王 棟，梁進(jìn)忠，劉玉杰，鞠 寶

（煙臺(tái)大學(xué),山東煙臺(tái) 264003）

葡萄酒即以葡萄作為原料，利用微生物發(fā)酵釀造生產(chǎn)出的果酒，大多數(shù)葡萄酒的酒精度在9%～15 %（ABV）之間，某些酒精度高的特型葡萄酒酒精度能達(dá)到15%(ABV）以上，除了酒精外，葡萄酒中還具有許多對(duì)于人體有益的物質(zhì)，比如含有多種維生素，其中維生素B 類(lèi)的含量最為豐富，維生素B 類(lèi)物質(zhì)可以緩解人體疲勞，促進(jìn)人體內(nèi)的新陳代謝，同時(shí)對(duì)于貧血也有一定的治療作用；葡萄酒中含有的有機(jī)酸，比如蘋(píng)果酸、酒石酸等可以幫助調(diào)節(jié)身體酸堿平衡，同時(shí)具有一定的助消化作用；葡萄酒中還含有酚類(lèi)物質(zhì)，單寧是其中最重要的一種，它是葡萄酒中澀味的主要來(lái)源，單寧主要由葡萄中的葡萄皮和葡萄籽發(fā)酵而來(lái)，也有一些是葡萄酒萃取橡木桶中的單寧，單寧具有預(yù)防心腦血管疾病、抗氧化的作用，葡萄酒中含有的白藜蘆醇也是一種可以預(yù)防心腦血管疾病的物質(zhì)，是一種具有天然抗癌效果的物質(zhì)，能夠調(diào)控細(xì)胞的多種生長(zhǎng)途徑，對(duì)多種腫瘤都有抑制作用[1]，長(zhǎng)期適度飲用葡萄酒，可以促進(jìn)人的食欲、減輕機(jī)體老化、預(yù)防心腦血管疾病、抗癌、美容養(yǎng)顏等。

目前評(píng)價(jià)一款葡萄酒優(yōu)劣的感官分析方法是依據(jù)《葡萄酒、果酒通用分析方法》（GB/T 15038—2006）附錄F 中葡萄酒評(píng)分細(xì)則進(jìn)行評(píng)價(jià)，主要從外觀、香氣、滋味和典型性方面做出判斷。葡萄酒中的甘油、揮發(fā)酸、花青素、殘?zhí)且约鞍邹继J醇含量也是判斷一款葡萄酒優(yōu)劣的重要指標(biāo)。

葡萄酒優(yōu)劣主要由三個(gè)方面決定，一是原材料，也就是葡萄的品質(zhì)如何，釀造葡萄酒需要選用釀酒葡萄，對(duì)比食用葡萄，釀酒葡萄果實(shí)小，果皮厚，果肉少，不適合直接食用，但其果汁多，糖分含量多，種子比較大，含有更多的單寧，適合進(jìn)行發(fā)酵，每種釀酒葡萄釀造出的酒的風(fēng)味也不同，同時(shí)還受果實(shí)生長(zhǎng)狀況的影響；第二個(gè)方面是釀造工藝，釀造工藝的不同也會(huì)決定葡萄酒的風(fēng)味，例如浸皮時(shí)間長(zhǎng)短、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)機(jī)、陳釀時(shí)間等，都會(huì)對(duì)酒的品質(zhì)造成影響；第三個(gè)方面是釀酒酵母，釀酒酵母在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中擔(dān)任最重要的“工具”，不僅是將葡萄中的糖類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為酒精，同時(shí)其產(chǎn)生的各種代謝物也是葡萄酒中風(fēng)味的重要來(lái)源。在這三個(gè)方面中，釀酒酵母又是其中最重要的，所以篩選出優(yōu)良釀酒酵母菌種就顯得極為重要。

1 釀酒酵母

1.1 酵母菌簡(jiǎn)介

酵母菌是單細(xì)胞真核微生物的總稱(chēng)，其細(xì)胞形態(tài)多為球形、卵圓形、橢圓形或臘腸形[2]；菌落形態(tài)大多數(shù)呈乳白色奶油狀，表面光滑，質(zhì)地均勻，還有少量菌種呈紅色或黑色；酵母菌繁殖方式有芽殖、裂殖和子囊孢子，大多數(shù)為2 倍體，少數(shù)為單倍體，比如八孢裂殖酵母，雖然存在2倍體時(shí)期，但2倍體時(shí)期極短。

酵母菌在自然界分布廣泛，在含糖量高的環(huán)境中容易被發(fā)現(xiàn)，尤其是在葡萄園中，葡萄的果皮、葉、根圈和土壤最容易找到野生酵母菌[3]。除了自然環(huán)境中能夠發(fā)現(xiàn)的酵母菌，在人類(lèi)活動(dòng)的相關(guān)場(chǎng)所也可以發(fā)現(xiàn)不同種的酵母菌，比如葡萄酒工廠、面包廠和乳制品廠等，這些酵母菌有的經(jīng)過(guò)與周?chē)h(huán)境的不斷適應(yīng)，已經(jīng)發(fā)生了一些性狀上的改變[4]。

酵母菌在發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的各種代謝產(chǎn)物在一定程度上會(huì)對(duì)葡萄酒的香氣產(chǎn)生影響，有的是增加香氣，使香氣更復(fù)雜，有的則產(chǎn)生負(fù)面影響，比如克勒式酵母會(huì)造成果酒超量產(chǎn)酸，畢赤酵母屬會(huì)產(chǎn)生菌膜及過(guò)量乙醛，漢遜酵母屬會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的乙酸及其酯類(lèi)，產(chǎn)生有毒物質(zhì)[5]。

1.2 優(yōu)良釀酒酵母

釀酒酵母是葡萄酒釀造過(guò)程中貫穿始終的主要酵母[6]，在發(fā)酵過(guò)程中非釀酒微生物會(huì)隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酒精度的逐漸升高而減少直至消失，釀酒酵母會(huì)逐漸增加直到發(fā)酵終止，優(yōu)良的釀酒酵母應(yīng)該有以下幾個(gè)特點(diǎn)：

（1）發(fā)酵速度快且穩(wěn)定，比如周桂珍等[7]從賀蘭山東麓分離篩選出的兩株酵母菌G4，H3 發(fā)酵起酵速度快，發(fā)酵產(chǎn)生的葡萄酒酒精度高，具有用于工業(yè)發(fā)酵的潛力。

（2）具有很好的抗逆性，能夠在高糖、高酒精度、低pH 環(huán)境下生長(zhǎng)，目前葡萄酒發(fā)酵液中一般是通過(guò)SO2殺滅有害菌，所以?xún)?yōu)良的釀酒酵母還需要有一定的抗SO2能力，比如Liu 等[8]從蜂蜜中分離出6種抗逆性強(qiáng)的菌株可作為商業(yè)菌株開(kāi)發(fā)利用。

（3）要有一定的嗜殺能力，能夠致死發(fā)酵液中的有害菌，F(xiàn)atima 等[9]從阿爾及利亞土壤中分離出的克魯維畢赤酵母，能夠分泌一種新型的嗜殺蛋白（Pkkp），該蛋白能殺滅食品和飲料中的多種有害酵母。

（4）能夠發(fā)酵產(chǎn)生獨(dú)特的令人愉悅的香氣，程仕偉等[10]從新疆霞多麗葡萄自然發(fā)酵醪中分離篩選出本土酵母XXF3，其發(fā)酵產(chǎn)生的苯乙醇是商業(yè)菌RHST的7倍多，具有工業(yè)化發(fā)酵應(yīng)用的潛力釘；閆興敏等[11]探究了13 株本土釀酒酵母的產(chǎn)香氣物質(zhì)的能力，XM12葡萄酒風(fēng)味最為純凈。

（5）發(fā)酵后葡萄酒的殘?zhí)呛俊]發(fā)酸以及葡萄酒的澄清度，吳啟鳳等[12]篩選出的兩株酵母菌發(fā)酵性能都優(yōu)于商業(yè)菌株LA-PE，可作為優(yōu)良菌株用于開(kāi)發(fā)當(dāng)?shù)厮咸丫啤?/p>

2 釀酒酵母的選育

優(yōu)良釀酒酵母的選育分篩選和育種兩個(gè)方面。菌株的初步篩選一般選用杜氏小管產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)，挑選出產(chǎn)氣迅速，產(chǎn)氣量多的菌株，再通過(guò)測(cè)試菌株的耐受性復(fù)篩出耐受性?xún)?yōu)良的菌株。自然界中存在著多種野生酵母，但并不是所有的野生酵母都適合用來(lái)發(fā)酵葡萄酒，這就需要在菌株篩選的層面上更進(jìn)一步，進(jìn)行酵母菌的育種工作。隨著時(shí)代的發(fā)展，科技的進(jìn)步，酵母菌育種技術(shù)也在不斷進(jìn)步和發(fā)展，目前酵母菌育種的方法主要有自然育種，雜交育種、誘變育種、原生質(zhì)體融合、基因工程育種、代謝工程育種，這些育種方法各有利弊，在育種時(shí)應(yīng)根據(jù)實(shí)際條件合理運(yùn)用，最大程度發(fā)揮出方法的優(yōu)勢(shì)，還應(yīng)將這些方法有機(jī)結(jié)合起來(lái)，通過(guò)多種方法培育出具有各方面優(yōu)良性狀的理想菌株[13-16]。

2.1 自然選育

在自然界中不加以人工干預(yù)挑選出具有優(yōu)良性狀菌株的過(guò)程叫做自然選育，自然界存在的野生菌株發(fā)酵性能大多數(shù)都不夠滿(mǎn)足發(fā)酵工業(yè)的需求，但也有少數(shù)突變株具有優(yōu)良的發(fā)酵特性，Li 等[17]通過(guò)自然選育，從葡萄汁中分離出32 株野生酵母菌，經(jīng)過(guò)發(fā)酵測(cè)試，僅有一株發(fā)酵特性較好，耐受性強(qiáng)，自然選育是有一定幾率獲取到優(yōu)良野生釀酒酵母的。自然選育的優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單，菌種容易獲取，且獲得的野生菌株傳代培養(yǎng)不易發(fā)生突變，缺點(diǎn)在于處理的菌種數(shù)目巨大，效率低，獲得的菌株無(wú)法保證所有的性狀都符合工業(yè)生產(chǎn)需要。

2.2 誘變育種

誘變育種又分為物理誘變、化學(xué)誘變以及生物誘變，是通過(guò)利用誘變劑作用于酵母菌使酵母菌基因突變的概率大大增加，然后進(jìn)行篩選從而獲得優(yōu)良發(fā)酵性狀的新型酵母菌株的方法。

2.2.1 物理誘變

物理誘變最常用的方法是使用紫外、微波、超聲波以及一些能夠引起電離輻射的射線(xiàn)或快中子等物理誘變劑作用于酵母菌，這些誘變劑會(huì)提高酵母菌DNA 堿基的錯(cuò)配率，從而造成酵母菌的基因突變[18]。王犁燁等[19]通過(guò)紫外誘變的方法對(duì)菌株Y6 進(jìn)行誘變，篩選獲得菌株Y6-5 在產(chǎn)酒精以及產(chǎn)酸的能力上要明顯高于Y6 菌株。物理誘變具有無(wú)污染、變異率高、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，但有些物理誘變方法具有局限性，需要相應(yīng)的專(zhuān)業(yè)設(shè)備和專(zhuān)業(yè)人員，具有一定的危險(xiǎn)性。

2.2.2 化學(xué)誘變

化學(xué)誘變是利用一些化學(xué)藥品作為誘變劑作用于酵母菌，使酵母菌基因突變幾率大大增加的方法，烷化劑、核酸堿基類(lèi)似物、羥胺、吖啶色素等都是常用的誘變劑。倪曉豐等[20]以BY23 為出發(fā)菌株，利用硫酸二乙酯（DES）進(jìn)行化學(xué)誘變，篩選獲得高核糖核酸釀酒酵母BY23-195，其胞內(nèi)RNA 含量達(dá)到16.01%，較優(yōu)化前有了明顯提高；梁裕崴[21]通過(guò)對(duì)獲得的野生菌株A21 進(jìn)行化學(xué)誘變，篩選獲得的菌種Y42 在酒精耐受性面有顯著提高；Su 等[22]使用EMS 誘變技術(shù)篩選所得到的菌株分別命名為EMS39-20 和W303-1A-20，突變株與出發(fā)菌株W303-1A-20 相比，EMS39-20 使異丁醇滴度提高了49.9 %?；瘜W(xué)誘變劑誘變與物理誘變一樣具有簡(jiǎn)便快捷的優(yōu)點(diǎn)，并且誘變劑誘變不需要大型設(shè)備及專(zhuān)業(yè)人員，相比較而言更加經(jīng)濟(jì)，但是大多數(shù)的化學(xué)誘變劑都有使人體致癌的風(fēng)險(xiǎn)，需要做好防護(hù)措施。

2.2.3 ARTP誘變

除了這些常規(guī)的誘變方法外，近幾年還出現(xiàn)了新型的誘變方式，常壓室溫等離子誘變（ARTP），ARTP 通過(guò)產(chǎn)生的高濃度活性離子使酵母菌中DNA 單鏈或雙鏈發(fā)生斷裂，造成DNA 損傷，DNA損傷的細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)應(yīng)急修復(fù)機(jī)制，引起細(xì)胞的基因突變[23]。王犁燁等[24]通過(guò)ARTP 誘變方法作用于從葡萄表面分離篩選出的菌株Y6，獲得的誘變后菌株Y6-8 在產(chǎn)酒精和產(chǎn)酸能力上都明顯優(yōu)于原始菌株Y6；王偉雄等[25]利用ARTP 誘變方法作用于從葡萄皮表面分離篩選出的野生馬克斯克魯維酵母菌株YK，獲得的突變株YK-1、YK-29 產(chǎn)酒精能力比原始菌株提高149 %、169 %；楊耀[26]利用ARTP 誘變作用于出發(fā)菌株1048，獲得的突變株SCZ40 產(chǎn)GSH 含量比出發(fā)菌株提高了32.74%；Wang 等[27]利用釀酒酵母通過(guò)ARTP 隨機(jī)突變和適應(yīng)性進(jìn)化，建立耐381 g/L 蔗糖的突變體庫(kù)，篩選最佳菌株，乙醇收率提高20.48 %，蔗糖利用率達(dá)到81.64 %。ARTP 是近幾年來(lái)人們研究出的育種方式，相比其他誘變方法具有對(duì)人體無(wú)毒無(wú)害的優(yōu)點(diǎn)，操作也并不復(fù)雜，在釀酒酵母育種方面得到越來(lái)越多的應(yīng)用，人們對(duì)于這種方法的研究也越來(lái)越重視。

2.3 雜交育種

雜交育種的原理是酵母菌的基因重組，能夠?qū)⒍鄠€(gè)品種的性狀整合起來(lái)，然后定向篩選出人們所需要的具有優(yōu)良性狀的理想雜合子。

Pérez 等[28]使用非轉(zhuǎn)基因技術(shù)（稀有交配）生成了種內(nèi)和種間雜交種，其中將非釀酒酵母菌株與釀酒酵母進(jìn)行雜交，篩選的后代攜帶有釀酒酵母線(xiàn)粒體的雜交種相比于原始菌株表現(xiàn)出更好的發(fā)酵能力，而攜帶非葡萄酒菌株線(xiàn)粒體的雜交種降低了乙醇水平，但產(chǎn)生甘油、2,3-丁二醇和有機(jī)酸的量有了明顯增加。此外，與原始釀酒酵母相比，后代雜交種都在不同程度上產(chǎn)生了水果香氣和花香。吳宇等[29]通過(guò)將釀酒酵母特定基因谷氨酰胺合成酶基因GLN1 插入到載體pESC-URA 上，再將載體導(dǎo)入到原始酵母BY4741 中，構(gòu)建出了重組酵母YEA9，對(duì)重組酵母糠醛耐受性及發(fā)酵性能進(jìn)行測(cè)定，最終表明重組酵母能夠耐受更高濃度的糠醛，酒精發(fā)酵效率比原始酵母有顯著提高。

雜交育種的優(yōu)點(diǎn)是能夠?qū)⒉煌H本的性狀整合到一起，缺點(diǎn)是操作難度較大，技術(shù)要求高。

2.4 原生質(zhì)體育種

原生質(zhì)體育種是將兩株不同的親代菌株，通過(guò)脫壁處理，在高滲條件下利用促融劑促融，使兩株細(xì)胞融合在一起，在細(xì)胞質(zhì)相互融合時(shí)，細(xì)胞間會(huì)進(jìn)行基因重組，從而獲得同時(shí)具有兩種親本性狀的新型菌株。徐奎棟[30]將增香性能優(yōu)越的釀酒酵母WLS21 和顯著降低代謝物中乙醇含量的嗜乙醇假絲酵母SJ03 為出發(fā)菌株，利用原生質(zhì)體融合的方法得到融合菌株R6，其同時(shí)具有兩種親本優(yōu)異的性狀；Sharma 等[31]通過(guò)原生質(zhì)體融合的方法將己糖發(fā)酵菌釀酒酵母與發(fā)酵木糖的樹(shù)干畢赤酵母作為兩個(gè)親本，融合得到的融合子菌株利用木糖的效率要明顯高于親代。利用原生質(zhì)體育種的優(yōu)點(diǎn)在于可使基因重組的頻率增高，不僅細(xì)胞核中的基因，還包括細(xì)胞質(zhì)中的基因，能夠?qū)捎H本優(yōu)良性狀整合到一起，缺點(diǎn)是操作復(fù)雜、技術(shù)難度較高，需要親本具有一定的優(yōu)良性狀。

2.5 基因工程育種

基因工程育種是將具有某種優(yōu)良性狀或是人們所需性狀的外源基因片段，通過(guò)一定的手段導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中，使外源基因能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)并傳代，從而獲得具有優(yōu)良目的性狀的工程菌株。

Jeong 等[32]利用基因工程技術(shù)，開(kāi)發(fā)出一種新型菌株，在阿拉伯糖和木糖存在的情況下允許同時(shí)消耗半乳糖醛酸，解決了五碳糖部分半乳糖醛酸的代謝瓶頸；耿娜[33]通過(guò)基因工程的方法在釀酒酵母中構(gòu)建出對(duì)羥基苯甲酸的合成途徑，并且對(duì)釀酒酵母中的莽草酸途徑、磷酸戊糖途徑、糖酵解途徑3種途徑進(jìn)行改造，工程菌株相比原始菌株產(chǎn)量有了明顯提高?；蚬こ套畲蟮膬?yōu)點(diǎn)就是可以定向的對(duì)菌株進(jìn)行改良，并且可以跨過(guò)種屬間的差別，缺點(diǎn)是技術(shù)難度高，并且插入的外源基因有可能影響原始菌株的生長(zhǎng)特性。

2.6 代謝工程育種

代謝工程是從細(xì)胞代謝層次對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定向優(yōu)化，通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)遺傳和調(diào)控過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，提高細(xì)胞產(chǎn)生人類(lèi)所需目標(biāo)產(chǎn)物的能力。代謝工程改造通?；谝韵聨讉€(gè)目標(biāo)[34-37]：增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)于多種底物利用的能力；提高細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物合成能力；提高底物的利用轉(zhuǎn)化率；使菌株更加健壯等。Xu 等[38]利用代謝工程技術(shù)，使釀酒酵母可以生產(chǎn)富馬酸（FA），通過(guò)刪除FUM1基因獲得的工程釀酒酵母菌株可以產(chǎn)生濃度為610 mg/L±31 mg/L 的FA；曲麗莎[39]以釀酒酵母CEN.PK2-1C 為出發(fā)菌株，在胞內(nèi)重構(gòu)7-DHC 的合成途徑，利用代謝網(wǎng)絡(luò)模型和CRISPRi 系統(tǒng)協(xié)調(diào)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物積累的關(guān)系，并進(jìn)一步提高7-DHC 的合成量，最終獲得了一株高產(chǎn)7-DHC 的菌株。代謝工程育種的優(yōu)點(diǎn)在于其定向優(yōu)化不會(huì)對(duì)原始菌株生長(zhǎng)特性造成未知的影響，能夠定向創(chuàng)造出人們所需要的工程菌株，缺點(diǎn)是操作難度較高，需掌握目的產(chǎn)物的代謝途徑。

3 釀酒酵母鑒定方法

3.1 傳統(tǒng)鑒定

通過(guò)自然選育獲得的野生酵母菌通常需要確定其種屬，傳統(tǒng)的酵母菌鑒別方法是通過(guò)測(cè)定酵母菌的各種理化性質(zhì)如可利用的碳源種類(lèi)、可利用的氮源種類(lèi)、能否在特定篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)等，再通過(guò)觀察菌株的形態(tài)學(xué)特征如菌體形狀、菌落大小、菌落顏色等做出判斷，同時(shí)酵母菌的繁殖方式也是酵母菌分類(lèi)的重要依據(jù)。掌握一株野生菌株的理化性質(zhì)、形態(tài)學(xué)特征及繁殖方式，再通過(guò)比對(duì)《酵母菌的特征和鑒定手冊(cè)》和《微生物分類(lèi)學(xué)》，確定酵母菌的種屬。這種傳統(tǒng)的鑒定菌種的方法優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單易行，缺點(diǎn)是工作繁瑣、處理量大、周期長(zhǎng)且重復(fù)性差[40-42]。隨著科技的進(jìn)步，時(shí)代的發(fā)展，更多新型的菌株鑒定方法正逐漸取代傳統(tǒng)的鑒定方法。

3.2 WL培養(yǎng)基

利用WL 營(yíng)養(yǎng)瓊脂鑒定培養(yǎng)基進(jìn)行菌種鑒定，適合作為酵母菌的初步鑒定，通過(guò)觀察酵母菌在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)來(lái)判定酵母菌的種類(lèi)。Cavazza 等[43]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母菌不同菌種在WL 營(yíng)養(yǎng)瓊脂鑒定培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落顏色和形態(tài)不同，通過(guò)分辨菌落形態(tài)可以將在葡萄酒自然發(fā)酵過(guò)程中出現(xiàn)的大多數(shù)典型的酵母菌區(qū)分開(kāi)；王志恒等[44]使用WL 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行初步分類(lèi)，再結(jié)合26S rDNA D1/D2 區(qū)測(cè)序分析，共鑒定出5種酵母菌；薛軍俠等[45]通過(guò)一系列的生理生化實(shí)驗(yàn)，26S rRNA 測(cè)序，表明通過(guò)WL 培養(yǎng)基初步鑒定的菌種類(lèi)型，與最終分析得出的菌種類(lèi)型完全一致。優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，缺點(diǎn)是只能大致區(qū)分葡萄酒中典型的酵母菌，需與其他鑒別方法聯(lián)用。

3.3 核糖體DNA序列分析

核糖體DNA 序列分析是目前鑒別酵母菌種類(lèi)最常用的方法，酵母菌核糖體具有4 種不同沉降系數(shù)的RNA 片段，分別是26S、18S、5.8S、5S，通過(guò)串聯(lián)排列的方式在同一轉(zhuǎn)錄單位中，之間間隔著間隔區(qū)ITS。rRNA 結(jié)構(gòu)既具有高度的保守性，其保守性反映了物種間存在的相關(guān)聯(lián)系，又具有高變性，其高變性則反映了種間不同。目前用得最多的是大亞基上的26S rDNAD1/D2 區(qū)域序列，其優(yōu)點(diǎn)在于長(zhǎng)度適中，適合用于釀酒酵母的鑒定。馮濤等[46]通過(guò)采集不同地區(qū)土壤分離純化出4 株酵母菌，通過(guò)26S rDNA D1/D2 區(qū)域序列比對(duì)及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，結(jié)果表明其中3 株為釀酒酵母，1 株異常威克漢遜酵母；陳秀秀等[47]將從蜂蜜中分離提取出的1 株野生酵母菌做26S rDNA 鑒定，確定其為釀酒酵母；李小坤[48]利用ARTP 技術(shù)處理原始菌株得到誘變后菌株Y17aM3-12，對(duì)其進(jìn)行26S rDNA 測(cè)定，將測(cè)得的基因序列與數(shù)據(jù)庫(kù)的序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明誘變后菌株與Saccharomyces cerevisiaeNL9-9 同源性相同；El Dana 等[49]研究了西部半沙漠貝卡河谷4 個(gè)葡萄品種（卡里格南、西拉、格雷納赫和阿斯瓦德卡雷什）的酵母菌多樣性，通過(guò)26S rDNA鑒定出96株釀酒酵母。

除上述方法外，釀酒酵母現(xiàn)代分子鑒定的常用方法還有等位酶分析、線(xiàn)粒體DNA 限制性酶切分析、DNA 微衛(wèi)星分析、巢式PCR 擴(kuò)增、可溶性蛋白酶分析、顯微傅里葉變換紅外光譜分析等[50-55]。

4 非釀酒酵母與釀酒酵母混菌發(fā)酵

釀酒酵母在葡萄酒發(fā)酵擔(dān)任主要角色，是負(fù)責(zé)將糖類(lèi)轉(zhuǎn)化為酒精的主要工具，目前市面上的商業(yè)菌株普遍具有發(fā)酵平穩(wěn)、發(fā)酵速度快、酒精產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)，但使用商業(yè)菌株進(jìn)行葡萄酒的發(fā)酵不免會(huì)造成葡萄酒組成單調(diào)、香氣單一等問(wèn)題，隨著人們對(duì)葡萄酒發(fā)酵過(guò)程的深入研究，人們對(duì)非釀酒酵母的研究越來(lái)越深入。

非釀酒酵母雖然在酒精產(chǎn)率、發(fā)酵特性方面不如釀酒酵母，但有些非釀酒酵母能夠賦予葡萄酒獨(dú)特的香氣及口感。目前在葡萄酒領(lǐng)域研究最多的非釀酒酵母屬有孢圓酵母屬、有孢漢遜酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、美奇酵母屬、克魯維酵母屬[56-61]等，周洪江等[62]以貴人香葡萄為原料，利用3 種商業(yè)化非釀酒酵母（戴爾有孢圓酵母、美極梅氏酵母和耐熱克魯維酵母）與釀酒酵母混合發(fā)酵釀制白葡萄酒，與單一釀酒酵母發(fā)酵的白葡萄酒作比較，發(fā)現(xiàn)非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵對(duì)提升葡萄酒香氣有積極作用；羅來(lái)慶等[63]利用畢赤克魯維酵母HSX-5、長(zhǎng)孢洛德酵母MNS-6 和戴爾有孢圓酵母YQX-8 與釀酒酵母AWRI 796 混合發(fā)酵赤霞珠葡萄酒，通過(guò)氣相色譜測(cè)定最終葡萄酒中的揮發(fā)性物質(zhì)，表明混菌發(fā)酵液中含有的香氣物質(zhì)種類(lèi)更豐富，含量更高；劉曉燕等[64]選用2種商業(yè)非釀酒酵母（編號(hào)為CT10、PL09）分別與3 種商業(yè)釀酒酵母（編號(hào)為MST、CEC01、F33）以1∶1 混合比例發(fā)酵赤霞珠，測(cè)量得到的干紅葡萄酒，發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵有助于提高葡萄酒的品質(zhì)。

5 問(wèn)題與展望

目前制約我國(guó)葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素是缺少優(yōu)秀的釀酒酵母，從全世界葡萄酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展看，葡萄的產(chǎn)量、葡萄酒的產(chǎn)量都呈現(xiàn)下滑的趨勢(shì)，這可能與全球新冠疫情的影響有關(guān)。我國(guó)的葡萄產(chǎn)量平穩(wěn)，面對(duì)龐大的消費(fèi)人群，為迎合不同的消費(fèi)群體，不同葡萄酒口味、香味的差異可能就顯得尤為重要。不同種葡萄發(fā)酵產(chǎn)生的葡萄酒口味不同，不同酵母菌發(fā)酵的同種葡萄生產(chǎn)的葡萄酒風(fēng)味也存在差異。我國(guó)目前大部分商業(yè)用釀酒酵母還都依賴(lài)于進(jìn)口，造成我國(guó)葡萄酒產(chǎn)業(yè)直接進(jìn)口發(fā)酵完成的原酒，只有少量酒廠進(jìn)行自發(fā)酵，不利于我國(guó)葡萄酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。缺少本土的釀酒酵母，不利于形成我國(guó)葡萄酒特有的風(fēng)味，形成自己的葡萄酒特色。

我國(guó)葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)達(dá)，酵母菌種類(lèi)多，缺少的是從數(shù)量龐大的野生酵母中篩選出優(yōu)秀的釀酒酵母，合理的篩選方法、正確的育種手段就顯得尤為重要。目前我國(guó)的學(xué)者在釀酒酵母選育這一方面也越來(lái)越重視，西北農(nóng)林科技大學(xué)的劉延琳教授及其團(tuán)隊(duì)篩選出了兩株本土釀酒酵母，其“中國(guó)本土葡萄酒酵母種質(zhì)資源創(chuàng)新和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用”項(xiàng)目通過(guò)了成果鑒定，標(biāo)志著我國(guó)也有了自己的本土成熟釀酒酵母。同時(shí)，非釀酒酵母在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中的作用也不應(yīng)被忽視，非釀酒酵母對(duì)于葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中香氣的產(chǎn)生有著功不可沒(méi)的作用，釀酒酵母與非釀酒酵母的共同發(fā)酵擴(kuò)寬了生產(chǎn)具有獨(dú)特香氣葡萄酒的可能性，挑選合適釀酒酵母與非釀酒酵母共同發(fā)酵葡萄酒具有重要意義。