恒溫?cái)U(kuò)增芯片法對(duì)下呼吸道病原體聯(lián)合檢測(cè)的臨床應(yīng)用

成彬 田剛 劉艷枚 陳晨 周鵬 周美芳 羅瑛 尹衛(wèi)國(guó)★

下呼吸道感染（lower respiratory tract infection，LRTI）是全球因傳染病導(dǎo)致死亡的主要原因之一，在世界十大死亡病因中排名第四，在發(fā)展水平較低的國(guó)家中，下呼吸道感染疾病的在死亡原因中更是靠前，在我國(guó)也是最常見的疾病之一［1］，發(fā)病率和死亡率都很高，主要由細(xì)菌、病毒、真菌、支原體、衣原體甚至寄生蟲等引起，包括氣管、支氣管、細(xì)支氣管和肺組織等炎癥［2］。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，LRTI 的病原菌譜不斷變化，增加了臨床診斷和治療的難度。因此，快速、準(zhǔn)確地找到真正感染的病原體是臨床亟待解決的問題。傳統(tǒng)的鑒定方法主要是病原菌的分離、培養(yǎng)［3］、免疫學(xué)方法。然而，這些方法操作繁瑣且耗時(shí)長(zhǎng)，診斷的敏感性和特異性相對(duì)較低。常用的分子生物學(xué)技術(shù)有核酸雜交技術(shù)、PCR 技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、測(cè)序技術(shù)等等。近年來，有大量文章報(bào)道，恒溫?cái)U(kuò)增芯片法（isothermal amplification chip，IAMP）聯(lián)合應(yīng)用了LAMP，微流控芯片和熒光數(shù)字信號(hào)處理技術(shù)，能夠同時(shí)檢測(cè)出13 種病原體，特異性強(qiáng)、敏感性高，因檢測(cè)操作簡(jiǎn)單、快速準(zhǔn)確，對(duì)技術(shù)水平要求相對(duì)較低，所需實(shí)驗(yàn)器材簡(jiǎn)單，已被廣泛應(yīng)用于感染性疾病的診斷中［4］。本研究通過對(duì)本院9 078 例疑似下呼吸道感染患者進(jìn)行13 種下呼吸道病原體檢測(cè)，并通過統(tǒng)計(jì)分析檢測(cè)結(jié)果，為L(zhǎng)AMP 聯(lián)合芯片技術(shù)應(yīng)用于臨床早期診治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2019 年1 月至2022 年7 月于清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院門診及住院部就診的患者標(biāo)本9 078 例。其中男性6 478 例，女性2 600 例，年齡范圍為0～104 歲，中位年齡（62.47±17.09）歲。按年齡分為3 組：＜18歲組222 例，18～59 歲組3 265 例，＞59 歲組5 591例。按就診時(shí)間分為春季（3 月～5 月）2 659 例，夏季（6 月～8 月）2 545 例，秋季（9 月～11 月）1 533 例，冬季（12 月～2 月）2 341 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①門診及住院就診疑似下呼吸道感染的患者；②有發(fā)熱咳嗽等呼吸道感染癥狀或胸部提示有下呼吸道感染體征；③標(biāo)本類型為痰液或肺泡灌洗液；排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料不完整；②檢測(cè)結(jié)果不完整；③標(biāo)本類型非痰液或肺泡灌洗液。9 078 例患者主要來自危重醫(yī)學(xué)病科5 828 例（64.20%），其次為呼吸科2 161 例（23.80%），腦科513 例（5.65%），兒科129 例（1.42%），其他臨床科室447 例（4.92%），＞59歲成年人多見，為5 591 例（61.59%）。本研究?jī)?nèi)容已經(jīng)通過院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本要求

采集患者的痰液或肺泡灌洗液標(biāo)本，樣本量不少于0.6 mL，置于無菌容器內(nèi)，密封送檢。

1.2.2 儀器與試劑

恒溫?cái)U(kuò)增儀和配套試劑均來自北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司，包括呼吸道病原菌核酸檢測(cè)試劑盒、細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒和RTisochipTM-W 微流控恒溫?cái)U(kuò)增核酸分析儀等。液化標(biāo)本的10%NaOH 溶液為實(shí)驗(yàn)室自配。

1.2.3 標(biāo)本檢測(cè)

按照說明書步驟進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果判定使用相應(yīng)軟件進(jìn)行分析。本試劑盒的每個(gè)芯片的每個(gè)反應(yīng)池都包埋固定一套引物，用于一種核酸靶序列的擴(kuò)增與檢測(cè)，可一步完成對(duì)13 種常見下呼吸道病原菌的檢測(cè)，包括肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae.Mpn），肺炎衣原體（Chlamydia pneumoniae，Cpn），肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumonia，Spn），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，Sau），大腸埃希氏菌（Escherichia coli，Eco），肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，Kpn），銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pae），鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii，Aba），嗜麥芽窄食單胞菌（Streptomonas maltophilia，Sma），耐甲氧西林葡萄球菌（Methicillinresistant Staphylococcus，MecA），結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（Mycobacterium tuberculosis complex，Mtb），流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae，Hin），嗜肺軍團(tuán)菌（Legionella pneumonia，Lpn）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Excel 處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 下呼吸道病原體檢出情況

患者下呼吸道病原體總檢出率為62.18%（5 645/9 078），檢出的主要病原體為Aba 30.39%（2 759/9 078），Kpn 24.59%（2 232/9 078），Pae 16.19%（1 470/9 078）。見圖1。其中，單一感染占29.39%（2 668/9 078）。多重感染占32.79%（2 977/9 078），其中二重感染為主，三重及以上感染較少見。見表1。

2.2 不同性別病原體檢出情況

男性患者檢出至少一種病原體陽性4 166 例，陽性率為64.1%（4 166/6 478）；女性患者檢出至少一種病原體陽性1 479 例，陽性率為56.88%（1 479/2 600）。男性患者陽性率高于女性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=43.501，P＜0.001），其中男性患者的Kpn，Pae，Aba，Sma 的感染陽性率均高于女性患者，女性患者的Cpn 的感染陽性率高于男性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表2。

表2 不同性別下呼吸道感染病原體陽性率比較［n（%）］Table 2 Comparison of pathogen positive rate of lower respiratory tract infection with different genders［n（%）］

2.3 三組病原體檢出情況

三組患者感染陽性率分別為72.97%（162/222），55.22%（1 803/3 265），65.82%（3 680/5 591），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=109.718，P＜0.001）。＞59 歲組的Aba、Eco、Pae 和Sma 的陽性率均高于＜18 歲組和18～59 歲組，Spn、Cpn 以及Hin 的感染陽性率＜18 歲組均高于18～59 歲組及＞59 歲組，18～59 歲組的Mtb 感染陽性率高于＜18 歲組和＞59 歲組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。三組間Kpn、Mpn、Lpn 和MecA 的陽性率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各年齡組下呼吸道感染病原體陽性率比較［n（%）］Table 3 Comparison of pathogen positive rate of lower respiratory tract infection in different age groups［n（%）］

2.4 不同年份病原體檢出情況

2019 年到2022 年患者總檢出陽性率分別為67.28%（1 536/2 283），67.49%（1 586/2 350），56.11%（1 465/2 611），57.69%（1 058/1 834），2019年和2020 年的患者陽性率高于2021 和2022 年，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=110.084，P＜0.001）。近4年各病原體陽性率比較，Cpn 和Hin 的感染陽性率在2019 年明顯高于其余3 年，2020 年的Eco、Mtb、Sau 的陽性率高于2021 年和2022 年，2019年和2020 年的MecA、Sma 以及Pae 的陽性率高于2021 年和2022 年，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

2.5 不同季節(jié)病原體檢出情況

四個(gè)季節(jié)檢出病原體陽性率分別為60.10%（1 598/2 659）、62.71%（1 596/2 545）、62.43%（957/1 533）、63.82%（1 494/2 341），春季陽性率低于其它三個(gè)季節(jié)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.921，P=0.048）。Aba 和Sau 在冬季的感染率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表5 不同季節(jié)下呼吸道病原體感染陽性率比較［n（%）］Table 5 Comparison of positive rate of pathogen infection in lower respiratory tract in different seasons［n（%）］

3 討論

下呼吸道感染是一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問題，也是全球所有年齡層疾病和死亡的主要原因，其引起原因具有多樣性，給臨床診療帶來了巨大的挑戰(zhàn)。當(dāng)缺乏病原體信息時(shí)，醫(yī)生經(jīng)常根據(jù)經(jīng)驗(yàn)使用廣譜抗生素，導(dǎo)致耐藥率不斷增加［5］。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)仍然是病原學(xué)檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其靈敏度低，耗時(shí)長(zhǎng)，誤診率較高［2，6］，難以滿足臨床的需求。近年來，分子生物學(xué)方法成為了呼吸道病原體檢測(cè)的一個(gè)新方向。IAMP 法對(duì)送檢條件要求沒有那么高，能夠很大程度上提高陽性檢出率，可用于輔助診斷或鑒定臨床上比較常見的LRTI，同時(shí)也可用于流行病學(xué)研究［7］。

本研究檢測(cè)的9 078 例疑似下呼吸道感染的患者標(biāo)本，主要為Aba、Kpn 和Pae 感染，與毛成曄等［8］的研究結(jié)果相一致。2019 年Cpn 和Hin 的感染陽性率明顯高于其余3 年，可能是因?yàn)檫@兩種病原體主要通過空氣中的飛沫傳播，新冠疫情爆發(fā)后，人們習(xí)慣于佩戴口罩，降低了傳播的可能性。隨著新冠疫情的防控力度加大，大部分病原體陽性率在后兩年都有所下降，近4 年各病原體陽性率總體分布趨勢(shì)大體一致。

從性別分布來看，本研究結(jié)果顯示，男性患者陽性率高于女性患者，其中男性患者的Kpn，Pae，Aba，Sma 的感染陽性率均高于女性患者。這可能與社會(huì)分工及生活習(xí)慣有關(guān)，男性患者較女性患者更多也增加了其醫(yī)院感染的可能性。

從年齡分布來看，＜18 歲組的呼吸道病原體感染陽性率最高，18～59 歲組的陽性率最低?？赡苁且?yàn)椋?8 歲組標(biāo)本中主要以幼兒為主，身體機(jī)能和免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，＞59 歲組身體機(jī)能下降和各種基礎(chǔ)疾病的累積。感染的病人多是老年患者、危重疾病及機(jī)體抵抗力弱的患者。＜18 歲組的Spn、Cpn 及Hin 的感染陽性率高于另外兩組，這與段肖麗等［9］的研究結(jié)果相一致。

從季節(jié)分布來看，春季總體陽性率低于其它三個(gè)季節(jié)，其它各季差異不大。有文獻(xiàn)報(bào)道，下呼吸道病原體感染與季節(jié)分布有一定關(guān)聯(lián)［9］，但本研究并未發(fā)現(xiàn)明顯聯(lián)系，可能與不同地方氣候環(huán)境等因素有關(guān)。

綜上所述，本研究匯總了近四年來清遠(yuǎn)地區(qū)疑似下呼吸道感染患者的病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果，分析了十三種下呼吸道病原體的分布特征，有利于下呼吸道感染的臨床診斷、治療及合理用藥。