18±0.35 45.18±0.35 82.85±3.94 50.85±3.94 84.48±4.32 49.48±4.32 86.32±3.57 49.32±3.57 85.40±9.53 48.40±9.53 12 h 99.86±2.24 45.86±2.24 76.22±1.59 53.85±3.94 80.72±2.73 49.48±4.32 83.08±6.38 43.82±0.78*84.88±2.50 43.40±2.32*24 h 98.76±0.83 44.76±0.83 67.32±2.36 55.54±2.32 67.56±3.33 54.52±3.16 75.28±6.27*49.35±2.48*83.12±4.13*47.78±2.36*48 h 98.69±0.67 44.69±0.67 62.37±7.02 58.37±0.97 65.29±9.94 56.29±3.72 73.35±3.29*51.35±3.92*79.39±5.66*50.39±2.91*

2.3 各組大鼠血清SP-D水平比較

見表3。造模后2、8、12 h，炎調方低、中、高劑量組SP-D 與模型組無顯著差異（P＞0.05）；造模后24 h 和48 h，與模型組比較，炎調方中、高劑量組均降低了膿毒癥大鼠SP-D 水平（P＜0.05），且在造模48 h 后，炎調方低劑量組也能顯著抑制模型組誘導的SP-D 水平（P＜0.05）。

表3 各組大鼠SP-D水平比較（g/L，±s）

表3 各組大鼠SP-D水平比較（g/L，±s）

組 別假手術組模型組低劑量組中劑量組高劑量組2 h 39.27±4.28 102.20±25.24 99.92±12.92 98.58±30.37 98.98±15.45 8 h 39.38±3.56 107.20±22.44 101.40±21.27 99.53±14.25 99.67±14.01 12 h 42.23±2.60 88.57±5.98 87.07±16.75 83.95±9.29 82.57±15.44 24 h 41.40±4.25 100.02±4.65 94.58±8.96 92.30±17.57*72.22±11.09*48 h 39.77±3.27 97.35±9.57 84.28±18.19*86.10±15.45*79.58±15.85*

2.4 各組大鼠肺組織中離子通道相關蛋白表達比較

見圖1。膿毒癥手術造模后，模型組離子通道相關蛋白表達均低于假手術組；造模2、8、12、24、48 h，炎調方均以劑量依賴性地增加α-ENaC、NKAα1、NKAβ1蛋白表達；造模48 h，炎調方高劑量組顯著增加了AQP1蛋白表達；造模8 h，炎調方高、中、低劑量組均能提高AQP5表達。

圖1 各組大鼠肺組織中α-ENaC、NKAα1、NKAβ1、AQP1和AQP5蛋白表達

2.5 各組大鼠肺泡Ⅱ型細胞存活率比較

見表4。LPS干預細胞后，炎調方不同濃度處理細胞2 h對其存活率無顯著影響；而炎調方不同濃度處理細胞12 h 后，顯著提高了RLE-6TN 細胞的存活率（P＜0.05）。

表4 各組大鼠肺泡巨噬細胞RLE-6TN存活率比較（%，±s）

表4 各組大鼠肺泡巨噬細胞RLE-6TN存活率比較（%，±s）

組 別假手術組模型組低劑量組中劑量組高劑量組2 h 1.58±0.07 1.38±0.05*1.39±0.06 1.41±0.04 1.48±0.07 12 h 2.07±0.03 1.59±0.07*1.62±0.03 1.68±0.05*1.76±0.02*

2.6 各組大鼠肺泡巨噬細胞RLE-6TN 上清中SP-D水平比較

見表5。炎調方中劑量（20%藥物血清）和高劑量（30%藥物血清）處理細胞12 h均顯著降低了LPS 誘導的SP-D水平（P＜0.05）。

表5 各組大鼠肺泡巨噬細胞RLE-6TN上清中SP-D水平比較（g/L，±s）

表5 各組大鼠肺泡巨噬細胞RLE-6TN上清中SP-D水平比較（g/L，±s）

組 別對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組2 h 13.49±0.89 23.04±1.07*21.26±1.36 21.59±0.43 19.24±1.71△12 h 15.18±1.09 36.05±2.11*36.29±3.01 31.19±1.28△25.83±0.81△

2.7 各組大鼠肺泡Ⅱ型細胞RLE-6TN 中離子通道相關蛋白表達

見圖2。免疫熒光實驗顯示，炎調方處理細胞2、12 h，中、高劑量藥物血清均能增加α-ENaC、NKAα1、NKAβ1、AQP1和AQP5蛋白表達。

圖2 各組大鼠肺泡Ⅱ型細胞RLE-6TN中α-ENaC、NKAα1、NKAβ1、AQP1和AQP5蛋白表達

3 討 論

膿毒癥是宿主對感染反應失調引起的危及生命的器官功能障礙，其誘發(fā)ALI/ARDS 與多種信號通路相關［3-5］。有關ALI/ARDS 的治療仍是當前難點，除積極抗感染治療原發(fā)病外，現(xiàn)代醫(yī)學以機械通氣、血液凈化等治療為主要措施，但未能有效降低死亡率。通過臨床觀察，筆者發(fā)現(xiàn)膿毒癥主要證型為熱毒內盛證。究其病因病機乃邪毒內陷于腑，容于營血。針對以上主要病機，筆者臨床應用炎調方發(fā)現(xiàn)其對膿毒癥中多種炎癥介質超量釋放具有抑制作用，并能改善ALI 患者氧合［6-8］。為進一步研究其可能機制，筆者開展了動物實驗，研究結果顯示炎調方能有效保護肺組織，減輕肺部滲出［9-10］。

膿毒癥引起的多種炎癥細胞和炎性介質浸潤易引起AEC 受損［11-12］，最終導致大量液體在肺間質及肺泡內聚集，出現(xiàn)嚴重通氣/血流比例失調，發(fā)展為ALI/ARDS［2］。AEC 對液體重吸收能力是減輕肺水腫的關鍵因素，AECⅡ主要負責維持正常肺水轉運，使肺泡內外液體維持平衡［13］。肺泡上皮細胞鈉水轉運系統(tǒng)由Na+-K+-ATP 酶（NKA）、鈉通道（ENaC）、水通道（AQP）組成。AECⅡ上的鈉通道以ENaC-α 為主，過量肺泡液的吸收依賴于NKA 和ENaC 活性［14-16］。同時，AECI覆蓋面占肺泡總面積的90%，其上也存在ENaC，在鈉水轉運系統(tǒng)中也占有重要地位［17］。AQP1 和AQP5 是重要的水通道蛋白，研究表明，LPS 可以通過抑制AQP1和AQP5的表達從而誘導大鼠急性肺損傷［18］。

基于以上研究進展，為進一步明確炎調方治療ALI/ARDS的可能機制，筆者假設炎調方抑制膿毒癥大鼠肺部滲出的機制可能與通過肺泡上皮細胞調節(jié)水液代謝有關。研究通過體內與體外實驗相結合，圍繞鈉水轉運系統(tǒng)開展。動物實驗結果顯示，炎調方能顯著抑制模型組誘導的肺濕重/干重增加，降低SP-D 水平，降低PO2和PCO2，說明炎調方可以緩解模型組誘導的肺損傷。進一步發(fā)現(xiàn)炎調方組中鈉水轉運系統(tǒng)蛋白表達增加，表明炎調方可能通過增強鈉水轉運系統(tǒng)從而減輕肺水腫。體外實驗顯示，炎調方能顯著降低了LPS 誘導的RLE-6TN 的死亡率以及SP-D 水平，增加鈉水轉運系統(tǒng)蛋白表達。以上結果說明，炎調方能通過調節(jié)大鼠AECII 調控鈉水轉運系統(tǒng)保障肺泡內外液體平衡，緩解膿毒癥大鼠肺水腫。結合以上結果，筆者進一步豐富了炎調方治療膿毒癥致ALI/ARDS 的作用機制。

ALI/ARDS病理生理由多種細胞和信號通路參與，但目前相關機制仍未完全明確，也導致我們的研究存在一定的局限性。也因中藥復方組成成分的復雜性和作用機制可能存在多靶點，因此，炎調方治療ALI有效成分和核心機制仍需進一步研究闡明。