基于斑馬魚(yú)模型研究木蝴蝶苷A的抗阿爾茨海默病活性和作用機(jī)制

時(shí)瑞碟 高鑫 王寶堃 高代麗 靳夢(mèng) 張秀軍

摘要：基于六水合氯化鋁誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)阿爾茨海默病模型，探究木蝴蝶苷A的抗阿爾茨海默病活性及作用機(jī)制。將受精后3 d的野生型AB品系斑馬魚(yú)隨機(jī)分為陰性對(duì)照組，80 μmol/L六水合氯化鋁模型對(duì)照組，80 μmol/L六水合氯化鋁與6 μmol/L多奈哌齊陽(yáng)性對(duì)照組，80 μmol/L六水合氯化鋁與不同濃度（5、10、20 μmol/L）木蝴蝶苷A受試物組。斑馬魚(yú)受精后6 d，利用明暗交替行為學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察不同處理組斑馬魚(yú)行為差異并分析其變化；通過(guò)硫黃素S染色測(cè)定各組斑馬魚(yú)頭部Aβ斑塊沉積數(shù)；采用酶活測(cè)定試劑盒檢測(cè)各組斑馬魚(yú)乙酰膽堿酯酶活性；以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)自噬相關(guān)基因（beclin1、ulk1b、ulk2和atg7）的表達(dá)變化；借助分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證木蝴蝶苷A與自噬相關(guān)蛋白（beclin1、ulk1b、ulk2和atg7）結(jié)合的可靠性。結(jié)果表明，木蝴蝶苷A緩解了六水合氯化鋁造成的斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)障礙，降低了Aβ斑塊沉積數(shù)和乙酰膽堿酯酶活性水平，使自噬相關(guān)基因的異常表達(dá)趨于正常。該研究初步揭示了木蝴蝶苷A能夠緩解六水合氯化鋁誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)障礙，其機(jī)制可能與激活細(xì)胞自噬有關(guān)，這為木蝴蝶苷A的臨床應(yīng)用及其治療阿爾茨海默病的相關(guān)研究提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：阿爾茨海默?。涣下然X；自噬；斑馬魚(yú)；木蝴蝶苷A

中圖分類(lèi)號(hào)：R965?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號(hào)：1002-4026（2023）06-0028-10

Anti-Alzheimer′s disease activity of oroxin A and its

mechanism of action based on zebrafish model

SHI Ruidie1，2， GAO Xin2， WANG Baokun2， GAO Daili2， JIN Meng2*， ZHANG Xiujun1*

（1. College of Psychology and Mental Health， North China University of Science and Technology， Tangshan 063200， China;

2. Key Laboratory of Drug Screening Technology of Shandong Academy of Sciences， Biology Institute，

Qilu University of Technology （Shandong Academy of Sciences）， Jinan 250103， China）

Abstract∶To investigate the ameliorative effects of oroxin A on Alzheimer′s disease （AD） and the underlying mechanism of action， a zebrafish AD model induced by aluminum chloride hexahydrate （AlCl3） was used. Wild-type zebrafish AB larvae at 3? dpf（days post fertilization） were divided into different groups， including negative control group， AlCl3 （80 μmol/L） model control group， AlCl3 （80 μmol/L） combined with donepezil （6 μmol/L） positive control group， and AlCl3 （80 μmol/L） combined with different concentrations （5， 10， and 20 μmol/L） of oroxin A test group. At 6 dpf， zebrafish behavior was monitored and analyzed using zebrafish light-dark locomotion test. Aβ deposition in zebrafish heads was assayed by thioflavin S staining. Acetylcholine assay kit tested acetylcholinesterase （AchE） activity. In addition， the expression of autophagy-related genes（beclin1、ulk1b、ulk2 and atg7） was tested by real-time quantitative polymerase chain reaction. Molecular docking was performed to validate the interaction between oroxin A and autophagy-related protein（beclin1、ulk1b、ulk2 and atg7）. The results indicated that oroxin A significantly relieved the dyskinesia and inhibited Aβ deposition and AchE activity of zebrafish induced by AlCl3. The expression of autophagy-related genes tended to be normal after oroxin A treatment. This study preliminarily revealed that oroxin A alleviated AlCl3-induced AD symptoms in zebrafish， where the underlying mechanism of action is possibly associated with activated autophagy， providing a theoretical basis for the clinical application of oroxin A and its related research in treating AD.

Key words∶Alzheimer′s disease; aluminum chloride hexahydrate; autophagy; zebrafish; oroxin A

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）是一種常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，主要病理特征是細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）斑塊的沉積和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成［1］。AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，目前廣為認(rèn)可的發(fā)病機(jī)制假說(shuō)包括淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說(shuō)、tau蛋白異常磷酸化假說(shuō)、膽堿能假說(shuō)等［2］。目前針對(duì)AD的治療，主要是膽堿酯酶抑制劑（多奈哌齊、加蘭他敏和卡巴拉?。┖蚇-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑（美金剛）［2］。這些藥物雖然能在一定程度上改善AD患者的行為和認(rèn)知障礙，但并不能治愈或者預(yù)防該疾病。

自噬是細(xì)胞自我降解的過(guò)程，在去除錯(cuò)誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)、清除受損細(xì)胞器等方面起著重要作用［3］。研究表明自噬的增強(qiáng)能夠降低人神經(jīng)元細(xì)胞中tau蛋白的過(guò)度磷酸化，緩解AD小鼠模型的記憶障礙［4］。杜仲雄花通過(guò)調(diào)節(jié)自噬基因異常表達(dá)來(lái)改善AD樣癥狀［5］。自噬與AD病理之間存在復(fù)雜的聯(lián)系，這表明自噬相關(guān)蛋白（beclin1、ulk2、ulk1b和atg7）可能是AD治療的重要靶點(diǎn)。

中藥木蝴蝶來(lái)源于紫葳科植物木蝴蝶的干燥成熟種子，具有清肺利咽、疏肝和胃等作用［6］。木蝴蝶苷A是木蝴蝶提取而得到的一種黃酮類(lèi)物質(zhì)。研究表明，木蝴蝶苷A具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗癌等特性，但目前還缺乏關(guān)于木蝴蝶苷A對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病作用的研究［7-8］。斑馬魚(yú)是人類(lèi)疾病和藥物開(kāi)發(fā)的理想模型系統(tǒng)，常用于研究AD、帕金森病、精神分裂癥等神經(jīng)退行性疾病。六水合氯化鋁誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)AD模型，是一種比較成熟的能夠反映AD主要特征性病理變化的體內(nèi)動(dòng)物模型［9］。

本研究中，我們使用六水合氯化鋁誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)AD模型，通過(guò)觀察并記錄斑馬魚(yú)的行為表現(xiàn)，檢測(cè)乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AchE）的活性和Aβ斑塊沉積以及測(cè)定自噬相關(guān)基因的表達(dá)變化，從而分析木蝴蝶苷A對(duì)六水合氯化鋁誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)AD癥狀是否具有緩解作用，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探究。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Z-A-S5斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)（上海海圣公司）；ZebraLab 3.3 Zebrabox 斑馬魚(yú)行為分析儀（法國(guó)Viewpoint 公司）；HPG-280BX光照培養(yǎng)箱（東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）；13720實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀器（瑞士Roche 診斷產(chǎn)品有限公司）；C1000 Touch梯度 PCR 儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；FV1200激光掃描共聚焦顯微鏡（日本Olympus 公司）；NanoDrop One超微量分光光度計(jì)（上?；蛏锛夹g(shù)國(guó)際貿(mào)易有限公司 ）；Spectra MR全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Dynex 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

木蝴蝶苷A（批號(hào)DM0028，純度≥96％，成都樂(lè)美天醫(yī)藥科技有限公司）；六水合氯化鋁（批號(hào)A112511，純度99.99％，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；鹽酸多奈哌齊（批號(hào)D129948，純度≥98％，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）； RNA 快速提取試劑盒（批號(hào)312423AX，北京艾德萊生物科技有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)E047-01B，蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)052319190910， 上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（批號(hào)E096-01B，蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司）；硫磺素S（批號(hào)MKCH4108，美國(guó)Sigma公司）；AchE活性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20200829，南京建成生物工程研究所）；N-苯基硫脲（批號(hào)P7629，美國(guó)Sigma公司）；0.3% Triton X-100（批號(hào)3466850，上海生工生物工程有限公司）；檸檬酸鈉抗原修復(fù)液（1×）（批號(hào)20190322，北京索萊寶科技有限公司）；4%多聚甲醛（批號(hào)71041800，北京蘭杰柯科技有限公司）。

1.3 斑馬魚(yú)品系

野生型AB品系斑馬魚(yú)由山東省科學(xué)院生物研究所提供。將成年斑馬魚(yú)飼養(yǎng)在恒溫 28 ℃的養(yǎng)殖系統(tǒng)中，每天同一時(shí)間段給與14 h/10 h的光照循環(huán)，定點(diǎn)喂食兩次豐年蝦。將成年斑馬魚(yú)按照2：2的雌雄比例于前一天分別放置于魚(yú)缸中，用擋板將雌雄魚(yú)分開(kāi)，并于第二天早上8：30抽取擋板，大概2 h后，將魚(yú)缸中的魚(yú)卵轉(zhuǎn)移到玻璃缸中，并加入5 g/L的亞甲基藍(lán)，之后放置在恒溫28 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理

將受精后3 d的斑馬魚(yú)隨機(jī)轉(zhuǎn)移到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，之后將斑馬魚(yú)隨機(jī)分為6個(gè)組：陰性對(duì)照組，六水合氯化鋁（80 μmol/L）模型對(duì)照組，六水合氯化鋁和不同濃度 （5、10和20 μmol/L） 木蝴蝶苷A受試物共處理組，六水合氯化鋁和多奈哌齊（6 μmol/L）陽(yáng)性對(duì)照組。每天給藥一次，之后放置在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在斑馬魚(yú)受精后6 d進(jìn)行明暗交替行為學(xué)觀察，AchE活性檢測(cè)，斑馬魚(yú)頭部Aβ斑塊數(shù)檢測(cè)和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR分析自噬相關(guān)基因的表達(dá)。

2.2 明暗交替行為學(xué)觀察

將受精后6 d的斑馬魚(yú)（n=32）分別吸入到48孔板中，每孔加入1 mL的養(yǎng)魚(yú)水。將斑馬魚(yú)置于行為學(xué)觀測(cè)箱中在100%光照環(huán)境中適應(yīng)10 min，之后進(jìn)行60 min包括3組明暗交替循環(huán)（10 min黑暗，10 min光照）的行為學(xué)測(cè)試。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后利用Zebrabox 斑馬魚(yú)行為分析儀對(duì)斑馬魚(yú)的游動(dòng)軌跡、游動(dòng)速度和游動(dòng)距離進(jìn)行分析。

2.3 AchE活性檢測(cè)

將藥物處理結(jié)束的受精后6 d的斑馬魚(yú)（n=100）收集在1.5 mL的離心管中，每管加入200 μL的生理鹽水，之后用破碎機(jī)進(jìn)行破碎勻漿。以11 000 r/min的轉(zhuǎn)速在4 ℃離心10 min后取上清液，之后按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定562 nm處的光密度值（optical density，OD）并計(jì)算樣品的蛋白濃度。之后根據(jù)AchE活性檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)，稍作修改后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。具體操作為分別吸取雙蒸水、底物緩沖液和顯色應(yīng)用液各5、50、50 μL配置空白管所需溶液；分別吸取標(biāo)準(zhǔn)液、底物緩沖液和顯色應(yīng)用液各5、50、50 μL配置標(biāo)準(zhǔn)管所需溶液；分別吸取各組斑馬魚(yú)樣品蛋白上清液、底物緩沖液和顯色應(yīng)用液各5、50、50 μL配置不同處理組的測(cè)定溶液。之后將各組配置好的溶液振蕩混勻后加入到96孔板中，每個(gè)處理組5次重復(fù)。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育20 min后，每孔加入10 μL的透明劑和3 μL的抑制劑。在室溫下放置15 min后，使用酶標(biāo)儀在412 nm波長(zhǎng)和0.5 cm光徑處測(cè)定OD值，之后根據(jù)各樣品組的OD值和濃度，計(jì)算得出各處理組的AchE活力。

2.4 斑馬魚(yú)頭部Aβ斑塊數(shù)檢測(cè)

將受精后的斑馬魚(yú)卵收到養(yǎng)魚(yú)缸之后，加入1 mg/mL的N-苯基硫脲以抑制黑色素的形成。每天同一時(shí)間換一次液，其他藥物處理方法同2.1節(jié)所述。將4%多聚甲醛處理后的受精后6 d的斑馬魚(yú)放入4 ℃冰箱中過(guò)夜。第二天使用磷酸緩沖鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）將斑馬魚(yú)清洗3次，每次10 min。將清洗完的斑馬魚(yú)使用1％的瓊脂凝膠固定后，進(jìn)行酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟浸潤(rùn)。之后將處理完的蠟塊，以7 μm間距進(jìn)行橫切切片。脫蠟之后在室溫下用PBS洗滌切片5 min，重復(fù)3次。吸干水分，用免疫組化筆將載玻片上的組織框起來(lái)。然后按照3 μL：1 mL比例配制0.3 %TritonX-100和檸檬酸鈉抗原修復(fù)液（1×），混勻后加到框起來(lái)的組織上，在4 ℃冰箱孵育20 min后，用PBS清洗2次，每次5 min。用濾紙將載玻片上的PBS完全吸干后，在免疫組化筆圈住的部分加入0.3%硫黃素S，并放入4 ℃冰箱避光過(guò)夜。第二天用PBS在避光環(huán)境下洗滌切片10 min，重復(fù)3次，之后用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察斑馬魚(yú)頭部Aβ斑塊沉積狀況并進(jìn)行拍照。使用Image-Pro Plus 5.1分析圖像，并計(jì)數(shù)斑馬魚(yú)頭部Aβ斑塊沉積數(shù)。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR分析自噬相關(guān)基因的表達(dá)

將藥物處理結(jié)束的受精后6 d的斑馬魚(yú)（n=30）收集在1.5 mL的離心管中，每管加入500 μL的裂解液，之后用破碎機(jī)進(jìn)行破碎勻漿。按照RNA快速提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA提取后，利用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)不同組別斑馬魚(yú)的RNA濃度。之后立即使用C1000 Touch梯度PCR儀將RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行稀釋?zhuān)蟾鶕?jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，加入相應(yīng)的引物。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，用Cq值計(jì)算各組樣品基因的差異表達(dá)，選用rpl13a為內(nèi)參，目的基因與內(nèi)參基因的Cq差值用ΔCq表示，ΔΔCq值為各樣品的ΔCq值與Ctl組ΔCq值平均數(shù)的差值，mRNA的相對(duì)表達(dá)量根據(jù)2-ΔΔCq相對(duì)定量法計(jì)算，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)組。引物序列見(jiàn)表1。

2.6 分子對(duì)接的準(zhǔn)備過(guò)程

木蝴蝶苷A的3D結(jié)構(gòu)從PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載，自噬相關(guān)蛋白（beclin1、ulk1b、ulk2和atg7）的3D結(jié)構(gòu)從Protein Data Bank（https： //www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載。使用薛定諤分子對(duì)接軟件對(duì)自噬相關(guān)蛋白進(jìn)行加氫、去水等處理，之后將自噬相關(guān)蛋白和木蝴蝶苷A進(jìn)行對(duì)接，以對(duì)接分?jǐn)?shù)作為分子對(duì)接的結(jié)果，最后借助Pymol進(jìn)行可視化分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用Graph Pad Prism 7.0通過(guò)單向方差分析和雙向方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用x±s表示，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 木蝴蝶苷A具有緩解六水合氯化鋁誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)障礙作用

如圖1（a）和1（b）所示，與空白對(duì)照組的斑馬魚(yú)相比，六水合氯化鋁模型對(duì)照組中斑馬魚(yú)的游動(dòng)總距離明顯變短（P＜0.001），游動(dòng)速度減緩。與六水合氯化鋁模型對(duì)照組相比，不同濃度的木蝴蝶苷A受試物（5、10、20 μmol/L）與六水合氯化鋁共同處理時(shí)，斑馬魚(yú)的游動(dòng)總距離（P=0.009，P=0.002，P＜0.001）和速度均顯著增加。與六水合氯化鋁模型對(duì)照組相比，六水合氯化鋁和多奈哌齊陽(yáng)性對(duì)照組的速度和總距離有所增加，其結(jié)果（P=0.23）不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如圖1（a）所示，在黑暗環(huán)境下，不同藥物處理組斑馬魚(yú)的游動(dòng)距離變化與總游動(dòng)距離變化具有一致性。以上結(jié)果表明，木蝴蝶苷A對(duì)六水合氯化鋁誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)障礙具有一定的緩解作用。

3.2 木蝴蝶苷A對(duì)斑馬魚(yú)頭部Aβ斑塊沉積的抑制作用

如圖2（a）和2（b）所示，與空白對(duì)照組相比，六水合氯化鋁模型對(duì)照組的斑馬魚(yú)大腦中Aβ斑塊的數(shù)明顯增多（P＜0.001）。與六水合氯化鋁模型對(duì)照組相比，六水合氯化鋁和多奈哌齊陽(yáng)性對(duì)照組中Aβ斑塊沉積數(shù)減少（P=0.06），六水合氯化鋁和木蝴蝶苷A受試物組的Aβ斑塊沉積數(shù)顯著降低（P=0.03，P=0.002）。

3.3 木蝴蝶苷A對(duì)AchE活性的抑制作用

抑制AchE活性，可以提高腦中的乙酰膽堿水平，從而改善AD患者的學(xué)習(xí)記憶障礙［10］。在本實(shí)驗(yàn)中，研究探討了木蝴蝶苷A對(duì)六水合氯化鋁處理的斑馬魚(yú)AchE活性的影響。如圖3所示，與空白對(duì)照組相比，六水合氯化鋁模型對(duì)照組斑馬魚(yú)的AchE活性顯著增加（P＜0.001）。與六水合氯化鋁模型對(duì)照組相比，六水合氯化鋁和多奈哌齊陽(yáng)性對(duì)照組中斑馬魚(yú)的AchE活性顯著降低（P=0.008），在六水合氯化鋁和木蝴蝶苷A受試物組中斑馬魚(yú)的AchE活性也顯著降低（P＜0.001），且劑量與效應(yīng)呈正相關(guān)。

3.4 木蝴蝶苷A對(duì)自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖4所示，與空白對(duì)照組相比，六水合氯化鋁模型對(duì)照組中beclin1、ulk1b、ulk2、和atg7的表達(dá)明顯下調(diào)（P=0.02，P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001）。如圖4（a）所示，與六水合氯化鋁模型對(duì)照組相比，六水合氯化鋁與5、20 μmol/L木蝴蝶苷A受試物組beclin1表達(dá)明顯上調(diào)（P=0.001，P＜0.001）；如圖4（b）所示，六水合氯化鋁與不同濃度木蝴蝶苷A（5、10、20 μmol/L）受試物組中ulk1b的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001）；如圖4（c）所示，六水合氯化鋁與5、20 μmol/L木蝴蝶苷A受試物組ulk2表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.001，P＜0.001）；如圖4（d）所示，六水合氯化鋁與不同濃度木蝴蝶苷A（5、10、20 μmol/L）受試物atg7的表達(dá)也明顯上調(diào)（P=0.01，P＜0.001，P＜0.001）。

3.5 分子對(duì)接結(jié)果

通過(guò)2.6方法對(duì)木蝴蝶苷A與自噬相關(guān)蛋白（beclin1、ulk1b、ulk2和atg7） 進(jìn)行分子對(duì)接，得出圖5，即belclin1（PDB ID：4ZW1）與木蝴蝶苷A的對(duì)接、ulk1b（PDB ID：6YID）與木蝴蝶苷A的對(duì)接、ulk2（PDB ID：6QAT）與木蝴蝶苷A的對(duì)接、atg7（PDB ID：4PH4）與木蝴蝶苷A的對(duì)接。木蝴蝶苷A與belclin1、ulk1b、ulk2和atg7的對(duì)接分?jǐn)?shù)分別為-6.707、-7.708、-7.888、-7.249，這說(shuō)明木蝴蝶苷A對(duì)自噬相關(guān)蛋白發(fā)揮調(diào)控作用。

4 討論與結(jié)論

AD是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，可導(dǎo)致神經(jīng)元喪失、腦萎縮和死亡。研究表明，木蝴蝶能夠改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，但具體哪些化學(xué)成分起作用還未見(jiàn)報(bào)道，所以我們利用六水合氯化鋁誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)AD模型去探討木蝴蝶苷A的抗AD活性。正常斑馬魚(yú)在面對(duì)突然的刺激時(shí)，會(huì)表現(xiàn)出快速的保護(hù)反應(yīng)。研究表明斑馬魚(yú)幼魚(yú)在受精后4 d后暴露于明暗交替的刺激時(shí)，在光亮中運(yùn)動(dòng)活動(dòng)會(huì)突然增加［11］。斑馬魚(yú)明暗交替行為學(xué)測(cè)試常被用來(lái)識(shí)別測(cè)定藥物的神經(jīng)保護(hù)活性，通過(guò)評(píng)估斑馬魚(yú)的游動(dòng)軌跡、游動(dòng)距離和速度，可以了解其神經(jīng)行為效應(yīng)［10］。在本研究中，明暗交替行為學(xué)測(cè)試表明，與空白對(duì)照組相比六水合氯化鋁模型組的斑馬魚(yú)游動(dòng)速度減慢，游動(dòng)距離變短，表明斑馬魚(yú)的認(rèn)知能力受損，反應(yīng)遲緩，不能對(duì)外界刺激做出及時(shí)的反應(yīng)。而經(jīng)過(guò)木蝴蝶苷A的處理，這種表現(xiàn)有所改變，這提示木蝴蝶苷A對(duì)六水合氯化鋁誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)障礙具有緩解作用。AD的特征在于海馬和新皮層中AchE活性升高，使AD患者腦內(nèi)乙酰膽堿水平降低，影響神經(jīng)信號(hào)的傳遞，從而損傷學(xué)習(xí)記憶能力［12］。抑制AchE活性，可以提高腦中的乙酰膽堿水平，改善AD患者的學(xué)習(xí)記憶障礙［13］。有研究表明暴露于六水合氯化鋁的斑馬魚(yú)在50～250 μmol/L的濃度范圍內(nèi)顯示出AchE活性增加，運(yùn)動(dòng)活性缺乏［14］。我們的研究結(jié)果表明，六水合氯化鋁和木蝴蝶苷A受試物組的斑馬魚(yú)AchE的活性水平降低，這說(shuō)明木蝴蝶苷A能夠抑制AchE活性，減少乙酰膽堿的水解。Aβ的細(xì)胞毒性已在眾多體內(nèi)和體外研究中得到證實(shí)，腦實(shí)質(zhì)中Aβ斑塊的沉積在AD發(fā)病機(jī)制中起著核心作用［15］。Aβ沉積會(huì)引發(fā)一系列相關(guān)反應(yīng)，導(dǎo)致tau蛋白的錯(cuò)誤折疊和組裝，進(jìn)而將病變擴(kuò)散到整個(gè)神經(jīng)回路和皮層，最終損害神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致認(rèn)知能力下降［16］。我們的研究表明，木蝴蝶苷A明顯降低了AD模型中斑馬魚(yú)頭部的Aβ斑塊計(jì)數(shù)。以上表明木蝴蝶苷A能夠緩解六水合氯化鋁誘導(dǎo)的AD樣癥狀。為了進(jìn)一步探究木蝴蝶苷A是如何發(fā)揮抗AD活性的，我們進(jìn)行了機(jī)制探究。

自噬在Aβ的生成和代謝中起重要作用，與AD發(fā)病進(jìn)展密切相關(guān)［17］。beclin1是酵母自噬蛋白atg6和apg6的同系物，被認(rèn)為是自噬體形成的標(biāo)記蛋白。研究表明抑制beclin1的表達(dá)會(huì)增加AD中Aβ的聚集，從而加速神經(jīng)病變［18］。還有研究表明AD患者神經(jīng)元beclin1表達(dá)明顯下降［19］。在本研究中，六水合氯化鋁模型組，beclin1的基因表達(dá)量明顯下調(diào)，六水合氯化鋁和木蝴蝶苷A受試物組beclin1的表達(dá)量上調(diào)，說(shuō)明木蝴蝶苷A能夠促進(jìn)Aβ在細(xì)胞內(nèi)部降解。ulk1b具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，ulk2和ulk1b在自噬的起始階段發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［20］。六水合氯化鋁模型組ulk2和ulk1b的表達(dá)明顯下調(diào)，而六水合氯化鋁和木蝴蝶苷A受試物組ulk2和ulk1b的表達(dá)明顯上調(diào)，說(shuō)明木蝴蝶苷A能夠激活自噬的表達(dá)。atg7是與自噬相關(guān)的細(xì)胞降解和再循環(huán)的必需蛋白質(zhì)，主要參與自噬小體的形成，是調(diào)節(jié)自噬偶聯(lián)系統(tǒng)的關(guān)鍵基因［21］。研究發(fā)現(xiàn)AD小鼠模型大腦皮層和海馬體中atg7蛋白水平降低［22］。六水合氯化鋁模型組，atg7的表達(dá)明顯降低，抑制了自噬的過(guò)程，而六水合氯化鋁和木蝴蝶苷A受試物組atg7的表達(dá)明顯上調(diào)，說(shuō)明atg7激活了自噬，可能促進(jìn)自噬性溶酶體的形成，恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)?；诜肿訉?duì)接初步模擬木蝴蝶苷A與自噬相關(guān)蛋白（beclin1、ulk1b、ulk2和atg7）之間的分子作用機(jī)制，對(duì)接分?jǐn)?shù)的大小直接反應(yīng)預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，對(duì)接分?jǐn)?shù)越小表示結(jié)合活性越高。其對(duì)接分?jǐn)?shù)均為負(fù)數(shù)，表明木蝴蝶苷A與自噬相關(guān)蛋白（beclin1、ulk1b、ulk2和atg7）具有良好的結(jié)合能力。這進(jìn)一步驗(yàn)證了木蝴蝶苷A能對(duì)自噬相關(guān)蛋白發(fā)揮調(diào)控作用，但后續(xù)仍需進(jìn)一步的生物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究通過(guò)對(duì)六水合氯化鋁誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)行為的觀察、AchE活性的檢測(cè)以及Aβ斑塊的沉積情況，預(yù)測(cè)了木蝴蝶苷A對(duì)AD的潛在治療作用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR以及分子對(duì)接的結(jié)果提示木蝴蝶苷A可能通過(guò)激活自噬， 從而發(fā)揮抗AD活性。本研究為治療AD藥物研發(fā)拓展了新思路，但還需要采取哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)等方法做進(jìn)一步的驗(yàn)證。

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