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      肝細胞癌中7-脫氫膽固醇還原酶表達的臨床意義

      2023-12-18 13:09:00莫偉嘉張楚月韋京妤張觀蘭唐宇星殷彬烔黃潔莊羅嘉嫄蔣洪棉陳罡吳華裕
      生物化工 2023年5期
      關(guān)鍵詞:膽固醇肝臟維生素

      莫偉嘉,張楚月,韋京妤,張觀蘭,唐宇星,殷彬烔,黃潔莊,羅嘉嫄,蔣洪棉,陳罡,吳華裕

      (1.廣西醫(yī)科大學 第一附屬醫(yī)院病理科,廣西南寧 530021;2.廣西醫(yī)科大學 第五附屬醫(yī)院/南寧市第一人民醫(yī)院病理科,廣西南寧 530021;3.廣西醫(yī)科大學 第五附屬醫(yī)院/南寧市第一人民醫(yī)院醫(yī)學實驗中心,廣西南寧 530021)

      膽固醇作為構(gòu)成細胞內(nèi)各種膜結(jié)構(gòu)的不可或缺的重要物質(zhì),對真核生物細胞的生長發(fā)育和行為調(diào)控具有重要的作用[1]。維持膽固醇在組織細胞內(nèi)的動態(tài)平衡對于細胞正常生長發(fā)育極為重要[2],膽固醇在細胞內(nèi)失衡可致使疾病的發(fā)生,如在肝炎向肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)發(fā)展的病理過程中,膽固醇的異常堆積有很大的推動作用[3]。有不少學者從不同的角度,描述了膽固醇對HCC 生物學行為的影響[4-6]。因此,發(fā)現(xiàn)膽固醇的潛在調(diào)節(jié)機制對于降低HCC 的發(fā)病風險、改變HCC 的生物學行為、改善HCC 的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后、尋求有效的靶向干預(yù)措施等具有重要的臨床意義。

      在膽固醇的合成過程中,作為關(guān)鍵酶之一,7-脫氫膽固醇還原酶(7-Dehydrocholesterol Reductase,DHCR7)扮演著重要的角色[7-8]。DHCR7 可將維生素D 前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為膽固醇,以發(fā)揮調(diào)節(jié)膽固醇的作用。同時,有遺傳分析研究表明,25-羥維生素D(25-[OH]-D3)血清水平與丙型肝炎病毒(HCV)相關(guān)性HCC 具有相關(guān)性,而DHCR7 是調(diào)節(jié)25-[OH]-D3血清水平的決定性因素[9]。有分子機制研究表明,在(基因型2a)HCV 通過人肝癌細胞Huh7 中誘導(dǎo)出的人HCC 中,DHCR7 同時作為中樞基因和中樞節(jié)點存在,可能作為一種潛在的生物標志物對日本暴發(fā)性肝炎病毒(JFH-1)感染導(dǎo)致的HCC 的發(fā)生發(fā)展起到重要作用[10]。但如今還未見到探索DHCR7 mRNA 及蛋白在HCC 細胞中表達水平的相關(guān)報道,故本研究擬整合基因芯片、RNA 測序以及組織芯片數(shù)據(jù),探索DHCR7 在HCC 的表達意義。

      1 材料與方法

      1.1 臨床數(shù)據(jù)收集

      HCC基因芯片及測序數(shù)據(jù)來自ArrayExpress(https://www.ebi.ac.uk/biostudies/arrayexpress)、Gene Expression Omnibus(GEO,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)、Genotype-Tissue Expression(GTEx,https://www.gtexportal.org/home/index.html) 和The Cancer Genome Atlas Program(TCGA,https://www.cancer.gov/ccg/research/genomesequencing/tcga)。納入的公共隊列樣本數(shù)據(jù)須滿足以下條件:(1)研究對象為智人;(2)公共隊列數(shù)據(jù)需包含HCC 和正常肝臟組織;(3)樣本為組織層次;(4)數(shù)據(jù)集中須包含DHCR7 的表達數(shù)據(jù);(5)公共隊列數(shù)據(jù)樣本不受任何物理、化學或其他因素的影響。排除原則為:(1)動物標本;(2)無DHCR7 表達值的數(shù)據(jù);(3)重復(fù)標本。

      1.2 DHCR7 mRNA 在HCC 組織中的表達情況

      使用STATA 14.0 軟件評估DHCR7 mRNA 的標準化平均差值(Standardized Mean Difference,SMD)。I2為入組研究之間的異質(zhì)性,I2>50%或P<0.05稱為高異質(zhì)性,采用隨機效應(yīng)模型;其余采用固定效應(yīng)模型。為研究DHCR7 對HCC 組織的鑒別能力,計算總體受試者工作特征曲線(summary Receiver Operating Characteristics,sROC),得到曲線下的總面積(Area Under the Curve,AUC),并計算敏感性和特異性。Egger’s 與Begg’s 檢驗用于判別合并結(jié)果是否具有發(fā)表偏倚,P≥0.05 提示結(jié)果不具有顯著的發(fā)表偏倚。

      1.3 DHCR7 蛋白在HCC 中的表達水平

      利用人類蛋白質(zhì)圖譜(The Human Protein Atlas,THPA)獲取DHCR7 蛋白在HCC 和非癌肝組織的表達情況,并進行比較。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 DHCR7 在HCC 及非癌肝對照組織中的mRNA表達水平

      最終從上述數(shù)據(jù)庫中獲得了7 384 份樣本,包括3 941 份HCC 樣本和3 443 份對照樣本。為明確DHCR7 mRNA 在HCC 中的表達水平,整合納入數(shù)據(jù)集計算DHCR7 mRNA 表達量的SMD 值。由于I2>75%且P<0.01,研究采取隨機效應(yīng)模型,計算得出SMD 為0.35,95%置信區(qū)間(95%CI)為0.20 ~0.51(圖1)。SMD 結(jié)果的Egger’s 檢驗P值為0.521,Begg’s 檢驗P值為0.400,均顯示P>0.05,圖像也顯示了一種對稱的形式,即總體上并不存在明顯的偏倚(圖2)。結(jié)果初步顯示,DHCR7 mRNA 表達在HCC 中顯著增多。

      圖1 HCC 和對照組織中DHCR7 mRNA 表達森林圖

      圖2 SMD 結(jié)果的檢驗漏斗圖

      2.2 HCC和非癌肝組織DHCR7 mRNA表達的sROC曲線結(jié)果

      經(jīng)過進一步計算,總特異性(specificity)、總敏感性(sensitivity)分別為0.81(95%CI:0.74~0.87)與0.60(95%CI:0.50 ~0.65)(圖3)。最后,基于各數(shù)據(jù)的綜合計算,sROC 曲線擬合AUC 為0.77(95%CI:0.73 ~0.81)(圖4),這進一步證實了HCC 組織中DHCR7 mRNA 表達的上調(diào)。因此,DHCR7 具有鑒別HCC 的潛力。

      圖3 HCC 組織DHCR7 過表達的判別結(jié)果

      圖4 具有預(yù)測與置信區(qū)間的集成工作特性曲線(sROC)

      2.3 DHCR7 蛋白在HCC 中表達趨勢

      DHCR7 蛋白在細胞質(zhì)及細胞膜上表現(xiàn)為陽性信號。如圖5 所示,HPA 數(shù)據(jù)庫中DHCR7 蛋白在健康肝臟切片中弱染色,但在HCC 中強染色,說明DHCR7 在HCC 中的表達顯著高于健康肝臟(P<0.05)。AUC 值為0.77,進一步支持了DHCR7 蛋白在HCC 組織中明顯過表達的發(fā)現(xiàn)(圖4)。

      圖5 HCC 與非癌肝組織中DHCR7 蛋白表達水平的免疫組化圖

      3 結(jié)論與討論

      本研究第一次探索了DHCR7 mRNA 及蛋白在HCC 中的表達情況,并對其進行了相關(guān)的拓展研究。通過來自TCGA、GEO、GTEx、ArrayExpress 等權(quán)威數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)集、RNA 測序結(jié)果以及組織芯片數(shù)據(jù)等途徑,揭示了HCC 組織中DHCR7 的mRNA 轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯水平的上調(diào),涵蓋了廣泛的種族和人群。

      本次研究最主要的發(fā)現(xiàn)是DHCR7 在HCC 中過度表達,這意味著DHCR7 可能是HCC 潛在的靶向標志物,為未來HCC 的診斷、治療、預(yù)后預(yù)測等臨床需求指出一條新的方向。

      近年來,在某些實體腫瘤中,DHCR7 的高表達已經(jīng)引起一些學者的注意。例如,有研究者稱,DHCR7 在宮頸癌(Cervical Carcinoma,CCA)中的過表達可能導(dǎo)致CCA 的低生存率[11]。還有學者發(fā)現(xiàn),DHCR7 作為一個獨立的危險因素在膀胱癌中表達上調(diào),并且與其分級和分期相關(guān),最終可導(dǎo)致預(yù)后不良[12]。此外,有研究結(jié)果表明,由于DHCR7 基因?qū)ρh(huán)維生素D 水平的影響,多態(tài)性可能與甲狀腺癌風險增加有關(guān)[13]。而在對胃癌的研究中,也有學者稱DHCR7 基因的突變抑制了胃癌細胞的惡性行為,并通過抑制細胞膽固醇生物合成誘導(dǎo)凋亡[14]。作為脂質(zhì)代謝相關(guān)基因,DHCR7 也被發(fā)現(xiàn)影響著頭頸部鱗狀細胞癌的臨床特征,譬如分期、性別和病理分期等[15]。即便在未知部位原發(fā)癌(Cancer of Unknown Primary,CUP)的全基因組關(guān)聯(lián)研究中,也發(fā)現(xiàn)DHCR7 作為編碼膽固醇和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)合成中的關(guān)鍵酶與CUP 的肝轉(zhuǎn)移有一定關(guān)聯(lián)[16]。這說明DHCR7 的表達異常,可能在多種腫瘤的進展途徑中責任重大。

      當然,HCC 作為全球發(fā)病率最高的癌癥之一,研究其與DHCR7 相關(guān)性的文章近年也不斷涌現(xiàn),然而筆者發(fā)現(xiàn),這些文章多是從膽固醇或維生素D 的代謝角度對肝癌的發(fā)生進行研究與分析,繼而發(fā)現(xiàn)DHCR7 作為膽固醇與維生素D 代謝過程中的關(guān)鍵基因/酶與HCC 甚至肝臟疾病的關(guān)聯(lián)性,且涵蓋了HCC 從發(fā)生、發(fā)展到預(yù)后的各個臨床階段的研究。譬如,在發(fā)病風險方面,有研究通過脂代謝相關(guān)基因分析發(fā)現(xiàn)了維生素D 在HCV 相關(guān)性HCC 的發(fā)病風險中存在一定的作用,而DHCR7 在其中的作用不可忽視[9]。在基因調(diào)節(jié)方面,有研究通過功能富集分析發(fā)現(xiàn),在由JFH-1 誘導(dǎo)出的丙型肝炎發(fā)展而成的HCC中,下調(diào)共調(diào)控基因與膽固醇代謝相關(guān),DHCR7 正是其確定的中樞基因之一,并可能成為JFH-1 相關(guān)的HCC 的候選生物標志物[10]。在肝臟疾病的預(yù)后方面,有研究稱,維生素D 代謝和VDR(維生素D 受體)-TGFβ-1(轉(zhuǎn)化生長因子β-1)-SMAD3(Sma和Mad 相關(guān)蛋白)相互作用的潛在遺傳變異可能影響丙型肝炎的進展,導(dǎo)致肝臟失代償、纖維化、惡化、HCC 發(fā)展和肝臟死亡等不良預(yù)后,從而進一步發(fā)現(xiàn),DHCR7 作為維生素D 代謝中的關(guān)鍵酶,4 個單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與肝臟失代償相關(guān)的結(jié)局有關(guān),而肝臟失代償與肝癌的發(fā)生密不可分[17]。

      與眾不同的是,本研究直接關(guān)注了DHCR7 與HCC 的關(guān)系,直接提供了DHCR7 在HCC 中存在過表達的證據(jù),發(fā)現(xiàn)DHCR7 可能是導(dǎo)致HCC 發(fā)生的獨立因素。然而,由于本研究還未在HCC 患者的血液中檢測DHCR7 水平,其在HCC 的早期篩查中的作用仍須更進一步的研究。同時,DHCR7 的高表達也導(dǎo)致一些HCC 患者的預(yù)后較差,但這一發(fā)現(xiàn)需要未來用更多的樣本進行驗證??傊?,這是第一項直接評估DHCR7 在HCC 中可能的臨床價值的研究。

      至于DHCR7 在誘導(dǎo)HCC 發(fā)生中發(fā)揮作用的主要機制,現(xiàn)有的研究表明,在基因相關(guān)性研究和功能與途徑富集分析中,均找到了DHCR7 與HCV 誘導(dǎo)的HCC 具有相關(guān)性的證據(jù)[9-10]。本文直接揭示了DHCR7 在HCC 組織中mRNA 水平的升高和蛋白質(zhì)的過表達,為DHCR7 與HCC 相關(guān)性研究中的證據(jù)鏈補充了重要的一環(huán)。

      有趣的是,在過去發(fā)現(xiàn)DHCR7 與HCC 的發(fā)病風險、發(fā)展及預(yù)后等臨床表現(xiàn)存在相關(guān)性的文章中,被研究的對象多為HCV 誘導(dǎo)發(fā)生的HCC,即HCC 的原發(fā)疾病被限定為丙型肝炎,而DHCR7 參與調(diào)節(jié)HCC發(fā)生發(fā)展的方式是作為維生素D/膽固醇代謝的關(guān)鍵基因[9-10,17]。然而在另一些研究對象不限于HCV 相關(guān)性HCC(如酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝病、乙肝病毒等導(dǎo)致的HCC)的文章中,也得出了異常膽固醇/維生素D 代謝影響HCC 發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸等方面的結(jié)論[3,18-19]。與此同時,本文發(fā)現(xiàn),在不同原因?qū)е碌腍CC 中,都能發(fā)現(xiàn)DHCR7 的過表達。因此,通過合理推測,DHCR7 作為調(diào)節(jié)膽固醇/維生素D 的關(guān)鍵基因?qū)τ贖CC 發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)作用,廣泛存在于不同原因?qū)е碌腍CC 中。未來對于DHCR7在HCC 中分子機制的研究,不應(yīng)當將研究對象局限于HCV 相關(guān)性HCC,而應(yīng)當對不同肝臟原發(fā)病導(dǎo)致的HCC 進行廣泛研究,尤其是增加對非HCV 相關(guān)性HCC 的研究,以找到其中共同的分子機制以及幾者之間的不同之處,豐富DHCR7 在HCC 中的相關(guān)性研究,發(fā)掘DHCR7 作為HCC 治療靶點的潛力。

      本研究不可避免地有其局限性。雖然獲得了DHCR7 在HCC 過表達的mRNA 和蛋白組學證據(jù),然而DHCR7 的生物學功能和相關(guān)的生物分子途徑尚未通過各種對比實驗在HCC 中得到驗證。未來,必將需要更完整、更具體的工作來解釋DHCR7 在HCC 的確切作用機制。

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