MOFs 仿生酶傳感器構筑及對肌氨酸的高靈敏檢測

吳瑋軒，楊欣，趙鐘興

（廣西大學 化學化工學院，廣西南寧 530004）

前列腺癌作為一種常見的惡性腫瘤嚴重危害人體的健康，其早期的診斷技術以篩查重要的腫瘤標志物為主[1-3]。目前最常用的前列腺腫瘤標志物為前列腺特異性抗原（PSA）和肌氨酸（Sar），PSA 并非前列腺癌的特異性抗原，以PSA 作為標志物對前列腺癌的檢測常常出現(xiàn)假陰性和假陽性的情況[4-7]。近年來對Sar 的研究發(fā)現(xiàn)，Sar 在血液和尿液中的濃度與前列腺癌關系密切，是更理想的前列腺腫瘤標志物，如何快速、靈敏、低成本檢測Sar 的濃度對前列腺癌的早期診斷至關重要[8]。

金屬-有機框架材料（Metal-Organic Frameworks，MOFs）是由金屬離子或金屬簇與有機配體，通過配位鍵自組裝形成的，具有獨特孔道結構的多孔結晶材料[9]。由于其獨特的孔結構、良好的穩(wěn)定性以及特殊的催化位點，MOFs 材料在納米酶傳感器方面獲得廣泛關注[10-12]。設計新型MOFs 納米酶傳感器并探究其實際應用仍是當下研究的熱點。ZHAO 等[13]利用鐵基金屬有機框架（NH2-MIL88B(Fe)，NM88B）作為過氧化氫酶納米酶，將H2O2催化生成·OH，進而將3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）氧化為藍色的TMBox。當通過NM88B 對多巴胺分子（DA）進行檢測時，DA 消耗·OH 從而抑制氧化反應，導致藍色的TMBox 消失，并且DA 還可以通過電子轉移的方式將NM88B 的藍色熒光猝滅。因此，可以利用NM88B比色和熒光雙模式檢測DA，在實際樣品檢測中也具有較好的檢測效果，表明該MOFs 納米酶具有良好的實際應用價值。YANG 等[14]將鈷基金屬有機框架（ZIF-67）作為人工納米酶平臺電沉積到阿霉素硼納米片（BNSs-DOX）上，制備得到UOx@MOF/BNSs-DOX 納米電化學傳感器，用于尿酸（UA）的酶促和電化學檢測，納米酶的高效負載使UA 檢測下限可達0.025 μmol/L。因此，構筑具有良好催化活性的納米酶，并將其應用于生物傳感器是一個有實際價值的研究方向。

本論文基于Sar 的酶級聯(lián)反應，提出復合仿生酶級聯(lián)的策略，設計出NH2-MIL88B(Fe)/ 核黃素（NM88B/Rf）電化學傳感器以促進催化H2O2的產生，并將級聯(lián)信號放大（從H2O2到·OH），來實現(xiàn)對Sar的高靈敏檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

核黃素（Rf）、肌氨酸、六水合氯化鐵、2-氨基對苯二甲酸、氫氧化鈉，分析純，上海麥克林生化科技有限公司；N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、丙酮，分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，分析純，上海阿拉丁生化科技有限公司；無水乙醇，分析純，四川西隴科學股份有限公司；甲基藍（MB），98.5%，廣東光華科技有限公司。

ME204E 型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DHG-9076A 型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；DZF-6051 型真空干燥箱，上海齊欣科學儀器有限公司；1702742S型超聲波清洗機，南京先歐儀器制造有限公司；01301T08913 型超薄磁力攪拌器，上海泰坦科技股份有限公司；PHS-3C 型pH 計，上海雷磁儀器有限公司；SU8020 型高分辨場發(fā)射掃描電鏡，日本日立公司；SMATLAB3KW 型X-射線衍射儀，日本理學株式會社；TU-1901 型紫外-可見分光光度計，深圳市億鑫儀器設備有限公司；PARSTAT 4000+型電化學工作站，美國阿美特克集團公司。

1.2 NM88B 的制備

分別稱量270 mg（1 mmol）FeCl3·6H2O 和181 mg（1 mmol）2-氨基對苯二甲酸于反應釜中，加入5 mL 的DMF，400 r/min 攪拌30 min；再加入0.4 mL氫氧化鈉溶液（2 mol/L），400 r/min 攪拌30 min；使用真空干燥箱在100 ℃下干燥12 h 可得到深褐色固體粉末狀材料。

1.3 改性電極的制備

在改性電極之前，使用0.30 μm 氧化鋁粉末拋光玻碳電極（GCE，d=5 mm），再使用蒸餾水洗滌GCE，洗滌后的GCE 放置在室溫下干燥。在改性電極時，將1.5 mg 的樣品NM88B 分散在1 mL 超純水中，于室溫下40 kHz 水浴超聲處理5 min 后形成均勻懸浮液，再將20 μL 的懸浮液滴涂在GCE 上并在紅外線燈的照射下干燥，得到改性電極NM88B/GCE。

1.4 肌氨酸傳感器的制備

將改性電極NM88B/GCE 放入1 100 mL 的核黃素水溶液中（1 mmol/L），在電化學工作站的STEP 模式下設置-0.6 V 電壓，時間90 s 的條件下電沉積，再將電極取出，使用超純水清洗電極表面1 次。室溫干燥后即得NM88B/Rf/GCE。

1.5 NM88B 結構表征

掃描電子顯微鏡（SEM）：將微量NM88B 固定于樣品臺上，在10 kV 電壓下放大50 倍圖像即可觀察NM88B 的形貌。

X 射線晶體衍射（XRD）：將2 mg NM88B 壓制于顯微鏡載片上，于室溫下進行測量。

1.6 NM88B 電化學表征

實驗采用三電極體系。循環(huán)伏安法（CV）的掃描電位范圍為-0.4 ～0.6 V，掃描速度為50 mV。電化學阻抗譜（EIS）掃描頻率為0.1 ～105 Hz；實驗溫度為室溫。

1.7 NM88B 的類酶催化

分 別 將20 μL 的NM88B（1 mg/mL）、TMB（0.5 mmol/L）與不同濃度H2O2底物（0.4 mmol/L、0.8 mmol/L、1.2 mmol/L、1.6 mmol/L、2.4 mmol/L 和2.8 mmol/L）進行穩(wěn)態(tài)動力學實驗；保持NM88B 添加量（20 μL，1 mg/mL）和H2O2濃度（30 mmol/L）不變，改變TMB底物濃度（0.4 mmol/L、0.8 mmol/L、1.2 mmol/L、1.6 mmol/L、2.4 mmol/L 和2.8 mmol/L）進行穩(wěn)態(tài)動力學實驗。動力學數(shù)據(jù)可根據(jù)Michaelis-Menten 方程計算，見式（1）：

式中，Km為米氏常數(shù)，mmol/L；Vmax為酶被底物飽和時的反應速度，μmol/（L·min）；S為底物濃度，mmol/L；V為反應速率，μmol/（L·min）。

1.8 傳感器對Sar 的定量檢測

在PBS 緩沖液pH=7.5、NM88B 滴涂量為1.5 mg/mL、Rf 電沉積時間為90 s 的條件下進行Sar 的定量檢測實驗。加入500 μmol/L MB 參與級聯(lián)反應的催化中間體時，在-0.28 V 時出現(xiàn)明顯增加的電信號,因此采用信號增強的方式分析Sar 的濃度。

1.9 傳感器的選擇性和時間穩(wěn)定性

傳感器選擇性：將100 μmol/L 的絲氨酸（Ser）、葡萄糖（Glu）、賴氨酸（Lys）、半胱氨酸（Cys）、氯化鉀（KCl）和氯化鈉（NaCl）分別加入含有MB 的溶液中進行抗干擾檢測，其余實驗條件及步驟與Sar 定量檢測相同。

傳感器時間穩(wěn)定性：同時制備3 個相同的NM88B/Rf/GCE 傳感器，分別在-4 ℃下儲存1 d 和7 d，在包含1.0 μmol/L Sar 的0.1 mol/L PBS 緩沖液（pH=6.5）中進行實驗。

2 結果與分析

2.1 NM88B 的結構表征

從圖1（b）中可看到，通過溶劑熱法所制備的NM88B 材料顆粒大小和尺寸較均勻，平均尺寸約為500 nm，晶體結構規(guī)整，表面光滑，呈現(xiàn)出紡錘形結構，與文獻報道一致[15]。圖1（a）為溶劑熱法合成NM88B 的XRD 譜圖，在2θ=9.2°、10.3°、13.1°、16.7°、18.5°、20.7°和29.5°出現(xiàn)衍射峰，分別對應(002)、(101)、(102)、(103)、(200)、(202) 和(302)晶面。衍射峰與晶體學信息文件（CCDC No. 647646）中建立的NM88B 結構模擬譜圖一致，說明NM88B 材料成功制備。

圖1 NM88B 的結構表征結果

2.2 電化學表征

圖2 為在含有0.1 mmol/L KCl 的5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-溶液下的CV 和EIS 曲線。從圖2（a）可知，裸電極具有較大的峰值電位分離（?EP=321.8 mV），對[Fe(CN)6]3-/4-探針具有較小的電流響應（Ipa=108.5 μA，Ipc=-121.3 μA）；而NM88B/GCE 的響應電流明顯高于裸電極（Ipa=238.1 μA，Ipc=-256.7 μA），峰值電位明顯減?。?EP=133.2 mV），這主要是由于在電極上滴涂了大比表面積的NM88B，增大了電極的表面積，促進了電極的電子轉移。相比于NM88B/GCE，NM88B/Rf/GCE 傳感器的電位峰分離幾乎不變（?EP=135.9 mV），而其響應電流顯著減小（Ipca=158.6 μA，Ipc=-177.2 μA），這說明由電沉積將電子傳遞能力較弱的Rf 引入MOFs 骨架中，NM88B 孔道被部分阻塞導致氧化還原峰電流降低。

圖2 裸電極、NM88B/GCE 以及NM88B/Rf/GCE 的電化學表征

圖2（b）為1.0 ～100.0 kHz 的開路電位條件下測量所得EIS 譜，通過Zview 軟件對所得數(shù)據(jù)進行擬合，得到其阻抗參數(shù)。NM88B/GCE 和NM88B/Rf/GCE電荷轉移電阻（Rct）分別為169.5 Ω 和174.1 Ω，與NM88B/Rf/GCE 的Rct 相比，NM88B/Rf/GCE 的轉移電阻較大，這是因為在原材料上電沉積了電子傳遞能力較弱的Rf，這也側面說明了Rf 的成功負載。此外，EIS 擬合所得數(shù)據(jù)和CV 測試圖結果一致，再次說明了NM88B 的成功制備和Rf 的成功負載。

2.3 NM88B 的類酶催化

通過測定反應的表觀穩(wěn)態(tài)動力學參數(shù)，進一步分析了NM88B 的類過氧化物酶活性，通過改變H2O2或TMB 的濃度，得出Michaelis-Menten 方程，并通過該方程斜率和截距計算出最大反應速度（Vmax）和米氏常數(shù)（Km）。已知，Km和Vmax是量化酶催化能力的兩個關鍵參數(shù)，其中Km是酶對底物的親和力，Km值越小，酶對底物的親和力越高。從圖3 可知，H2O2為底物的Km值為1.02 mmol/L，以TMB 為底物的Km值為1.11 mmol/L。相較于類似實驗報道的辣根過氧化物酶（HRP）的Km值（H2O2和TMB 的Km分別為2.61 mmol/L 和0.53 mmol/L）[16]，NM88B 以H2O2為底物的Km低于HRP，而以TMB 為底物的Km高于HRP，這說明NM88B 對H2O2的親和力大于HRP，對TMB 的親和力小于HRP。這是因為HRP 的活性中心只有一個Fe 離子，而NM88B 有多個Fe 離子，且材料的介孔結構有利于H2O2與Fe 離子的反應，同時也表明NM88B 具有良好的類過氧化氫酶催化活性。

圖3 NM88B 模擬類過氧化氫酶穩(wěn)態(tài)動力學實驗

2.4 NM88B/Rf/GCE 傳感器對Sar 的定量檢測

如圖4 所示，·OH 的氧化峰電流隨著Sar 的濃度增加而增加，并在1 nmol/L ～10 mmol/L 的范圍內呈線性關系，線性方程為Ipa=3.18lgCSar+25.85（R2=0.999），檢出限（S/N=3）為0.43 nmol/L。從這些結果可以看出，NM88B/Rf/GCR 傳感器在MB 的存在下對Sar 的檢測具有高靈敏度和選擇性，其主要原因是NM88B 的結構有助于Rf 催化Sar 生成的H2O2立刻被NM88B 催化氧化成·OH，使酶級聯(lián)效應高效地發(fā)生。此外，和其他報道相比（表1），NM88B/Rf/GCR 傳感器對Sar 具有較低的檢出限和較寬的檢測范圍。

表1 與不同修飾電極對Sar 的電化學檢測比較

圖4 Sar 檢測標準曲線

2.5 NM88B/Rf/GCE 傳感器的選擇性和時間穩(wěn)定性

為了探究NM88B/Rf/GCE 對Sar 檢測的抗干擾能力，研究了幾種Sar 類似物存在下的DPV 曲線。如圖5所示，首先進行空白樣品（Blank）的測試，再加入其他干擾物不能引起氧化峰電流的顯著增加，其與空白值的相對誤差在±8%之間，說明NM88B/Rf/GCE 傳感器表現(xiàn)出優(yōu)異的抗干擾性。

圖5 NM88B/Rf/GCE 傳感器的選擇性

為了探究傳感器的時間穩(wěn)定性，對依次保存0 d、1 d 和7 d 的電極進行測試，三次實驗的電流響應值分別為27.68 μA、27.61 μA 和26.68μA，NM88B/Rf/GCE 傳感器對Sar 的響應沒有明顯下降，Sar 的電流響應值仍然保留在初始值的96.4%，表明NM88B/Rf/GCE 具有良好的穩(wěn)定性。

3 結論

本文通過溶劑熱法合成具有高比表面積、開放的活性金屬位點以及類過氧化物酶活性的NM88B材料，并將其與成本低、低毒性、穩(wěn)定性好的具有類肌氨酸氧化酶活性的Rf 通過氫鍵作用相結合，制備了能對前列腺癌標記物Sar 高靈敏檢測的電化學傳感器，并在檢測體系中加入能夠被·OH 氧化的MB 來增強電化學響應電流，結論如下：

通過溶劑熱法合成NH2-MIL88B(Fe)，其SEM 和XRD圖均與文獻報道一致，說明了合成方法的可行性。由穩(wěn)態(tài)動力學分析發(fā)現(xiàn)NM88B 具有類過氧化物酶活性，并且能將Rf 催化氧化Sar 生成的H2O2分解成·OH對MB 進行氧化，因此它可以作為電化學傳感器運用于Sar 的檢測。最后通過電化學工作站的CV、DPV技術對NM88B/Rf/GCE 進行電化學檢測，Sar 的檢測范圍為1 nmol/L～10 mmol/L，其檢出限為0.42 nmol/L。除此之外，在抗干擾性實驗中發(fā)現(xiàn)其他干擾物對傳感器的檢測影響相對誤差均小于±8%，-4 ℃保存一周后其電流響應值仍然保留在初始值的96.4%，說明了NM88B/Rf/GCE 傳感器穩(wěn)定性良好。