表達高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白的偽狂犬病病毒拯救與純化

張劉輝，劉穎，馬曉，趙友驛，韓瑩瑩，金鉞，陳紅英

(河南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，河南 鄭州 450046)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是當前我國豬場非常重要的一種病毒性疾病，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染所致，引起仔豬呼吸系統(tǒng)疾病、生長遲緩和母豬繁殖障礙[1-2]。2006年，高致病性PRRSV(HP-PRRSV)引起的“高熱病”在我國南方豬群中暴發(fā)與流行，隨后迅速傳播到我國26個省份，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了毀滅性破壞[3]。近年流行病調(diào)查發(fā)現(xiàn)，HP-PRRSV仍然在我國豬群中流行[4-5]。目前預防HP-PRRS的疫苗是滅活疫苗和弱毒疫苗，但是現(xiàn)有疫苗難以對PRRSV感染提供有效保護。因此，開發(fā)一種針對HP-PRRSV的新型疫苗，對于控制高致病性PRRS疫情尤為重要。

偽狂犬病(porcine pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(PRV)引起多種動物的一種高度接觸性傳染病[6]。豬是該病的唯一自然宿主，各年齡階段豬都受到偽狂犬病的威脅[7]。自2011年后，我國多個省份免疫過Bartha-K61疫苗的規(guī)?；i場暴發(fā)了PRV變異毒株引起的新一輪PR疫情，一直困擾著我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[8-10]。

PRV基因組為雙鏈線性DNA，其長度為150 kb左右，包含多個非必需基因，可供外源基因插入與表達，毒力不返強，是常用的病毒活載體之一[2，11]。本研究以PRV三基因缺失株rPRV-gE-/gI-/TK-為親本株，通過同源重組技術，將HP-PRRSV GP5基因插入到偽狂犬病毒基因組中，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，將重組病毒中增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因進行剪接，構(gòu)建了穩(wěn)定表達HP-PRRSV GP5蛋白的重組病毒rPRV-GP5/HP，以期為豬繁殖與呼吸綜合征和豬偽狂犬病的防控提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 細胞、質(zhì)粒和毒株

ST細胞由鄭州豬重大疫病防控重點實驗室保存。PRV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pG、CRISPR/Cas9 EGFP基因雙敲除質(zhì)粒pX459-gRNA1-EZ-gRNA2以及PRV三基因缺失株rPRV-gE-/gI-/TK-均由鄭州豬重大疫病防控重點實驗室構(gòu)建并保存。HP-PRRSV HeN-HC毒株由鄭州豬重大疫病防控重點實驗室分離并保存。

1.2 主要試劑

病毒 RNA 快速抽提試劑盒、HiScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit和Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase購自南京諾維贊生物科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、Endo-Free Plasmid Mini Kit I-fast購自OMEGA公司；堿性磷酸酶(CIAP)、限制性酶BamHⅠ購自寶生物工程(大連)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑ZLip2000購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；兔抗PRRSV-GP5血清(bs-4504R)購自北京博奧森生物科技有限公司；FITC-山羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物公司；低熔點瓊脂糖、DAPI染液(1 mg/mL)和抗熒光衰減封片劑購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 引物設計與合成

基于GenBank中公布的高致病性PRRSV HuN4毒株GP5基因序列，設計1對特異引物GP5-HP-F/R(表1)，BamHⅠ引入至引物的5′端。根據(jù)PRV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pG上gG啟動子序列，設計1條引物pG-F為上游引物，與GP5-HP-R組成1對引物，用于鑒定GP5基因的插入方向。引物EGFP-F/R用于EGFP基因表達盒的鑒定。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 引物序列

1.4 重組質(zhì)粒pG-GP5/HP-EGFP的構(gòu)建

用病毒 RNA 快速抽提試劑盒提取HP-PRRSV HeN-HC毒株的RNA，根據(jù)HiScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit說明合成cDNA，利用GP5基因特異引物GP5-HP-F/R進行PCR擴增?；厥盏臄U增產(chǎn)物克隆到已酶切并用CIAP去磷酸化的pG中質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒pG-GP5/HP-EGFP(圖1)，并導入感受態(tài)細胞DH5α。選取單個菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基中，用引物pG-F和GP5-HP-R進行PCR擴增，并提取質(zhì)粒進行測序。

圖1 重組病毒rPRV-GP5/HP的構(gòu)建流程

1.5 重組病毒rPRV-GP5/HP-EGFP的拯救與純化

參照Endo-Free Plasmid Mini Kit I-fast說明抽提質(zhì)粒pG-GP5/HP-EGFP。當6孔板中ST細胞密度為80%左右時，將PRV變異株三基因缺失毒株rPRV-gE-/gI-/TK-接種至6孔板內(nèi)，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱吸附2 h后，利用轉(zhuǎn)染試劑ZLip 2000，將質(zhì)粒pG-GP5/HP-EGFP轉(zhuǎn)染ST細胞，5 h后加入新鮮培養(yǎng)液并繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞病變(CPE)達80%時反復凍融3次，收獲病毒液。

將10-1、10-2、10-3、10-4和10-5稀釋度700 μL病毒液接種于6孔板內(nèi)ST單層細胞，37 ℃ 5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，吸棄孔內(nèi)液體后加入含1.3%低熔點瓊脂糖、5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，進行重組病毒rPRV-GP5/HP-EGFP的純化。每次病毒純化時，挑取稀釋度最大孔內(nèi)的單個綠色熒光蝕斑進行下一輪的病毒純化。收獲的病毒液重復上述步驟，直至稀釋孔內(nèi)所有蝕斑均呈現(xiàn)綠色熒光時，提取病毒DNA，用引物GP5-HP-F/R進行PCR鑒定。

1.6 重組病毒rPRV-GP5/HP的拯救與純化

將ST細胞加入到6孔板內(nèi)，待細胞密度達80%左右時，將CRISPR/Cas9 EGFP基因雙敲除質(zhì)粒pX459-gRNA1-EZ-gRNA2轉(zhuǎn)染ST細胞，孵育5 h，再將rPRV-GP5/HP-EGFP以10-3、10-4和10-53個稀釋度接種于已轉(zhuǎn)染了雙敲除質(zhì)粒的ST細胞中，37 ℃ 5% CO2孵育2 h，然后添加新鮮培養(yǎng)基，待細胞發(fā)生CPE，收獲病毒液。重組病毒純化步驟同1.5，但是應挑取最大稀釋孔內(nèi)無綠色熒光蝕斑，直到觀察到所有稀釋孔內(nèi)所有蝕斑無綠色熒光時，提取病毒DNA，用引物GP5-HP-F/R和EGFP-F/R進行重組病毒rPRV-GP5/HP的鑒定。

1.7 ST細胞中重組病毒rPRV-GP5/HP的GP5基因轉(zhuǎn)錄檢測

將純化的重組病毒rPRV-GP5/HP接種到6孔板中ST單層細胞上，待80%細胞出現(xiàn)CPE時收獲病毒液，反復凍融3次。提取病毒總RNA，用HiScript?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，用GP5特異引物GP5-HP-F/R進行PCR擴增。

1.8 rPRV-GP5/HP感染ST細胞表達GP5的間接免疫熒光試驗

當12孔板內(nèi)ST細胞長至80%融合時，接種純化的重組病毒rPRV-GP5/HP。待細胞出現(xiàn)CPE且呈現(xiàn)單一病變灶時，用4%多聚甲醛固定15 min、0.5% TritonX-100室溫下通透20 min。1%BSA室溫封閉1 h后，加入1∶200稀釋的抗PRRSV GP5兔血清，4 ℃孵育過夜。加入1∶5 000稀釋的FITC-山羊抗兔IgG二抗，37 ℃孵育1 h。加DAPI染液，進行5 min核復染。用抗熒光衰減封片劑進行封片處理后，在熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pG-GP5/HP-EGFP的鑒定

HP-PRRSV HeN-HC毒株GP5基因經(jīng)BamHⅠ插入到質(zhì)粒pG中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pG-GP5/HP-EGFP，導入大腸桿菌，挑選單個菌落，用引物pG-F和GP5-HP-R進行PCR擴增。在約650 bp處有1條特異性條帶，將PCR產(chǎn)物進行測序。結(jié)果顯示，所測序列為639 bp，包含GP5基因(603 bp)，與預期序列長度完全一致，且正向插入GP5基因(圖2)，與參考毒株HuN4的GP5基因序列比較，同源性為99.3%，表明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pG-GP5/HP-EGFP。

加粗部分為引物pG-F；下劃線為引物GP5-HP-F/R。

2.2 重組病毒rPRV-GP5/HP-EGFP的拯救和蝕斑純化

轉(zhuǎn)染ST細胞24 h后，細胞對照組和空白轉(zhuǎn)染組在熒光顯微鏡下ST細胞無綠色熒光，而質(zhì)粒pG-GP5/HP-EGFP轉(zhuǎn)染孔中ST細胞出現(xiàn)CPE且呈現(xiàn)明顯的綠色熒光。經(jīng)8輪蝕斑純化時，所有ST細胞出現(xiàn)CPE且均有綠色熒光(圖3)。提取病毒DNA，用引物GP5-HP-F/R進行擴增，電泳檢測結(jié)果顯示，在約650 bp處呈現(xiàn)1條特異性條帶(圖4)，與預期結(jié)果相符。

A.純化的重組病毒rPRV-GP5/HP-EGFP轉(zhuǎn)染細胞；B. 細胞對照。

M. DNA Marker；1～3. GP5基因；4. 陰性對照。

2.3 重組病毒rPRV-GP5/HP的拯救和蝕斑純化

為了獲得不含EGFP的重組病毒rPRV-GP5/HP，將CRISPR/Cas9-EGFP敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至ST細胞，孵育一定時間再接種病毒rPRV-GP5/HP-EGFP，收獲病毒液進行病毒蝕斑純化。結(jié)果顯示，經(jīng)4輪蝕斑純化后所有病毒蝕斑均無綠色熒光(圖5)。

圖5 重組病毒rPRV-GP5/HP 病變后的蝕斑(20×)

提取病毒DNA，利用GP5基因特異引物GP5-HP-F/R進行PCR擴增。結(jié)果如圖6顯示：擴增出約630 bp的片段，與預期結(jié)果相符；利用引物EGFP-F/R進行PCR擴增，擴增出1條約400 bp的片段。測序結(jié)果顯示，所測序列長度為436 bp，獲得的rPRV-GP5/HP在EGFP基因上缺失了1 232 bp片段，表明重組病毒rPRV-GP5/HP中EGFP基因被成功敲除，且經(jīng)空斑純化完全。

M. DNA Marker；1～4. GP5基因PCR產(chǎn)物；5～8. EGFP基因PCR產(chǎn)物；9～10. 陰性對照。

2.4 重組病毒rPRV-GP5/HP的 GP5基因轉(zhuǎn)錄檢測與表達

提取重組病毒rPRV-GP5/HP感染的ST細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用GP5特異引物GP5-HP-F/R進行PCR擴增GP5基因。結(jié)果顯示，在約650 bp處有1條特異性條帶(圖7)，與預期大小相符，且測序結(jié)果正確。

M. DNA Marker；1. GP5基因PCR產(chǎn)物；2. 陰性對照。

間接免疫熒光結(jié)果顯示，試驗組可觀察到明顯熒光，而對照孔沒有綠色熒光(圖8)，表明外源基因成功表達，進一步證明成功構(gòu)建重組病毒rPRV-GP5/HP。

A. rPRV-GP5/HP；B. rPRV-GP5/HP-DAPI；C.陰性對照；D. 陰性對照-DAPI；標尺=100 μm。

3 討論

20世紀80年代末，美國最早發(fā)生PRRS，后傳入歐洲，迅速擴散到全球的大多數(shù)國家和地區(qū)[1-2]。迄今，PRRS的防控仍然是困擾世界范圍內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)的一大難題。疫苗免疫仍是我國防制PRRS的主要手段。目前，由于無法區(qū)分PRRSV MLV疫苗免疫與野毒株感染，難于根除PRRS，且PRRSV基因易發(fā)生變異、重組，在臨床上MLV疫苗株與野毒株易發(fā)生基因重組，導致出現(xiàn)PRRSV新亞型。當前我國豬群中流行經(jīng)典PRRSV、HP-PRRSV、歐洲型PRRSV、類QYYZ PRRSV、NADC30-like-PRRSV和NADC34-like-PRRSV，呈現(xiàn)多亞型并存的局面[12]，不同亞型之間GP5基因同源性從99.8%到83.4%，這可能是現(xiàn)有疫苗不能產(chǎn)生交叉保護的原因之一[13]，給PRRS的防控帶來了更大的挑戰(zhàn)。

豬偽狂犬病是危害養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病之一，主要表現(xiàn)為妊娠母豬流產(chǎn)、死胎，仔豬神經(jīng)癥狀、腹瀉等[14]。近年來，CRIPSR/Cas9基因編輯技術的出現(xiàn)加速了新型疫苗的研發(fā)[15-16]。通過缺失PRV的gE、TK等毒力基因，獲得的PRV重組株既安全又能夠誘導高水平的中和抗體[17]，同時由于PRV的高表達能力，PRV弱毒株作為活病毒載體，已廣泛用于表達外源基因，從而開發(fā)預防豬偽狂犬病和其他重要病的多價疫苗[18]。本試驗所使用的PRV變異株三基因缺失毒株rPRV-gE-/gI-/TK[19]，是由本實驗室對PRV變異株NY的 gE、gI、TK三基因進行缺失而構(gòu)建的。試驗表明，rPRV-gE-/gI-/TK對小鼠是安全的，能誘導機體產(chǎn)生高水平的抗PRV中和抗體，并能抵抗PRV NY毒株的攻擊，因此PRV變異株三基因缺失毒株rPRV-gE-/gI-/TK可作為表達外源基因的活載體。

PRRSV和PRV的混合感染在我國豬場已經(jīng)存在，且均能引起豬發(fā)生繁殖障礙，因此研發(fā)一種更加安全有效的疫苗是豬繁殖與呼吸綜合征和豬偽狂犬病免疫預防研究的重點。研發(fā)“一針多防”疫苗有很好的優(yōu)勢，減少在免疫過程中其它病原感染的可能性。PRV基因組有許多復制非必需基因，許多研究以PRV毒力基因缺失株作為載體研發(fā)多聯(lián)苗，能觸發(fā)機體的體液免疫和細胞免疫反應。PRRSV GP5蛋白可刺激機體產(chǎn)生中和抗體，是研制PRRS新型疫苗的首選靶點[20]。本研究選用HP-PRRSV GP5基因作為外源基因插入到rPRV-gE-/gI-/TK-三缺失株中，成功構(gòu)建重組rPRV-GP5/HP，為高致病性PRRS的防控提供了新的解決方法。

綜上，本研究利用DNA同源重組和CRISPR/Cas9基因編輯技術，將HP-PRRSV GP5基因插入到三基因缺失PRV變異毒株中，構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達HP-PRRSV GP5基因的重組病毒rPRV-GP5/HP，為針對HP-PRRSV毒株和PRV變異毒株的疫苗研發(fā)提供了技術支持。