丁敬茹,苗永強(qiáng),單鴻鵠,白新棟,吳濱濱,張域琪,楊增岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)又名綠膿桿菌,革蘭氏陰性菌,也是一種常見(jiàn)的條件致病菌。廣泛存在于動(dòng)物機(jī)體和潮濕的環(huán)境中,如動(dòng)物皮膚、呼吸道、空氣、水、土壤等。銅綠假單胞菌通常引起呼吸道和泌尿系統(tǒng)感染,是導(dǎo)致人呼吸道疾病的主要致病菌之一[1]。此外,銅綠假單胞菌還可感染畜禽和野生動(dòng)物,可引起狐貍子宮內(nèi)膜炎[2]、水貂出血性肺炎[3]、羊慢性化膿性肺炎[4]、奶牛乳房炎和肺炎[5]等疾病,對(duì)畜禽具有不同程度的危害,由于其具有天然耐藥性,治療起來(lái)相對(duì)困難[6]。2022年4月陜西省榆林市某綿羊場(chǎng)約3%的綿羊出現(xiàn)咳嗽、氣喘、低熱等癥狀,經(jīng)青霉素、鏈霉素治療無(wú)效。6～7 d后部分羊行走困難、臥地不起、腹式呼吸,最終衰竭死亡。剖檢病死綿羊可見(jiàn)肝、肺等臟器腫大、出血,其中肺出血尤為嚴(yán)重,且有大小不等、散在分布的化膿灶。最后對(duì)病死綿羊肺臟進(jìn)行取樣檢測(cè),支原體、小反芻獸疫病毒、口蹄疫病毒和副流感病毒均為陰性,從肺臟組織分離到5株銅綠假單胞菌,并對(duì)該菌株進(jìn)行了致病性試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)和生物被膜試驗(yàn),為該菌引起呼吸道疾病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)涉及的樣品均來(lái)自2022年4月陜西省榆林市某存欄量3 000只的羊場(chǎng),約3%的羊被毛粗亂、精神沉郁、雙眼紅腫、咳嗽、氣喘、低熱、流膿性鼻液且部分羊出現(xiàn)腹瀉的癥狀。病羊經(jīng)青霉素、鏈霉素聯(lián)合用藥治療,但仍死亡8只,病理剖檢主要表現(xiàn)肝、肺、脾等臟器腫大、肺臟水腫出血嚴(yán)重并伴有局部化膿灶、肝臟輕微出血、膽囊腫大、膽汁稀薄、胸腔積液等病理變化,無(wú)菌采集病死羊的肺臟組織以及發(fā)病羊的鼻拭子低溫保存送至實(shí)驗(yàn)室診斷;18只SPF級(jí)昆明小鼠購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 營(yíng)養(yǎng)瓊脂和MH瓊脂,青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;綿羊血采自西北農(nóng)林科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心健康綿羊;細(xì)菌微量生化反應(yīng)管,杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品;藥敏紙片,杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品;細(xì)菌DNA提取試劑盒(離心柱型),天根生化科技有限公司產(chǎn)品;引物合成和產(chǎn)物測(cè)序由西安擎科生物公司完成;病毒RNA提取試劑盒(離心柱型),天根生化科技有限公司產(chǎn)品;PCR Mycoplasma Detection Kit,北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;細(xì)菌濁度儀,杭州齊威儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 支原體和病毒的鑒定 提取病羊肺組織基因組,參考已經(jīng)研究合成的引物分別檢測(cè)支原體、小反芻獸疫病(PPRV)、口蹄疫病毒(FMDV)、副流感病毒3型(PIV3)[7-9](表1)。

表1 引物信息

1.2.2 細(xì)菌分離鑒定

無(wú)菌剪取一小塊肺臟病變組織,用無(wú)菌接種環(huán)蘸取新鮮切面在50 g/L綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上劃線,分別置于37 ℃需氧和厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后擇優(yōu)勢(shì)菌再連續(xù)純化培養(yǎng)3代,純化后挑取單菌落抹片進(jìn)行革蘭氏染色,鏡檢觀察其形態(tài)。

挑取純化培養(yǎng)后的單菌落,分別接種于葡萄糖、木糖、果糖、L-精氨酸、氧化酶、尿素、枸櫞酸鹽、明膠、硫化氫、V-P、乳糖、吲哚等細(xì)菌微量生化反應(yīng)管中,用封口膜封口,然后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 ～ 36 h,觀察其生化反應(yīng)并記錄。

16SrRNA基因擴(kuò)增的通用引物27F(5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇)和1492R(5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇)由西安擎科生物公司合成。用DNA提取試劑盒提取該分離菌的DNA,然后進(jìn)行16SrRNA基因擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增體系(25 μL)為:2×TaqPCR Mix 12.5 μL,上、下游引物各1 μL,模板2 μL,ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件為:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸凝膠電泳試驗(yàn),核對(duì)目的條帶大小后將PCR產(chǎn)物送往西安擎科生物公司進(jìn)行測(cè)序,并將測(cè)序結(jié)果于NCBI官網(wǎng)上進(jìn)行Blast序列比對(duì),根據(jù)比對(duì)結(jié)果,選取同源性較高的部分菌株序列用MEGA11軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 小鼠致病性試驗(yàn) 挑取純化培養(yǎng)后的單菌落于無(wú)菌生理鹽水中制備濃度約為1.5×108CFU/mL的菌懸液。將18只20 g左右的小鼠隨機(jī)分成2組,試驗(yàn)組每只腹腔注射0.2 mL菌液,對(duì)照組每只腹腔注射相同劑量無(wú)菌生理鹽水,同等條件下飼養(yǎng),觀察小鼠狀態(tài)及死亡情況,對(duì)死亡小鼠進(jìn)行病理剖檢,對(duì)肺臟和肝臟再進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn),用常用的阿莫西林、慶大霉素等20種抗菌藥物藥敏片檢測(cè)該菌的敏感性。藥物敏感性判斷參考?xì)W盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(EMCAST)公布的獸用抗菌藥的耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 生物被膜試驗(yàn) 采用改良結(jié)晶紫染色法對(duì)生物被膜進(jìn)行半定量測(cè)量,將待檢菌株接種于LB肉湯培養(yǎng)基中,空氣搖床37 ℃、180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。每株菌設(shè)6個(gè)平行孔,將細(xì)菌按照1∶100稀釋于LB肉湯培養(yǎng)基中,用移液槍吸取200 μL加于96微孔板,37 ℃靜置培養(yǎng)36 h。培養(yǎng)完成,棄去上清,甲醇固定15 min,隨后PBS清洗3次,每孔加200 μL 10 g/L結(jié)晶紫染色5 min,PBS清洗3次,晾干。用330 mL/L冰乙酸溶解吸附在孔內(nèi)的結(jié)晶紫,時(shí)間為30 min。最后用酶標(biāo)儀測(cè)OD 600 nm吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 支原體和病毒鑒定結(jié)果

參考已研究合成引物,分別對(duì)8只病死羊進(jìn)行支原體(PPLO)、小反芻獸疫病毒(PPRV)、口蹄疫病毒(FMDV)、副流感病毒3型(PIV3)檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果均為陰性(圖1～圖4)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～8.8只羊支原體;+.陽(yáng)性對(duì)照

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～8.8只羊反芻獸疫病毒;+.陽(yáng)性對(duì)照

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～8.8只口蹄疫病毒;+.陽(yáng)性對(duì)照

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～8.8只羊副流感病毒3型;+.陽(yáng)性對(duì)照

2.2 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

2.2.1 菌落特征與細(xì)菌形態(tài) 該分離菌在綿羊血瓊脂培養(yǎng)基中出現(xiàn)具有溶血環(huán)且有特殊氣味的菌落,菌落拉絲黏稠(圖5A);染色鏡檢為革蘭氏陰性桿菌(圖5B)。其菌落特征與細(xì)菌形態(tài)均符合銅綠假單胞菌特點(diǎn)。

圖5 分離菌株血平板上菌落形態(tài)(A)和細(xì)菌革蘭氏染色形態(tài)(B,1 000×)

2.2.2 生化鑒定結(jié)果 嚴(yán)格按照細(xì)菌微量生化反應(yīng)管試劑盒操作規(guī)范對(duì)以上5株菌進(jìn)行生化鑒定,結(jié)果均符合銅綠假單胞菌的生化特性(表2)。

表2 分離菌株的生化特性

2.2.3 16SrRNA基因測(cè)序及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 將分離菌株進(jìn)行16SrRNA基因擴(kuò)增后,擴(kuò)增目的基因長(zhǎng)度為1 450 bp,與預(yù)期大小相符(圖6)。16SrRNA基因進(jìn)化樹(shù)分析表明本試驗(yàn)分離的5個(gè)菌株與銅綠假單胞菌親緣關(guān)系最近并聚為一支(圖7),再次證明該分離菌株為銅綠假單胞菌,將菌株分別命名為PA1～5。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;PA1～5.本試驗(yàn)菌株

圖7 16S rRNA基因進(jìn)化樹(shù)(方框中為分離菌株)

2.3 小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組小鼠注射菌液4 h后,開(kāi)始出現(xiàn)精神不振、畏寒扎堆、被毛粗亂、體溫上升等癥狀,并于24 h內(nèi)全部死亡,而對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好。試驗(yàn)組死亡小鼠剖檢可見(jiàn)皮下有膠凍樣綠色滲出物、肺臟充血腫大、嚴(yán)重出血,呈現(xiàn)紅色肝變,肝臟腫大且有出血點(diǎn),脾臟腫大、暗紅。對(duì)照組小鼠肺、肝、脾剖檢未見(jiàn)異常病理變化。試驗(yàn)組小鼠肺臟和肝臟進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)后,可再次獲得銅綠假單胞菌,而對(duì)照組小鼠組織培養(yǎng)未能獲得銅綠假單胞菌。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

該試驗(yàn)分離5株銅綠假單胞菌對(duì)恩諾沙星、慶大霉素均敏感,部分菌株對(duì)慶大霉素、鏈霉素敏感;對(duì)硫酸新霉素、大觀霉素、金霉素、安普霉素、泰妙菌素、多黏菌素B、四環(huán)素、卡那霉素、土霉素、鏈霉素、頭孢噻呋鈉介于敏感與耐藥之間;對(duì)氨芐西林、阿莫西林、替米考星、氟苯尼考、泰樂(lè)菌素、泰萬(wàn)菌素、多西環(huán)素均表現(xiàn)耐藥性(表3)。

表3 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.5 生物被膜試驗(yàn)結(jié)果

據(jù)參考文獻(xiàn)[10],ODs的值可根據(jù)生物被膜形成的能力分為4種不同的表型,分別為無(wú)成膜能力、弱成膜能力、中等成膜能力和強(qiáng)成膜能力,ODC、OD 600 nm值分別取所設(shè)6個(gè)平行組的平均值(表4)。

表4 5株銅綠假單胞菌生物被膜形成能力

3 討論

呼吸道疾病已成為危害牛、羊等反芻動(dòng)物健康養(yǎng)殖最重要的疾病之一[11],其中細(xì)菌、支原體、病毒以及寄生蟲(chóng)均可引起羊呼吸道疾病,混合感染現(xiàn)象屢見(jiàn)不鮮[12],本研究中,我們對(duì)8只因呼吸道疾病死亡羊分別檢測(cè)了支原體、小反芻獸疫病毒、口蹄疫病毒和副流感病毒,檢測(cè)結(jié)果均為陰性,并對(duì)肺組織中細(xì)菌進(jìn)行分離。最終在肺臟組織中分離鑒定得到5株銅綠假單胞菌,推測(cè)銅綠假單胞菌是引起該羊場(chǎng)呼吸道疾病的病原菌之一,并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行進(jìn)一步分析。

小鼠致病試驗(yàn)表明該菌具有一定的致病性,藥敏試驗(yàn)表明5株銅綠假單胞菌對(duì)恩諾沙星、慶大霉素均敏感;對(duì)氨芐西林、阿莫西林、替米考星、氟苯尼考、泰樂(lè)菌素、泰萬(wàn)菌素、多西環(huán)素均表現(xiàn)耐藥性。本研究結(jié)果與王小園[13]、姜曉東等[14]略有不同,這可能是由于不同地區(qū)銅綠假單胞菌株的血清型對(duì)藥物的敏感性有所差異,臨床上抗菌藥物濫用加劇耐藥菌株的產(chǎn)生[15]。因此,在治療過(guò)程中要根據(jù)臨床實(shí)際情況合理用藥,該結(jié)果有助于指導(dǎo)該場(chǎng)銅綠假單胞菌感染的臨床用藥。生物被膜試驗(yàn)結(jié)果表明,PA1具有中等生物被膜形成能力,菌株P(guān)A2～5具有弱生物被膜形成能力。與王小園[13]的研究相比,該場(chǎng)具有中等生物被膜形成能力的菌株較多,無(wú)強(qiáng)生物被膜形成能力的菌株,但該場(chǎng)所檢菌株均可形成不同程度的生物被膜。差異原因可能是檢測(cè)菌株較少,只反映部分菌株情況,未能體現(xiàn)全場(chǎng)感染菌株情況,也可能與之相比該場(chǎng)菌株生物被膜形成能力總體偏弱。生物被膜是一種膜狀聚集體,由蛋白質(zhì)和胞外多糖等物質(zhì)形成,黏附于黏膜及各種物體表面,是細(xì)菌適應(yīng)生存環(huán)境的一種形式[16],生物被膜一旦形成,會(huì)提高細(xì)菌的存活率、致病性和耐藥性[17],還可以阻擋吞噬細(xì)胞的吞噬,使得細(xì)菌在體內(nèi)迅速增殖[18],因此我們要加強(qiáng)管理,預(yù)防銅綠假單胞菌的感染。

近年來(lái),有關(guān)銅綠假單胞菌感染的病例不斷增多,由于其具有天然耐藥性[19],常見(jiàn)藥物治療起來(lái)相對(duì)困難。該菌可感染毛皮動(dòng)物(貂、狐)、家養(yǎng)動(dòng)物(牛、羊) 、寵物(犬、貓)、國(guó)家保護(hù)動(dòng)物(林麝),給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[20-21]。銅綠假單胞菌廣泛存在于環(huán)境中,當(dāng)動(dòng)物機(jī)體應(yīng)激、其他疾病感染、抵抗力下降、營(yíng)養(yǎng)不良、環(huán)境惡劣時(shí),便可引起感染[22],因此在日常飼養(yǎng)時(shí),可以添加適量益生菌,益生菌不僅可以合成多種維生素還可以刺激機(jī)體免疫系統(tǒng),是良好的免疫激活劑,可有效提高干擾素和巨噬細(xì)胞的活性,提高機(jī)體的免疫力[23]。同時(shí)要改善環(huán)境衛(wèi)生、加強(qiáng)環(huán)境消毒、保證圈舍干凈、科學(xué)飼養(yǎng)管理,減少銅綠假單胞菌的感染。

綜上所述,我們確定了本次羊場(chǎng)呼吸道疾病的主要病原是銅綠假單胞菌,試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,銅綠假單胞菌具有一定的致病性和耐藥性,且該菌可形成不同強(qiáng)弱程度的生物被膜,該試驗(yàn)結(jié)果有助于指導(dǎo)銅綠假單胞菌引起的羊呼吸道疾病的臨床治療。更提醒在日常飼養(yǎng)過(guò)程中,要加強(qiáng)消毒,增加羊群的免疫力,貫徹防大于治的理念,減少銅綠假單胞菌的感染。