李鴻俠， 孫一萌， 張鴻濤， 韓樹(shù)旺， 張德林， 尚海濤， 郭 午， 劉軍艦， 李忠廉

1 天津市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肝膽胰外科， 天津 300100； 2 天津醫(yī)科大學(xué)研究生院， 天津 300070

肝細(xì)胞癌（HCC）是一種常見(jiàn)且致命的實(shí)體惡性腫瘤［1］，其發(fā)病率居世界第六位，死亡率居世界第四位［2-5］。目前HBV 感染是導(dǎo)致HCC 的主要致病因素，全球50%～80%的HCC 都是由HBV 感染引起的［6-7］。HBV 屬于嗜肝DNA 病毒科，其基因組共編碼7 種蛋白，包括參與病毒復(fù)制的DNA 聚合酶Pol［8-10］；介導(dǎo)病毒進(jìn)入的三種表面抗原（HBs），即?。⊿）、中（M）和大（L）表面抗原［11］；組成病毒衣殼結(jié)構(gòu)的核心抗原（HBcAg）；分泌到血清中的e 抗原（HBeAg）［11-13］以及具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的HBx抗原［14-17］。其中，HBV DNA聚合酶是唯一具有酶活性的蛋白質(zhì)。研究［18-19］表明，HBV DNA聚合酶是一種多功能蛋白質(zhì)，除了參與病毒復(fù)制和病毒包裝之外，還具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和免疫調(diào)節(jié)［20-24］等多種生物學(xué)功能。然而HBV DNA 聚合酶是否也參與了肝癌細(xì)胞的免疫逃逸，尚不清楚。

本研究旨在闡明HBV DNA 聚合酶是否參與介導(dǎo)了T 淋巴細(xì)胞的功能衰竭并進(jìn)而引起了HBV 相關(guān)HCC 腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，以及在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步闡明分子機(jī)制，這將有助于HBV 相關(guān)HCC 腫瘤細(xì)胞免疫逃逸機(jī)制的完善，或許可以為臨床提供新的思路以建立新的免疫治療方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒 本研究所用的空載體質(zhì)粒為pcDNA3.1（+），購(gòu)自Invitrogen，其余質(zhì)粒均在此基礎(chǔ)上應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行構(gòu)建。所用引物序列見(jiàn)表1。

1.1.2 細(xì)胞系 人肝癌細(xì)胞系Huh7、HepG2 和人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat 購(gòu)自ATCC 細(xì)胞庫(kù)。Huh7 和HepG2 細(xì)胞使用DMEM 完全培養(yǎng)基（Gibco?）進(jìn)行培養(yǎng)，Jurkat 細(xì)胞使用RPMI-1640 完全培養(yǎng)基（Gibco?）進(jìn)行培養(yǎng)，所有培養(yǎng)基均含10%胎牛血清（Gibco?）、100 IU/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素。細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境為含有5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱。

1.1.3 抗體和試劑 小鼠抗人Flag 抗體購(gòu)自Sigma-Aldrich，兔抗人GAPDH 抗體、兔抗人ICAM1 抗體、兔抗人STAT3 抗體、兔抗人p65 抗體和兔抗人p50 抗體購(gòu)自Abcam。辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的抗小鼠和抗兔二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。刀豆素A（Con A）購(gòu)自Solarbio，放線菌素D、環(huán)己酰亞胺、G418 購(gòu)自Sigma-Aldrich，所有試劑均以DMSO 溶解使用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞共培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系或?qū)φ占?xì)胞與Jurkat 細(xì)胞以3∶1 的比例接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行48 h 的培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為RPMI-1640完全培養(yǎng)基。然后將Jurkat 細(xì)胞分離出來(lái)，通過(guò)添加10 μg/mL ConA 刺激24 或48 h 以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用lipofectamine 2000（Invitrogen）按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.2.2 MTT法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將Jurkat細(xì)胞以105/孔接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。在培養(yǎng)24 或48 h 后，每孔加入5 mg/mL 的MTT（Sigma）溶液10 μL，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。此后吸出培養(yǎng)基，加入100 μL 的DMSO（Sigma）溶液，搖床避光5 min，之后用紫外分光光度計(jì)（Bio Tek）在490 nm（A490）處讀取吸光度。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR） 使用RNAiso Plus試劑（Takara）提取細(xì)胞總RNA。cDNA是根據(jù)制造商的實(shí)驗(yàn)方案使用PrimeScript? RT Master Mix（Takara）生成的。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器（LC480Ⅱ）和SYBR綠色PCR預(yù)混液（Takara）對(duì)cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR定量，相對(duì)定量表示為2-?Ct。Real-time引物如下：ICAM1上游及下游引物分別為5′-CAAGGCCTCAGTCAGTGTGA-3′和5′-CCTCTGGCTTCGTCAGAATC-3′；HBV-P 上 游 及 下 游引 物 分 別 為5′-CTCTCTTTACGCGGACTCCC-3′和5′-TCTTCTAGGGGACCTGCCTC-3′；GAPDH 上 游 及 下 游引 物 分 別 為5′-CAAAATGGTGAAGGTCGGTGT-3′和5′-TGATGTTAGTGGGGTCTCGCT-3′。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞上清液，根據(jù)制造商的說(shuō)明用人IFN-γ ELISA 試劑盒（Solarbio）進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)Curve Expert1.4 分析結(jié)果。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）實(shí)驗(yàn) 收獲細(xì)胞，用RIPA 裂解緩沖液（1 mmol/L MgCl2，10 mmol/L Tris-HCl pH=7.4，0.1% SDS，1% NP-40）提取蛋白質(zhì)，然后通過(guò)Western 印跡分析蛋白質(zhì)表達(dá)，如前所述［25］，GAPDH 作為內(nèi)參。所用抗體比例如下：抗ICAM1 抗 體（1∶1 000）、抗Flag 抗 體（1∶3 000）、抗STAT3 抗體（1∶500）、抗p65 抗體（1∶500）、抗p50 抗體（1∶500）、抗GAPDH 抗體（1∶3 000）、HRP 偶聯(lián)的抗小鼠二抗（1∶3 000）和HRP偶聯(lián)的抗兔二抗（1∶2 000）。

1.2.6 RNA-seq 從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Flag-HBV-P 的細(xì)胞系中提取總RNA，由北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本分析。數(shù)據(jù)生成和標(biāo)準(zhǔn)化后分析HCC 細(xì)胞中HBV DNA聚合酶調(diào)節(jié)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定表達(dá)HBV DNA 聚合酶的人HCC 細(xì)胞會(huì)抑制Jurkat 細(xì)胞的功能 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞（Huh7、HepG2）的 增 殖（Huh7：t24=11.27，t48=11.75，HepG2：t24=11.37，t48=15.42，P值均<0.001）（圖1a、b）、活化（t值分別為5.921、6.211，P值均<0.01）（圖1c、d）和細(xì)胞因子分泌均降低（t值分別為7.761、8.564，P值均<0.01）（圖1e、f）。

圖1 穩(wěn)定表達(dá)HBV DNA聚合酶的人HCC細(xì)胞抑制了Jurkat細(xì)胞的增殖、CD69表達(dá)和IFN-γ分泌Figure 1 Human HCC cells stably expressing HBV DNA polymerase inhibit proliferation， CD69 expression and IFN-γ secretion in Jurkat cells

2.2 HBV DNA 聚合酶下調(diào)ICAM1 的表達(dá) 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中上調(diào)的基因有771 個(gè)，下調(diào)的基因有144 個(gè)（圖2a）。GO 富集分析（圖2b、c）尋找到下調(diào)的免疫相關(guān)分子ICAM1 且TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)（圖2d）顯示肝癌中的ICAM1 表達(dá)與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)（P值均<0.05）。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞（Huh7、HepG2）中ICAM1 的mRNA 表達(dá)水平（t值分別為4.959、5.091）和蛋白表達(dá)水平（t值分別為5.102、4.831）均明顯降低（P值均<0.01）（圖2e、f）。

2.3 網(wǎng)站預(yù)測(cè)ICAM1 啟動(dòng)子區(qū)域可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子 UCSC 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了ICAM1啟動(dòng)子區(qū)域可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，并初步篩選錨定了3 種轉(zhuǎn)錄因子NFKB1、RELA（參與NF-κB 信號(hào)通路）和STAT3（參與STAT 信號(hào)通路）（圖3a）。JASPAR 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了ICAM1 啟動(dòng)子區(qū)域中NFKB1、RELA 和STAT3 結(jié)合的可能區(qū)域位點(diǎn)及序列，將可信區(qū)間調(diào)到90%后，在ICAM1啟動(dòng)子區(qū)域存在5個(gè)篩選的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域（圖3b、c）。

2.4 HBV DNA 聚合酶通過(guò)抑制NF-κB 的表達(dá)下調(diào)ICAM1 水平 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞（Huh7、HepG2）中的p50 和STAT3 蛋白水平?jīng)]有明顯變化（P值均>0.05）（圖4a、b），但p65 的蛋白表達(dá)水平明顯降低（t值分別為12.67、11.66，P值均<0.01）（圖4c）。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞（Huh7、HepG2）過(guò)表達(dá)p65后，ICAM1 蛋白表達(dá)水平明顯升高，降表達(dá)p65 后，ICAM1蛋白表達(dá)水平明顯降低（P值均<0.01）（圖4d）；挽救實(shí)驗(yàn)中過(guò)表達(dá)p65 后，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的ICAM1表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P值均>0.05）（圖4e）。

圖4 HBV DNA聚合酶通過(guò)抑制NF-κB表達(dá)而下調(diào)ICAM1水平Figure 4 HBV DNA polymerase downregulates ICAM1 levels by inhibiting NF-κB expression

2.5 過(guò)表達(dá)ICAM1 可以部分緩解HBV DNA 聚合酶對(duì)免疫細(xì)胞功能的抑制 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞（Huh7、HepG2）的增殖（圖5a、b）、活化（圖5c、d）和細(xì)胞因子分泌（圖5e、f）均無(wú)明顯差異（P值均>0.05）。

圖5 ICAM1的過(guò)量表達(dá)部分緩解了HBV DNA聚合酶對(duì)免疫細(xì)胞功能的抑制Figure 5 Overexpression of ICAM1 partially alleviates the suppression of immune cell function by HBV DNA polymerase

3 討論

在目前的研究中確定ICAM1可以被HBV DNA聚合酶下調(diào)。具體來(lái)說(shuō)，HBV DNA 聚合酶通過(guò)抑制NF-κB中p65 的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)ICAM1 的轉(zhuǎn)錄，從而使ICAM1 在惡性肝細(xì)胞上表達(dá)減少，導(dǎo)致ICAM-1/淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1（lymphocyte function associated antigen-1，LFA-1）軸介導(dǎo)的腫瘤免疫逃逸，最終促進(jìn)HCC 的發(fā)展。

HCC 被認(rèn)為是一種高度異質(zhì)性的疾病，在腫瘤和鄰近組織之間有不同的免疫微環(huán)境［26］。腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞大多受到功能抑制，尤其是T 淋巴細(xì)胞，常常表現(xiàn)出功能衰竭，這使得腫瘤細(xì)胞可以逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視并促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。基于此，筆者研究了HBV DNA聚合酶對(duì)Jurkat細(xì)胞增殖、活化和細(xì)胞因子分泌的影響，發(fā)現(xiàn)HBV DNA 聚合酶抑制了Jurkat細(xì)胞的免疫功能。結(jié)果表明，HBV DNA 聚合酶可能在T淋巴細(xì)胞衰竭中發(fā)揮重要作用，從而導(dǎo)致HBV 相關(guān)HCC 腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。為了進(jìn)一步探尋具體機(jī)制，同時(shí)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄本的分析，尋找到了免疫相關(guān)分子ICAM1。

ICAM1 是一種細(xì)胞表面糖蛋白和黏附受體，又稱為CD54，屬于免疫球蛋白超家族［27］。ICAM1 在免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞中以較低的基礎(chǔ)水平表達(dá)，但在炎癥刺激下表達(dá)上調(diào)［28］，其最為人知的功能是調(diào)節(jié)白細(xì)胞從循環(huán)到炎癥部位的募集［29-30］。隨著研究的進(jìn)展，作為生物傳感器的ICAM-1 已經(jīng)成為許多基本細(xì)胞功能的主要調(diào)節(jié)者。ICAM-1 的受體有LFA-1和巨噬細(xì)胞分化抗原-1。其中，LFA-1是ICAM-1的主要受體，ICAM-1/LFA-1的相互作用被證明是白細(xì)胞遷移和T 淋巴細(xì)胞活化的關(guān)鍵步驟［31］。在腫瘤細(xì)胞中，它們的相互作用會(huì)產(chǎn)生腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）反應(yīng)［32］，從而啟動(dòng)抗腫瘤免疫過(guò)程。而腫瘤細(xì)胞中ICAM-1 表達(dá)的減少會(huì)阻止CTL 與腫瘤細(xì)胞的有效結(jié)合，在一定程度上有助于腫瘤逃避宿主免疫監(jiān)視。研究［33］表明，ICAM-1/LFA-1 的相互作用也能刺激NK 細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。另外，ICAM-1 的表達(dá)降低也顯示與各種癌癥的不良預(yù)后有關(guān)，如黑色素瘤、乳腺癌、結(jié)直腸癌和卵巢癌等。本研究中HCC 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，HBV DNA 聚合酶降低了ICAM1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。為了進(jìn)一步明確HBV DNA 聚合酶對(duì)ICAM1的下調(diào)發(fā)生在何種水平，進(jìn)行了mRNA 和蛋白半衰期實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明HBV DNA 聚合酶的過(guò)表達(dá)不會(huì)影響ICAM1 的半衰期。這些數(shù)據(jù)表明，HBV DNA 聚合酶對(duì)ICAM1 的下調(diào)是由于抑制了其轉(zhuǎn)錄。然而，目前似乎并沒(méi)有HBV DNA 聚合酶參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的相關(guān)研究。因此，筆者將研究方向轉(zhuǎn)移到了尋找HBV DNA 聚合酶可能調(diào)控且可以調(diào)控ICAM1 表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子上。通過(guò)網(wǎng)站預(yù)測(cè)初步篩選了3 種轉(zhuǎn)錄因子，Western Blot實(shí)驗(yàn)表明p65可以正調(diào)控ICAM1的表達(dá)，挽救實(shí)驗(yàn)中過(guò)表達(dá)p65 后，HBV DNA 聚合酶對(duì)ICAM1 的下調(diào)得到恢復(fù)，證明HBV DNA 聚合酶可以下調(diào)NF-κB 中p65 的表達(dá)并通過(guò)此方式下調(diào)ICAM1的表達(dá)。

此外，功能實(shí)驗(yàn)表明，HBV DNA 聚合酶在一定程度上影響了T 淋巴細(xì)胞的免疫抑制，并且在ICAM1 過(guò)表達(dá)之后這種作用被逆轉(zhuǎn)，證實(shí)了HBV DNA 聚合酶通過(guò)下調(diào)ICAM1的轉(zhuǎn)錄在HCC中起免疫抑制作用。

綜上所述，本研究揭示了HBV DNA聚合酶可以作為一個(gè)重要的調(diào)控因子來(lái)控制ICAM1 的表達(dá)以介導(dǎo)抗癌免疫逃逸，這不僅深入了解了HBV DNA聚合酶的生物學(xué)功能、揭示了ICAM1 的新調(diào)控機(jī)制，而且為改進(jìn)肝癌的臨床治療提供了新的思路和策略。但是目前的研究并沒(méi)有深入探索HBV DNA 聚合酶是如何下調(diào)NF-κB中p65的表達(dá)的，這也將是未來(lái)的研究重點(diǎn)。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：李忠廉、李鴻俠負(fù)責(zé)設(shè)計(jì)論文框架，起草論文；孫一萌、郭午負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)操作，研究過(guò)程的實(shí)施；尚海濤、張鴻濤負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，繪制圖表；韓樹(shù)旺、張德林負(fù)責(zé)論文修改；李忠廉、劉軍艦負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。