肝細胞癌中7-脫氫膽固醇還原酶表達的臨床意義

莫偉嘉，張楚月，韋京妤，張觀蘭，唐宇星，殷彬烔，黃潔莊，羅嘉嫄，蔣洪棉，陳罡，吳華裕

（1.廣西醫(yī)科大學 第一附屬醫(yī)院病理科，廣西南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學 第五附屬醫(yī)院/南寧市第一人民醫(yī)院病理科，廣西南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學 第五附屬醫(yī)院/南寧市第一人民醫(yī)院醫(yī)學實驗中心，廣西南寧 530021）

膽固醇作為構(gòu)成細胞內(nèi)各種膜結(jié)構(gòu)的不可或缺的重要物質(zhì)，對真核生物細胞的生長發(fā)育和行為調(diào)控具有重要的作用[1]。維持膽固醇在組織細胞內(nèi)的動態(tài)平衡對于細胞正常生長發(fā)育極為重要[2]，膽固醇在細胞內(nèi)失衡可致使疾病的發(fā)生，如在肝炎向肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）發(fā)展的病理過程中，膽固醇的異常堆積有很大的推動作用[3]。有不少學者從不同的角度，描述了膽固醇對HCC 生物學行為的影響[4-6]。因此，發(fā)現(xiàn)膽固醇的潛在調(diào)節(jié)機制對于降低HCC 的發(fā)病風險、改變HCC 的生物學行為、改善HCC 的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后、尋求有效的靶向干預(yù)措施等具有重要的臨床意義。

在膽固醇的合成過程中，作為關(guān)鍵酶之一，7-脫氫膽固醇還原酶（7-Dehydrocholesterol Reductase，DHCR7）扮演著重要的角色[7-8]。DHCR7 可將維生素D 前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為膽固醇，以發(fā)揮調(diào)節(jié)膽固醇的作用。同時，有遺傳分析研究表明，25-羥維生素D（25-[OH]-D3）血清水平與丙型肝炎病毒（HCV）相關(guān)性HCC 具有相關(guān)性，而DHCR7 是調(diào)節(jié)25-[OH]-D3血清水平的決定性因素[9]。有分子機制研究表明，在（基因型2a）HCV 通過人肝癌細胞Huh7 中誘導(dǎo)出的人HCC 中，DHCR7 同時作為中樞基因和中樞節(jié)點存在，可能作為一種潛在的生物標志物對日本暴發(fā)性肝炎病毒（JFH-1）感染導(dǎo)致的HCC 的發(fā)生發(fā)展起到重要作用[10]。但如今還未見到探索DHCR7 mRNA 及蛋白在HCC 細胞中表達水平的相關(guān)報道，故本研究擬整合基因芯片、RNA 測序以及組織芯片數(shù)據(jù)，探索DHCR7 在HCC 的表達意義。

1 材料與方法

1.1 臨床數(shù)據(jù)收集

HCC基因芯片及測序數(shù)據(jù)來自ArrayExpress（https://www.ebi.ac.uk/biostudies/arrayexpress）、Gene Expression Omnibus（GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）、Genotype-Tissue Expression（GTEx，https://www.gtexportal.org/home/index.html） 和The Cancer Genome Atlas Program（TCGA，https://www.cancer.gov/ccg/research/genomesequencing/tcga）。納入的公共隊列樣本數(shù)據(jù)須滿足以下條件：（1）研究對象為智人；（2）公共隊列數(shù)據(jù)需包含HCC 和正常肝臟組織；（3）樣本為組織層次；（4）數(shù)據(jù)集中須包含DHCR7 的表達數(shù)據(jù)；（5）公共隊列數(shù)據(jù)樣本不受任何物理、化學或其他因素的影響。排除原則為：（1）動物標本；（2）無DHCR7 表達值的數(shù)據(jù)；（3）重復(fù)標本。

1.2 DHCR7 mRNA 在HCC 組織中的表達情況

使用STATA 14.0 軟件評估DHCR7 mRNA 的標準化平均差值（Standardized Mean Difference，SMD）。I2為入組研究之間的異質(zhì)性，I2＞50%或P＜0.05稱為高異質(zhì)性，采用隨機效應(yīng)模型；其余采用固定效應(yīng)模型。為研究DHCR7 對HCC 組織的鑒別能力，計算總體受試者工作特征曲線（summary Receiver Operating Characteristics，sROC），得到曲線下的總面積（Area Under the Curve，AUC），并計算敏感性和特異性。Egger’s 與Begg’s 檢驗用于判別合并結(jié)果是否具有發(fā)表偏倚，P≥0.05 提示結(jié)果不具有顯著的發(fā)表偏倚。

1.3 DHCR7 蛋白在HCC 中的表達水平

利用人類蛋白質(zhì)圖譜（The Human Protein Atlas，THPA）獲取DHCR7 蛋白在HCC 和非癌肝組織的表達情況，并進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 DHCR7 在HCC 及非癌肝對照組織中的mRNA表達水平

最終從上述數(shù)據(jù)庫中獲得了7 384 份樣本，包括3 941 份HCC 樣本和3 443 份對照樣本。為明確DHCR7 mRNA 在HCC 中的表達水平，整合納入數(shù)據(jù)集計算DHCR7 mRNA 表達量的SMD 值。由于I2＞75%且P＜0.01，研究采取隨機效應(yīng)模型，計算得出SMD 為0.35，95%置信區(qū)間（95%CI）為0.20 ～0.51（圖1）。SMD 結(jié)果的Egger’s 檢驗P值為0.521，Begg’s 檢驗P值為0.400，均顯示P＞0.05，圖像也顯示了一種對稱的形式，即總體上并不存在明顯的偏倚（圖2）。結(jié)果初步顯示，DHCR7 mRNA 表達在HCC 中顯著增多。

圖1 HCC 和對照組織中DHCR7 mRNA 表達森林圖

圖2 SMD 結(jié)果的檢驗漏斗圖

2.2 HCC和非癌肝組織DHCR7 mRNA表達的sROC曲線結(jié)果

經(jīng)過進一步計算，總特異性（specificity）、總敏感性（sensitivity）分別為0.81（95%CI：0.74～0.87）與0.60（95%CI：0.50 ～0.65）（圖3）。最后，基于各數(shù)據(jù)的綜合計算，sROC 曲線擬合AUC 為0.77（95%CI：0.73 ～0.81）（圖4），這進一步證實了HCC 組織中DHCR7 mRNA 表達的上調(diào)。因此，DHCR7 具有鑒別HCC 的潛力。

圖3 HCC 組織DHCR7 過表達的判別結(jié)果

圖4 具有預(yù)測與置信區(qū)間的集成工作特性曲線（sROC）

2.3 DHCR7 蛋白在HCC 中表達趨勢

DHCR7 蛋白在細胞質(zhì)及細胞膜上表現(xiàn)為陽性信號。如圖5 所示，HPA 數(shù)據(jù)庫中DHCR7 蛋白在健康肝臟切片中弱染色，但在HCC 中強染色，說明DHCR7 在HCC 中的表達顯著高于健康肝臟（P＜0.05）。AUC 值為0.77，進一步支持了DHCR7 蛋白在HCC 組織中明顯過表達的發(fā)現(xiàn)（圖4）。

圖5 HCC 與非癌肝組織中DHCR7 蛋白表達水平的免疫組化圖

3 結(jié)論與討論

本研究第一次探索了DHCR7 mRNA 及蛋白在HCC 中的表達情況，并對其進行了相關(guān)的拓展研究。通過來自TCGA、GEO、GTEx、ArrayExpress 等權(quán)威數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)集、RNA 測序結(jié)果以及組織芯片數(shù)據(jù)等途徑，揭示了HCC 組織中DHCR7 的mRNA 轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯水平的上調(diào)，涵蓋了廣泛的種族和人群。

本次研究最主要的發(fā)現(xiàn)是DHCR7 在HCC 中過度表達，這意味著DHCR7 可能是HCC 潛在的靶向標志物，為未來HCC 的診斷、治療、預(yù)后預(yù)測等臨床需求指出一條新的方向。

近年來，在某些實體腫瘤中，DHCR7 的高表達已經(jīng)引起一些學者的注意。例如，有研究者稱，DHCR7 在宮頸癌（Cervical Carcinoma，CCA）中的過表達可能導(dǎo)致CCA 的低生存率[11]。還有學者發(fā)現(xiàn)，DHCR7 作為一個獨立的危險因素在膀胱癌中表達上調(diào)，并且與其分級和分期相關(guān)，最終可導(dǎo)致預(yù)后不良[12]。此外，有研究結(jié)果表明，由于DHCR7 基因?qū)ρh(huán)維生素D 水平的影響，多態(tài)性可能與甲狀腺癌風險增加有關(guān)[13]。而在對胃癌的研究中，也有學者稱DHCR7 基因的突變抑制了胃癌細胞的惡性行為，并通過抑制細胞膽固醇生物合成誘導(dǎo)凋亡[14]。作為脂質(zhì)代謝相關(guān)基因，DHCR7 也被發(fā)現(xiàn)影響著頭頸部鱗狀細胞癌的臨床特征，譬如分期、性別和病理分期等[15]。即便在未知部位原發(fā)癌（Cancer of Unknown Primary，CUP）的全基因組關(guān)聯(lián)研究中，也發(fā)現(xiàn)DHCR7 作為編碼膽固醇和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）合成中的關(guān)鍵酶與CUP 的肝轉(zhuǎn)移有一定關(guān)聯(lián)[16]。這說明DHCR7 的表達異常，可能在多種腫瘤的進展途徑中責任重大。

當然，HCC 作為全球發(fā)病率最高的癌癥之一，研究其與DHCR7 相關(guān)性的文章近年也不斷涌現(xiàn)，然而筆者發(fā)現(xiàn)，這些文章多是從膽固醇或維生素D 的代謝角度對肝癌的發(fā)生進行研究與分析，繼而發(fā)現(xiàn)DHCR7 作為膽固醇與維生素D 代謝過程中的關(guān)鍵基因/酶與HCC 甚至肝臟疾病的關(guān)聯(lián)性，且涵蓋了HCC 從發(fā)生、發(fā)展到預(yù)后的各個臨床階段的研究。譬如，在發(fā)病風險方面，有研究通過脂代謝相關(guān)基因分析發(fā)現(xiàn)了維生素D 在HCV 相關(guān)性HCC 的發(fā)病風險中存在一定的作用，而DHCR7 在其中的作用不可忽視[9]。在基因調(diào)節(jié)方面，有研究通過功能富集分析發(fā)現(xiàn)，在由JFH-1 誘導(dǎo)出的丙型肝炎發(fā)展而成的HCC中，下調(diào)共調(diào)控基因與膽固醇代謝相關(guān)，DHCR7 正是其確定的中樞基因之一，并可能成為JFH-1 相關(guān)的HCC 的候選生物標志物[10]。在肝臟疾病的預(yù)后方面，有研究稱，維生素D 代謝和VDR（維生素D 受體）-TGFβ-1（轉(zhuǎn)化生長因子β-1）-SMAD3（Sma和Mad 相關(guān)蛋白）相互作用的潛在遺傳變異可能影響丙型肝炎的進展，導(dǎo)致肝臟失代償、纖維化、惡化、HCC 發(fā)展和肝臟死亡等不良預(yù)后，從而進一步發(fā)現(xiàn)，DHCR7 作為維生素D 代謝中的關(guān)鍵酶，4 個單核苷酸多態(tài)性（SNPs）與肝臟失代償相關(guān)的結(jié)局有關(guān)，而肝臟失代償與肝癌的發(fā)生密不可分[17]。

與眾不同的是，本研究直接關(guān)注了DHCR7 與HCC 的關(guān)系，直接提供了DHCR7 在HCC 中存在過表達的證據(jù)，發(fā)現(xiàn)DHCR7 可能是導(dǎo)致HCC 發(fā)生的獨立因素。然而，由于本研究還未在HCC 患者的血液中檢測DHCR7 水平，其在HCC 的早期篩查中的作用仍須更進一步的研究。同時，DHCR7 的高表達也導(dǎo)致一些HCC 患者的預(yù)后較差，但這一發(fā)現(xiàn)需要未來用更多的樣本進行驗證?？傊?，這是第一項直接評估DHCR7 在HCC 中可能的臨床價值的研究。

至于DHCR7 在誘導(dǎo)HCC 發(fā)生中發(fā)揮作用的主要機制，現(xiàn)有的研究表明，在基因相關(guān)性研究和功能與途徑富集分析中，均找到了DHCR7 與HCV 誘導(dǎo)的HCC 具有相關(guān)性的證據(jù)[9-10]。本文直接揭示了DHCR7 在HCC 組織中mRNA 水平的升高和蛋白質(zhì)的過表達，為DHCR7 與HCC 相關(guān)性研究中的證據(jù)鏈補充了重要的一環(huán)。

有趣的是，在過去發(fā)現(xiàn)DHCR7 與HCC 的發(fā)病風險、發(fā)展及預(yù)后等臨床表現(xiàn)存在相關(guān)性的文章中，被研究的對象多為HCV 誘導(dǎo)發(fā)生的HCC，即HCC 的原發(fā)疾病被限定為丙型肝炎，而DHCR7 參與調(diào)節(jié)HCC發(fā)生發(fā)展的方式是作為維生素D/膽固醇代謝的關(guān)鍵基因[9-10,17]。然而在另一些研究對象不限于HCV 相關(guān)性HCC（如酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝病、乙肝病毒等導(dǎo)致的HCC）的文章中，也得出了異常膽固醇/維生素D 代謝影響HCC 發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸等方面的結(jié)論[3,18-19]。與此同時，本文發(fā)現(xiàn)，在不同原因?qū)е碌腍CC 中，都能發(fā)現(xiàn)DHCR7 的過表達。因此，通過合理推測，DHCR7 作為調(diào)節(jié)膽固醇/維生素D 的關(guān)鍵基因?qū)τ贖CC 發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)作用，廣泛存在于不同原因?qū)е碌腍CC 中。未來對于DHCR7在HCC 中分子機制的研究，不應(yīng)當將研究對象局限于HCV 相關(guān)性HCC，而應(yīng)當對不同肝臟原發(fā)病導(dǎo)致的HCC 進行廣泛研究，尤其是增加對非HCV 相關(guān)性HCC 的研究，以找到其中共同的分子機制以及幾者之間的不同之處，豐富DHCR7 在HCC 中的相關(guān)性研究，發(fā)掘DHCR7 作為HCC 治療靶點的潛力。

本研究不可避免地有其局限性。雖然獲得了DHCR7 在HCC 過表達的mRNA 和蛋白組學證據(jù)，然而DHCR7 的生物學功能和相關(guān)的生物分子途徑尚未通過各種對比實驗在HCC 中得到驗證。未來，必將需要更完整、更具體的工作來解釋DHCR7 在HCC 的確切作用機制。