穩(wěn)定表達(dá)CD19的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的構(gòu)建

朱帥旗 張帆 詹思建 段海瀟 王迪 胡翰 汪洋 劉濱磊

［收稿日期］20211129

［第一作者］朱帥旗（1996-），男，河南商丘人，湖北工業(yè)大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)樯锕こ?/p>

［通信作者］劉濱磊（1962-），男，湖北武漢人，湖北工業(yè)大學(xué)教授，研究方向?yàn)樯镏扑?/p>

［文章編號(hào)］1003-4684（2023）02-0052-05

［摘要］細(xì)胞系表達(dá)的CD19可被靶向CD19的嵌合抗原受體（CAR）特異性識(shí)別。為探究靶向CD19 CAR-T抗腫瘤療效及機(jī)制提供可靠穩(wěn)定的靶細(xì)胞系，運(yùn)用Lipofectamine 3000TM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pPBDP-CD19和pSPBT質(zhì)粒轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞。嘌呤霉素（Puro）篩選，穩(wěn)定細(xì)胞株A549-CD19單克隆細(xì)胞由有限稀釋法得到；RT-qPCR鑒定A549-CD19細(xì)胞系中CD19 mRNA的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測A549-CD19中CD19的表達(dá)；MTS法比較改造前后細(xì)胞系的生長活性變化。經(jīng)Puro抗性篩選和挑取單克隆，得到4個(gè)A549-CD19單克隆細(xì)胞；RT-qPCR鑒定A549-CD19細(xì)胞系均有CD19 mRNA高表達(dá)；流式檢測單克隆細(xì)胞系陽性率均達(dá)到99%；MTS法檢測發(fā)現(xiàn)A549-CD19細(xì)胞系與親本細(xì)胞A549細(xì)胞具有一致的生長活性。運(yùn)用PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CD19的A549-CD19細(xì)胞系成功，為評(píng)估靶向CD19實(shí)體瘤CAR-T療效提供靶細(xì)胞，奠定CAR-T細(xì)胞抗實(shí)體瘤療效機(jī)制研究基礎(chǔ)。

［關(guān)鍵詞］A549細(xì)胞; PiggyBac; CD19; 綠色熒光蛋白

［中圖分類號(hào)］R153? ［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

人CD19是由胞外N末端、跨膜結(jié)構(gòu)域與胞內(nèi)C末端組成的跨膜糖蛋白，其大小為95kd，在多數(shù)B細(xì)胞中極其保守，但在多數(shù)慢性和急性B淋巴細(xì)胞白血病及B細(xì)胞淋巴瘤中過表達(dá)[1]。CD19作為關(guān)鍵標(biāo)記物已被用于白血病、淋巴瘤及免疫疾病的診斷預(yù)后評(píng)判指標(biāo)，也為治療這些疾病提供了靶點(diǎn)[2]。多個(gè)靶向CD19的雙特異性抗體與CAR-T細(xì)胞免疫療法已在臨床試驗(yàn)中取得進(jìn)展[3，臨床實(shí)驗(yàn)也證實(shí)其良好的療效，但其在實(shí)體瘤組織中的療效研究較少。據(jù)Schmidts A等報(bào)道，CAR-T抗實(shí)體瘤具有可行性[4]。此外，Chaurasiya S等人發(fā)現(xiàn)J2R CAR-T在肺癌模型中具有優(yōu)異的抗腫瘤活性[5]。新英格蘭雜志報(bào)道了CAR-T細(xì)胞療法治療惡性膠質(zhì)瘤晚期患者案例，經(jīng)多次輸注CAR-T細(xì)胞后，患者病癥得到完全緩解，這啟示了CAR-T療法在實(shí)體瘤具有可行性[6]。

限于CD19大多表達(dá)在血液淋巴瘤，而淋巴瘤細(xì)胞多存在于病人血液內(nèi)，為研究CAR-T的抗腫瘤機(jī)制帶來了不便。而實(shí)體瘤細(xì)胞具有體外易培養(yǎng)與體內(nèi)易成瘤的特點(diǎn)，便于評(píng)估CAR-T抗實(shí)體瘤療效機(jī)制。人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞系作為常用腫瘤研究細(xì)胞模型，在肺癌研究中最具代表性[7- 8]，因此本研究擬構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CD19的NSCLC細(xì)胞系以便于后續(xù)CAR-T抗實(shí)體瘤療效機(jī)制研究。

此外，用于構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的常見載體有慢病毒載體和轉(zhuǎn)座子載體，本研究采用的是實(shí)驗(yàn)室前期開發(fā)的PiggyBac轉(zhuǎn)座質(zhì)粒系統(tǒng)。本研究使用帶有CD19基因的轉(zhuǎn)座質(zhì)粒和表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒，將帶有CD19基因的轉(zhuǎn)座序列轉(zhuǎn)座至A549細(xì)胞染色體上，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)。此外，綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）具有探針的特性，作為報(bào)告基因標(biāo)記特定分子或細(xì)胞為科學(xué)研究提供極大便利[10]。在本研究中，GFP作為熒光標(biāo)記，在細(xì)胞系篩選、單克隆挑選等步驟起重要作用。

本研究構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CD19的A549細(xì)胞系，旨在為評(píng)估靶向CD19實(shí)體瘤CAR-T療效機(jī)制提供理想靶細(xì)胞模型。

1??? 實(shí)驗(yàn)材料

從北京協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞中心獲得A549細(xì)胞；用DME/F-12（HyClone， USA）培養(yǎng)A549細(xì)胞；于浙江天杭生物購買FBS。從Thermo Fisher Scientific購買Lipofectamine3000TM轉(zhuǎn)染試劑盒；PiggyBac Dual Promoter-CD19重組質(zhì)粒和Super PiggyBac Transposase（pSPBT）轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室改造并保存。無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒購于TIANGEN公司。嘌呤霉素（Puro）與MTS分別購于碧云天生物和Promega公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)由本團(tuán)隊(duì)自主制備。RNA抽提和RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒于TIANGEN和Vazyme購買，SYBR Green熒光染料于TOYOBO公司購買。PE Anti-CD19抗體于Abcam公司購買。流式細(xì)胞檢測儀（BD）；體視熒光顯微鏡（Nikon公司）；熒光定量PCR儀（Thermo Fisher Scientific），多功能酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific）；北京東聯(lián)哈爾二級(jí)生物安全柜。

2??? 實(shí)驗(yàn)方法

2.1??? 質(zhì)粒提取

于-80℃超低溫冰箱中取出甘油保存的PiggyBac Dual Promoter-CD19（即pPBDP-CD19質(zhì)粒菌，由實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建），將解凍菌液以1∶1000的比例接種至LB液體培養(yǎng)基中，加入Amp使其終濃度為100 μg/mL，37℃，200 r/min搖菌14 h。使用質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒并測濃度和純度。

2.2??? 細(xì)胞對(duì)嘌呤霉素的敏感性實(shí)驗(yàn)

收集A549細(xì)胞并離心（500×g， 5 min），離心后重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。細(xì)胞鋪24孔板（1.5×105個(gè)/孔），于37℃，5% CO2，濕潤的培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。次日于細(xì)胞孔中加入梯度濃度的Puro，之后每天觀察細(xì)胞貼壁百分比并做記錄，共計(jì)6 d。期間每2d換含Puro的新鮮培養(yǎng)基，在第4天確定A549細(xì)胞的最低致死濃度[11]。

2.3??? 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1天，用EDTA-胰酶消化A549細(xì)胞，終止消化后收集細(xì)胞懸液至離心管，于500×g下離心5 min后棄上清重懸計(jì)數(shù)。之后調(diào)整細(xì)胞密度，接種至24孔板，1.5×105個(gè)/孔，將細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。第2天當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染： 按Lipofectamine3000TM轉(zhuǎn)染試劑說明書以m（pPBDP-CD19-GFP） ∶m（pSPBT）=5∶1的質(zhì)粒質(zhì)量比轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞[12]。用體視熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞的GFP表達(dá)率。

2.4??? 抗性篩選與A549-CD19單克隆細(xì)胞系挑選

A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，按確定的最低致死濃度篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞。其間，每2天換一次含Puro的新鮮培養(yǎng)基，待所剩細(xì)胞均表達(dá)GFP時(shí)進(jìn)行單克隆挑選。將孔板內(nèi)細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)的細(xì)胞密度進(jìn)行梯度稀釋，稀釋密度為500個(gè)/mL。96孔板預(yù)加100 μL培養(yǎng)基，接種細(xì)胞，每孔2 μL細(xì)胞懸液。96孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，24 h后記錄單個(gè)細(xì)胞孔。待細(xì)胞克隆形成后于體視熒光顯微鏡下判斷表達(dá)GFP情況，篩選出表達(dá)GFP細(xì)胞克隆并將其擴(kuò)大培養(yǎng)，依次擴(kuò)培到24孔板、12孔板、6孔板、T25培養(yǎng)瓶中。

2.5??? RT-qPCR檢測A549-CD19單克隆細(xì)胞系CD19 mRNA的表達(dá)

從NCBI數(shù)據(jù)庫獲取GAPDH和CD19基因轉(zhuǎn)錄mRNA序列并設(shè)計(jì)SYBR熒光染料定量PCR引物，送基因公司合成備用。分別取A549-CD19、A549細(xì)胞鋪6孔板，6×105個(gè)/孔，培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。第二天RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提取RNA，并將mRNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行相對(duì)RT-qPCR，GAPDH作為內(nèi)參，檢測CD19轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)，使用2-ΔΔCt法[ΔΔCt=（Ct樣品-Ct GAPDH）-（Ct 對(duì)照-Ct GAPDH）]進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析[13]。其中CD19的定量引物為：F：ACT-GACCATCATCAAGGA，R：ACCACCGTAGTAATAATGTT；GAPDH的定量引物為：F： CTCTGGTAAAGTGGATATTGT，R： GGTGGAATCATATTGGAACA。

2.6??? 流式細(xì)胞術(shù)檢測A549-CD19單克隆細(xì)胞系CD19的表達(dá)

準(zhǔn)備約106個(gè)的A549-CD19和A549細(xì)胞上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞檢測，其中A549作為對(duì)照細(xì)胞。胰酶消化并用完全培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞懸液收集到1.5 mL EP管中，于500×g下離心5 min，棄上清并用PBS重懸細(xì)胞。使用PBS清洗細(xì)胞1次，最后用500 μL PBS重懸，此時(shí)細(xì)胞密度約2×106 個(gè)/mL。之后加入偶聯(lián)PE的CD19抗體與細(xì)胞避光孵育30 min，孵育完成后使用PBS清洗細(xì)胞3次，重懸細(xì)胞[14]。細(xì)胞懸液經(jīng)細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，同時(shí)設(shè)置流式細(xì)胞儀檢測通道為GFP和PE雙通道、設(shè)置細(xì)胞上樣的上限數(shù)為5×105個(gè)。最后將細(xì)胞懸液上機(jī)檢測，收集數(shù)據(jù)。PE的相對(duì)熒光強(qiáng)度作為CD19表達(dá)的量化指標(biāo)。

2.7??? MTS法檢測A549-CD19細(xì)胞系增殖活性

選取表達(dá)較高的A549-CD19-3細(xì)胞系進(jìn)行增殖活性測定。取一定量的A549與A549-CD19-3細(xì)胞，計(jì)數(shù)后鋪96孔板，每個(gè)孔板接種對(duì)應(yīng)細(xì)胞懸液100 μL（2×104個(gè)），每種細(xì)胞三個(gè)復(fù)孔，鋪5塊96孔板。培養(yǎng)過夜按0? h計(jì)，分別于0，24，48，72，96 h后測定細(xì)胞活性。MTS檢測步驟如下：于空白培養(yǎng)基和細(xì)胞所在孔中分別加入MTS溶液20 μL，包裹錫紙于細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育4 h。4 h后多功能酶標(biāo)儀待測樣品孔490 nm波長下的吸光度。

3??? 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1??? A549-CD19細(xì)胞系構(gòu)建

pPBDP-CD19-GFP質(zhì)粒構(gòu)建如圖1所示。其中CD19 cDNA全長1671 bp，并且受上游CMV啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控。抗性基因PuroR和標(biāo)記基因GFP之間通過T2A序列連接并受EF1α啟動(dòng)子調(diào)控。

3.2??? A549細(xì)胞對(duì)嘌呤霉素敏感性分析

圖2展示的是A549細(xì)胞在Puro（1～10 μg/mL）作用下的致死曲線。結(jié)果表明，經(jīng)Puro處理4 d后，4 μg/mL的劑量即可觀察到細(xì)胞完全死亡，因此后續(xù)篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞的濃度確定為4 μg/mL。

3.3??? pPBDP-CD19與pSPBT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)A549細(xì)胞

pPBDP-CD19轉(zhuǎn)座載體質(zhì)粒與pSPBT輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h后，于體視熒光顯微鏡藍(lán)色激發(fā)光下可以觀察到GFP的表達(dá)，表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表達(dá)且效率在30%左右（圖3）。

3.4??? A549-CD19細(xì)胞單克隆挑選

經(jīng)過Puro抗性篩和單克隆細(xì)胞挑選并將細(xì)胞培養(yǎng)4 d后，得到4個(gè)表達(dá)GFP的A549-CD19單克隆細(xì)胞團(tuán)。圖4是于熒光顯微鏡明場和暗場下拍攝的結(jié)果。

3.5??? CD19 mRNA在A549-CD19細(xì)胞系中高表達(dá)

收集單克隆細(xì)胞系并對(duì)其CD19 mRNA的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行熒光相對(duì)定量。如圖5所示，4個(gè)A549-CD19單克隆細(xì)胞系相較于A549細(xì)胞有2000多倍的表達(dá)，表明CD19 mRNA在A549-CD19單克隆細(xì)胞系中高表達(dá)。

3.6??? CD19在A549-CD19細(xì)胞系中具有高表達(dá)

以A549細(xì)胞作為對(duì)照，流式細(xì)胞術(shù)檢測A549-CD19單克隆細(xì)胞系的純度及CD19在細(xì)胞膜上的表達(dá)。如圖6a所示，4個(gè)單克隆細(xì)胞系的GFP與PE-CD19的雙陽率均高于99%，表明A549-CD19細(xì)胞系的純度很高。另外，通過PE-CD19單通道的平均熒光強(qiáng)度即MFI判斷CD19的表達(dá)情況（圖6b），CD19-PE的MFI均達(dá)到99.9%，表明CD19在A549-CD19細(xì)胞系中的表達(dá)豐度很高。綜上，A549-CD19細(xì)胞系構(gòu)建成功。

3.7??? A549-CD19細(xì)胞系具有與親本A549細(xì)胞一致的生長活性

從A549-CD19-2和A549-CD19-3兩個(gè)細(xì)胞系中隨機(jī)選取A549-CD19-3單克隆細(xì)胞系進(jìn)行增殖活性比較。如圖7所示，根據(jù)MTS溶液加入細(xì)胞4 h后的490nm處吸光度值顯示，A549-CD19-3細(xì)胞系在0、24、48、72、96 h時(shí)間點(diǎn)的吸光度值與親本細(xì)胞的吸光度值差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.5），CD19的表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖活性基本無影響。

4??? 結(jié)論與討論

運(yùn)用LipofectamineTM 3000轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)pPBDP-CD19質(zhì)粒與pSPBT質(zhì)粒至A549細(xì)胞中，構(gòu)建了表達(dá)CD19的人非小細(xì)胞肺癌單克隆細(xì)胞系即A549-CD19，而后運(yùn)用RT-qPCR和流式細(xì)胞術(shù)成功檢測到CD19的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

B細(xì)胞抗原受體CD19作為膜上免疫球蛋白共受體的重要一員，在B細(xì)胞的各生長階段基本都表達(dá)，在大多急性/慢性B淋巴細(xì)胞白血病和非霍奇金淋巴瘤上可以鑒定。這些特性決定了CD19是抗B淋巴惡性腫瘤CAR-T治療的最佳靶點(diǎn)。根據(jù)已有報(bào)道，CD19 CAR-T細(xì)胞具有靶向CD19+腫瘤細(xì)胞的特異、有效且持久的殺傷效果[15]。因此，通過建立穩(wěn)定表達(dá)CD19的人肺癌A549細(xì)胞系（即A549-CD19）為后續(xù)評(píng)估CAR-T抗實(shí)體瘤療效及機(jī)制研究提供理想的靶細(xì)胞系。PiggyBac作為高效的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)之一，長期被用于體細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞工程，而且不改變?cè)虻慕Y(jié)構(gòu)和功能，可以為人T淋巴細(xì)胞提供持續(xù)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)[16]。因此，使用PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)作為穩(wěn)定遺傳修飾的技術(shù)平臺(tái)，將pPBDP-CD19質(zhì)粒與pSPBT質(zhì)粒導(dǎo)入A549細(xì)胞，根據(jù)轉(zhuǎn)染后成功表達(dá)CD19的細(xì)胞對(duì)嘌呤霉素的抗性篩選陽性細(xì)胞。選擇表達(dá)CD19的單克隆細(xì)胞建立A549-CD19細(xì)胞系；轉(zhuǎn)錄水平的RT-qPCR反應(yīng)和蛋白水平的流式細(xì)胞術(shù)檢測證實(shí)CD19整合到A549基因組中并成功轉(zhuǎn)錄表達(dá)。根據(jù)MTS生長活性差異性比較，A549-CD19細(xì)胞系表現(xiàn)出與親本細(xì)胞一致的生長增殖活性。

總之，在此構(gòu)建的單克隆A549-CD19細(xì)胞系不僅為體外評(píng)估CD19-CAR改造T細(xì)胞抗實(shí)體瘤療效機(jī)制研究提供了靶細(xì)胞，同時(shí)也為后續(xù)CAR-T在動(dòng)物模型體內(nèi)浸潤對(duì)抗實(shí)體瘤療效研究奠定了基礎(chǔ)。

［參考文獻(xiàn)］

［1］袁園.一株可應(yīng)用于嵌合體抗原受體基因修飾的細(xì)胞治療技術(shù)的 CD19 單克隆抗體的篩選與鑒定[D].蘇州：蘇州大學(xué)，2016.

[2]IMURA Y，ANDO M，KONDO T，et al.CD19-targeted CAR regulatory T cells suppress B cell pathology without GvHD[J].JCI insight，2020，5（14），e136185，1-16.

[3]LEDEREROVA A，DOSTALOVA L，KOZLOVA V，et al.Hypermethylation of CD19 promoter enables antigen-negative escape to CART-19 in vivo and in vitro[J].Journal for immunotherapy of cancer，2021，9（08），e002352，1-8.

[4]SCHMIDTS A，MAUS M V.Making CAR T cells a solid option for solid tumors[J].Frontiers in immunology，2018（09）： 2593.

[5]CHAURASIYA S，CHEN N G，LU J，et al.A chimeric poxvirus with J2R （thymidine kinase） deletion shows safety and anti-tumor activity in lung cancer models[J].Cancer gene therapy，2020，27（03）： 125-135.

[6]BROWN CE，ALIZADEH D，STARR R，et al.Regression of glioblastoma after chimeric antigen receptor t-cell therapy [J].The New England journal of medicine，2016，375（26）：2561-2569.

[7]RODRIGUEZCANALES J，PARRACUENTAS E，WISTUBA I I .Diagnosis and molecular classification of lung cancer[J].Cancer Treat Res，2016，170：25-46.

[8]JONNA S，SUBRAMANIAM D S.Molecular diagnostics and targeted therapies in non-small cell lung cancer （NSCLC）： an update[J].Discovery medicine，2019，27（148）： 167-170.

[9]WILSON M H，COATES C J，GEORGE JR A L.PiggyBac transposon-mediated gene transfer in human cells[J].Molecular therapy，2007，15（01）： 139-145.

[10] PDELACQ J D，CABANTOUS S，TRAN T，et al.Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein[J].Nature biotechnology，2006，24（01）： 79-88.

[11] 王琳，張紫怡，金靜，等.穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶BGC823細(xì)胞系的構(gòu)建[J].湖北工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2021（04）： 42-45.

[12] 段海瀟，楊俊寒，王琳，等.表達(dá)近紅外熒光蛋白的結(jié)腸癌細(xì)胞系的建立[J].湖北工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2020（05）： 71-74.

[13] HU H，ZHANG Z，WANG R，et al.BGC823 cell line with the stable expression of iRFP720 retains its primary properties with promising fluorescence imaging ability[J].DNA and cell biology，2020，39（05）： 900-908.

[14] HU H，WANG R，ZHANG Z，et al.PiggyBac-modified CD19-expressing 4T1 cell line for the evaluation of CAR construct[J].International journal of clinical and experimental pathology，2019，12（07）： 2631-2638.

[15] KOCHENDERFER J N，DUDLEY M E，KASSIM S H，et al.Chemotherapy-refractory diffuse large B-cell lymphoma and indolent B-cell malignancies can be effectively treated with autologous T cells expressing an anti-CD19 chimeric antigen receptor[J].Journal of clinical oncology，2015，33（6）： 540-549.

[16] ZHENG Y，LI Z R，YUE R，et al.PiggyBac transposon system with polymeric gene carrier transfected into human T cells[J].American journal of translational research，2019，11（11）： 7126-7136.

Construction of A549 Cell Line Stably Expressing CD19 Using PiggyBac System

ZHU Shuaiqi， ZHANG Fan， ZHAN Sijian， DUAN Haixiao， WANG Di， HU Han， WANG Yang， LIU Binlei

（School of Biological Engineering and Food Science， Hubei Univ. of Tech.， Wuhan 430068，China）

Abstract：Objective： Non-small cell lung cancer （NSCLC） A549-CD19 cell line stably expressing CD19 was constructed by? PiggyBac transposon system. The CD19 expressed by the cell line can be specifically recognized and bound by the chimeric antigen receptor （CAR） targeting CD19，providing a reliable and stable target cell line for exploring the anti-tumor efficacy and mechanism of the targeting CD19 CAR-T. Methods： pPBDP-CD19 and pSPBT plasmids were transferred into A549 cells by Lipofectamine 3000TM liposome transfection， stable cell lines were screened by puromycin （Puro）， A549 CD19 monoclonal cells were obtained by limited dilution method， the expression of CD19 mRNA in A549 CD19 cell line was identified by RT qPCR， the expression of CD19 in A549 CD19 was detected by flow cytometry， and the growth activity of cell line before and after modification was compared by MTS method. Results： After Puro resistance screening and selection of clones， four A549 CD19 monoclonal cells were obtained; all A549 CD19 cell lines were identified by RT qPCR to have high expression of CD19 mRNA; flow detection showed that the positive rate of monoclonal cell lines reached 99% MTS method. It was found that the growth and viability of A549 CD19 cell line was consistent with that of parent cell A549.Conclusion： The A549 CD19 cell line stably expressing CD19 is successfully constructed， which provides target cells for evaluating the efficacy of CAR T targeting CD19 solid tumor， and lays the foundation for the study of the mechanism of CD19 CAR T cell anti-solid tumor effect.

Keywords： A549 cell;? PiggyBac; CD19; Green fluorescent protein

［責(zé)任編校： 張眾］