通竅活血湯通過激活音猬因子信號通路減輕腦缺血后大鼠腦水腫的實驗研究*

白馬瑞雪 葉育鋒 柏魯寧

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712046）

腦缺血（IS）是腦血流中斷引起的嚴(yán)重神經(jīng)損傷疾病，屬中醫(yī)“中風(fēng)”范疇。IS 的病理特征之一是血腦屏障（BBB）完整性的破壞［1］，通透性增大，使腦水腫加重［2-3］，而腦水腫是IS 最常見和最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響患者預(yù)后［4］。目前臨床上IS的藥物治療方法有限，迫切需要新的治療方法。研究發(fā)現(xiàn)，Shh/Gli1 信號通路在IS 后表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用，星形膠質(zhì)細(xì)胞可分泌音猬因子（Shh）上調(diào)BBB 的完整性［5-6］。中醫(yī)學(xué)對中風(fēng)有良好的預(yù)防和治療作用，通竅活血湯可修復(fù)腦缺血后Claudin5（Cldn5）蛋白的結(jié)構(gòu)，下調(diào)水通道蛋白4（AQP4）蛋白表達(dá)，降低BBB 的通透性［7］。但通竅活血湯是否通過激活Shh信號通路來調(diào)控BBB 的完整性，減輕腦水腫從而發(fā)揮對大腦中動脈閉塞（MCAO）大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，目前報道較少。本研究以MCAO 大鼠為模型，以Shh 信號通路為切入點，通過研究通竅活血湯對MCAO 大鼠BBB 相關(guān)蛋白的影響，進(jìn)一步探討通竅活血湯減輕腦缺血大鼠腦水腫的可能機(jī)制，為臨床防治IS提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選雄性SD 大鼠72 只，周齡（10±1）周，體質(zhì)量（300±10）g，由成都達(dá)碩實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK（川）2022-030，在陜西省中醫(yī)藥管理局中藥藥效機(jī)制與物質(zhì)基礎(chǔ)重點研究室飼養(yǎng)，相對濕度45%～55%，溫度20～25 ℃。適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。動物實驗的飼養(yǎng)、手術(shù)操作以及標(biāo)本收集均經(jīng)過陜西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審核通過（SUCMDL30210924001）。

1.2 實驗藥物

通竅活血湯：生姜50 g，赤芍30 g，人工麝香1.5 g，大棗70 枚，川芎30 g，桃仁90 g，蔥30 g，紅花90 g。將中藥材置于10 倍量的黃酒中浸泡1 h，加熱回流提取3次，每次2 h，將3 次濾液合并，蒸發(fā)，濃縮，加入黃酒稀釋液和麝香，再次過濾，配制成含生藥2 g/mL 的溶液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。中藥飲片均購自陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院鑒定為正品。尼莫地平片（山西亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字號H14022821）。黃酒（紹興柯橋第三酒廠）。

1.3 試劑與儀器

HE 染液套裝、通用型組織固定液（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號分別為：G1003、G1101）；Shh 抗體、Gli1 抗體、Cldn5 抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號分別為：20697-1-AP、66905-1-Ig、29767-1-AP）；AQP4 抗體（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號：GB11530）。水迷宮（上海吉量軟件科技有限公司，型號：JLBehv-MWMG）；包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司，型號：JB-P5）；病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016）；組織攤片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，型號：KD-P）；組化筆（武漢塞維爾生物科技有限公司，G6100）；顯微鏡（尼康儀器有限公司，型號：E100）。

1.4 分組及給藥

適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d 后，將72 只大鼠隨機(jī)分為6 組，每組12 只，即假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組及中藥低、中、高劑量組。根據(jù)人與大鼠換算比計算，連續(xù)7 d對各組大鼠進(jìn)行藥物干預(yù)：假手術(shù)組、模型組灌胃生理鹽水6 g/kg，每日1 次；尼莫地平組灌胃尼莫地平藥液10 mg/kg，每日1 次；中藥低、中、高劑量組分別灌胃通竅活血湯2.9、5.8、11.6 g/kg，每日1次。

1.5 模型制備

最后1 次藥物干預(yù)結(jié)束2 h 后，開始造模。大鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水，采用經(jīng)典改良Zea-Longa 線栓法［8］制備大鼠MCAO 模型。取20%烏拉坦（1 g/kg）腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺。選擇大鼠頸部正中偏右備皮、消毒行縱向手術(shù)切口，鈍性分離并暴露皮下組織，找到頸總動脈（CCA）交叉處，分離迷走神經(jīng)、CCA、頸內(nèi)動脈（ICA）與頸外動脈（ECA）。插入線栓約17～18 mm遇到阻力時停止，使線栓經(jīng)CCA與ICA到達(dá)大腦中動脈，固定線栓，將CCA外多余線栓剪掉，傷口消毒縫合。假手術(shù)組大鼠僅分離血管不插入線栓，其余步驟與模型組相同。待大鼠清醒后行神經(jīng)功能學(xué)評分，分值1～3 分為造模成功。對造模失敗或意外死亡的大鼠，選擇同批次SD大鼠按相應(yīng)組別要求補足實驗大鼠數(shù)量。

1.6 標(biāo)本采集與檢測

1.6.1 神經(jīng)功能學(xué)評分 造模24 h 后使用Zea-longa神經(jīng)功能評分法［8］（5 級4 分法）對大鼠神經(jīng)功能缺損程度進(jìn)行評定。分?jǐn)?shù)高低與腦功能正常與否呈反比。

1.6.2 Morris 水迷宮實驗 造模前5 d 將大鼠放入水迷宮行定位航行試驗，每天分別從第1、4 象限將大鼠放入水中訓(xùn)練2次。第6日進(jìn)行空間探索實驗，將平臺撤離并取原平臺所在對象限作為大鼠入水點。記錄90 s內(nèi)大鼠穿過原平臺所在位置的次數(shù)及停留原平臺象限所用時間。造模后24 h 再次行空間探索實驗，完成后整理數(shù)據(jù)并評估造模后大鼠空間記憶能力的差異。實驗過程中保證實驗環(huán)境的固定和安靜。

1.6.3 腦組織病理學(xué)觀察 腹腔注射20%烏拉坦麻醉處死，取缺血側(cè)海馬組織用4%甲醛溶液固定24 h以上。將組織修整、標(biāo)記。依次行脫水、浸蠟、包埋、切片，-20 ℃冰箱冰凍切片；脫蠟、復(fù)溫固定、HE 染色、脫水、中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.6.4 免疫組織化學(xué)法檢測腦組織Shh、Gli1、Cldn5、AQP4 蛋白的表達(dá) 如前述方法取缺血側(cè)海馬組織石蠟包埋、切片后，脫蠟、抗原修復(fù)、封閉、敷一抗、敷二抗、顯色、復(fù)染、脫水、封片膠封片，顯微鏡下觀察。

1.6.5 蛋白免疫印跡（Western blotting）法檢測腦組織Shh、Gli1、Cldn5、AQP4 蛋白的表達(dá) 取鮮腦后，迅速于冰袋上將缺血側(cè)海馬組織取出放入無菌EP管，置于液氮罐中，過夜后存儲于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩z測時將海馬組織研磨，加入裂解緩沖液，提取總蛋白、測定蛋白濃度、SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜及抗體孵育、顯像處理。掃描后分析膠片目的條帶的灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗；非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗進(jìn)行分析。計量資料均以（±s）表示。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較

見表1。造模24 h 后，假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能評分為0 分，無神經(jīng)功能缺損；模型組評分為（2.75±0.45）分，在各組大鼠中評分最高，神經(jīng)功能缺損最嚴(yán)重，說明造模成功。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠神經(jīng)功能評分顯著增高（P＜0.05）；與模型組相比，尼莫地平組及通竅活血湯中、高劑量組大鼠神經(jīng)功能評分顯著降低（均P＜0.05）；與尼莫地平組相比，中藥中、高劑量組大鼠神經(jīng)功能評分略高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分、穿越平臺次數(shù)和平臺所在象限停留時間比較（±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分、穿越平臺次數(shù)和平臺所在象限停留時間比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與尼莫地平組比較，△P ＜0.05。下同。

組 別假手術(shù)組模型組尼莫地平組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 12 12 12 12 12 12神經(jīng)功能評分（分）0 2.75±0.45*1.33±0.49#2.33±0.49△1.42±0.52#1.58±0.67#穿越平臺次數(shù)（次）3.33±0.78 0.92±1.00*3.08±1.44#1.33±0.78△3.25±0.87#2.31±1.35△停留時間（s）40.41±3.01 14.67±1.10*24.83±0.91#17.40±0.71#△27.49±4.52#19.64±0.73#△

2.2 各組大鼠空間記憶能力比較

見表1。經(jīng)過5 d 訓(xùn)練各組大鼠造模前游泳軌跡差別不大。造模24 h后，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠穿越平臺次數(shù)與平臺所在象限停留時間顯著減少（P＜0.05）；與模型組比較，尼莫地平組和中藥中劑量組大鼠穿越平臺次數(shù)顯著增加（P＜0.05），平臺所在象限停留時間顯著延長（P＜0.05）；與尼莫地平組相比，通竅活血湯中劑量組大鼠穿越平臺次數(shù)與平臺所在象限停留時間略高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 各組大鼠腦組織病理學(xué)

假手術(shù)組海馬組織細(xì)胞形態(tài)正常，胞質(zhì)胞核邊界清楚，排列緊密，為細(xì)胞正常形態(tài)。模型組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)明顯異常，細(xì)胞排列紊亂，可見大量細(xì)胞核破裂，核固縮深染，細(xì)胞明顯水腫且大量壞死，而中藥中劑量組與尼莫地平組細(xì)胞壞死現(xiàn)象減輕，細(xì)胞水腫程度較模型組減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理觀察（HE染色，200倍）

2.4 各組大鼠腦組織Shh、Gli1、Cldn5、AQP4 蛋白表達(dá)比較

見圖2。假手術(shù)組中，海馬內(nèi)Shh、Gli1、Cldn5、AQP4 正常表達(dá)，呈淺棕色或棕色。與假手術(shù)組相比，模型組Shh、Gli1 黃色或棕色顆粒表達(dá)略增多，蛋白表達(dá)增高不明顯；Cldn5 黃色著色區(qū)域明顯減少，蛋白表達(dá)顯著減少；AQP4 棕色或褐色顆粒明顯增多，蛋白表達(dá)顯著增多。與模型組相比，尼莫地平組和中藥中劑量組Shh、Gli1、Cldn5 黃色或棕色顆粒增多，表達(dá)顯著增多；AQP4棕色著色變淺，表達(dá)顯著減少。

圖2 各組大鼠腦組織蛋白表達(dá)（免疫組化染色，200倍）

2.5 各組大鼠腦組織Shh、Gli1、Cldn5、AQP4 蛋白的表達(dá)比較

見表2、圖3。與假手術(shù)組比較，模型組Shh、Gli1表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；Cldn5 蛋白顯著減少（P＜0.01）；AQP4 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，尼莫地平組與中藥中劑量組Shh、Gli1 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）；中藥中劑量組Cldn5 蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）、AQP4 表達(dá)下調(diào)（P＜0.01）；與尼莫地平組相比，中藥中劑量組大鼠Shh、Gli1、Cldn5蛋白略高，AQP4蛋白表達(dá)略低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

圖3 各組大鼠腦組織蛋白表達(dá)條帶

表2 各組大鼠Shh、Gli1、Cldn5、AQP4蛋白相對表達(dá)量比較（±s）

表2 各組大鼠Shh、Gli1、Cldn5、AQP4蛋白相對表達(dá)量比較（±s）

組 別假手術(shù)組模型組尼莫地平組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n3 3 3 3 3 3 Shh 1.00±0 1.82±0.11*3.47±0.19##2.44±0.12 4.82±0.53##3.13±0.15##Gli1 1.00±0 1.71±0.06*3.24±0.19##2.59±0.19#3.42±0.17##3.35±0.40##Cldn5 1.00±0 0.59±0.04**0.82±0.01##0.66±0.02 0.97±0.03##0.82±0.05##AQP4 1.00±0 3.05±0.59**1.74±0.25#2.47±0.42 1.34±0.20##1.99±0.30#

3 討 論

IS 的發(fā)病率、致死率及疾病負(fù)擔(dān)有逐年升高的態(tài)勢，近年來已逐漸成為我國居民第一大死亡原因［9-10］。目前臨床上已做出各種努力來改善中風(fēng)發(fā)作后的結(jié)局，如及時的靜脈溶栓治療和機(jī)械性血栓切除術(shù)，以實現(xiàn)腦血管再通［11］。幾乎所有無禁忌證的患者都推薦使用抗血小板或抗凝劑等抗血栓治療［12］，但對IS 的藥物治療效果仍有限，迫切需要新的治療方法。

局部缺血后，腦組織ATP 合成中斷、能量缺乏、離子穩(wěn)態(tài)受損導(dǎo)致BBB 結(jié)構(gòu)破壞，通透性增大，導(dǎo)致腦水腫［2］。腦容量受到顱骨剛性的限制，即使是微小的容量增加，也會導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高、腦疝等嚴(yán)重后果，故腦水腫對IS 的發(fā)病率和死亡率有重要影響［13］。中醫(yī)治療中風(fēng)歷史悠久，中藥可通過多靶點、多途徑作用于IS，臨床療效顯著［14］。通竅活血湯是著名中醫(yī)經(jīng)典方劑，對IS有神經(jīng)保護(hù)作用，已被廣泛用于治療IS患者［15］。研究發(fā)現(xiàn)［7］，腦缺血后，通竅活血湯可上調(diào)Cldn5表達(dá)，下調(diào)AQP4 表達(dá)，降低BBB 的通透性，減輕腦水腫，但通竅活血湯調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)、保護(hù)BBB 的具體機(jī)制仍不清楚。

BBB是可以精確控制大腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的物理和生化屏障，由緊密排列的血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞等細(xì)胞組成。內(nèi)皮細(xì)胞間由緊密連接（Tjs）蛋白連接，Cldn5是Tjs的主要蛋白之一，保證腦血管完整性和BBB 功能。其結(jié)構(gòu)的破壞會使血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞旁通透性增高，導(dǎo)致腦組織水腫；同時會使炎癥因子、血漿和血清蛋白等進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致神經(jīng)炎癥，進(jìn)一步加重BBB 破壞，形成惡性循環(huán)［16］。研究發(fā)現(xiàn)，腦組織缺血缺氧使Cldn5 蛋白結(jié)構(gòu)破壞，BBB 通透性增加，加重腦水腫［17］。AQP4 是大腦中主要的水通道蛋白，集中在血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞足突上表達(dá)，兼具細(xì)胞外滲透壓感受器和水平衡調(diào)節(jié)器的功能，對腦組織水分子的轉(zhuǎn)運起主導(dǎo)作用，對維持腦組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要作用［18］；同時AQP4 與腦脊液的分泌和重吸收有關(guān)，而腦脊液是IS 水腫液的主要來源［19-20］。腦缺血后，星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)外的電解質(zhì)平衡紊亂，使?jié)B透壓梯度發(fā)生變化，上調(diào)了AQP4 的表達(dá)，改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致星型膠質(zhì)細(xì)胞水腫［21］，增加了BBB 通透性和細(xì)胞水分滲透性，使血管內(nèi)液體與周圍腦脊液加速流入腦實質(zhì)［19］。在AQP4 被抑制后，這種內(nèi)流顯著減少，使流向腦組織的水滲透減少，顯著減輕腦水腫［22］。本實驗結(jié)果顯示，模型組Cldn5表達(dá)最少、AQP4 表達(dá)增強，說明模型組大鼠BBB 破壞最為嚴(yán)重，腦水腫程度最大；而中藥中劑量組Cldn5 表達(dá)明顯回升、AQP4 表達(dá)明顯減少，說明通竅活血湯通過調(diào)控Cldn5 和AQP4 蛋白表達(dá)保護(hù)缺血后BBB，減輕腦水腫，改善MCAO 大鼠神經(jīng)功能缺損程度與空間記憶能力。這與汪寧等［7］的研究結(jié)果一致。

Shh 信號通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生、發(fā)育中起重要作用，該信號通路已成為治療IS 的新靶點。腦組織缺血缺氧后，星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌Shh，與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的Ptch蛋白結(jié)合，解除Ptch對Smo蛋白的抑制，后者在初級纖毛細(xì)胞器中積累并啟動下游信號通路級聯(lián)，觸發(fā)Gli1 的激活。Gli1 是一種轉(zhuǎn)錄激活因子，其存在表明細(xì)胞Shh 活性活躍［23］。研究發(fā)現(xiàn)，Shh 信號通路可修復(fù)MCAO動物模型的Tjs蛋白，顯著減輕腦水腫和維持BBB 的通透性［24］，而Shh 信號傳導(dǎo)抑制劑環(huán)巴胺可逆轉(zhuǎn)這一作用［25］。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織中Shh 與Gli1 蛋白表達(dá)略增多，表明僅在缺血刺激下，Shh 信號通路不能被完全激活；與模型組比較，中藥中劑量組大鼠Shh 與Gli1 蛋白表達(dá)顯著增多，提示通竅活血湯可在一定程度上激活Shh信號通路表達(dá)。

綜上所述，通竅活血湯對MCAO 大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過激活Shh/Gli1信號通路，調(diào)控Cldn5表達(dá)增加、AQP4 表達(dá)減少來保護(hù)BBB 完整性，達(dá)到減輕腦水腫的效果，但是其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。本實驗仍存在諸多不足，如實驗中未應(yīng)用Shh 抑制劑更進(jìn)一步說明通竅活血湯可激活Shh 通路發(fā)揮作用。我們將在后續(xù)的實驗中進(jìn)一步研究他們之間的關(guān)系。