茯茶素B 通過下調(diào)PLK1 抑制宮頸癌細胞增殖

余松林，劉緣，甘琳，歐陽，胡治遠

（湖南城市學(xué)院 黑茶金花湖南省重點實驗室，湖南益陽 413000）

宮頸癌是一種發(fā)病率極高的女性腫瘤疾病。每年全球約有55.51 萬人患宮頸癌，其中超過50%的人因治療無效而死亡[1]。在我國，每年因?qū)m頸癌而死亡的人數(shù)多達5 萬人，約占全球?qū)m頸癌死亡人數(shù)的1/6[2]。因環(huán)境等因素的影響，宮頸癌發(fā)病率持續(xù)走高，患病人群日趨年輕化[3]。因此，對宮頸癌疾病的預(yù)防、治療仍然是一項非常艱巨的任務(wù)。

茯茶素是茯磚茶中新發(fā)現(xiàn)的一類多酚衍生物，已有文獻表明其具有廣泛的生物活性，包括抑菌、抗氧化、減肥以及抗癌活性[4]。羅珍美等[5]以茯磚茶為原料，利用丙酮、石油醚、三氯甲烷、正丁醇等有機試劑萃取，隨后分別通過硅膠、聚酰胺、Sephadex LH-20葡聚糖凝膠、反相硅膠以及小孔樹脂（MCI）等多種層析方法對茯磚茶正丁醇萃取部分進行分離純化，制備得到茯茶素B，其分子式為C13H15O6，分子量266.09，結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

圖1 茯茶素B 的結(jié)構(gòu)圖

1 材料與方法

1.1 細胞來源

人宮頸癌細胞Hela 由中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院陳小平教授饋贈。

1.2 試劑與儀器

LDZX-75KBS 立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1FD 超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LED1152 倒置顯微鏡，德國徠卡公司；E191IR 二氧化碳培養(yǎng)箱，美國SIM 公司；DT5-2B 低速離心機，北京新時代北利醫(yī)療器械有限公司；Multiskan GO 酶標儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；LightCycler 480 實時熒光定量PCR，瑞士Roche公司。

DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素、鏈霉素，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Cell Counting Kit-8、血球計數(shù)板、臺盼藍染液、TBST 緩沖液、胰酶、無菌PBS、脫脂牛奶、生理鹽水，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；順鉑，德州德藥制藥有限公司；超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒、蛋白酶抑制劑、RIPA 裂解緩沖液，上海源葉生物科技有限公司；BCA 試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RNA Fast 200 總RNA 極速抽提試劑盒，上海飛捷生物技術(shù)有限公司；HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR、SYBR Green PCR Master Mix（2×），南京諾唯贊生物科技股份有限公司；SDS-PAGE，北京普利萊基因技術(shù)有限公司；PLK1 Rabbit mAb（A21082）、HRP Goat Anti-rabbit IgG（AS014）、ECL 檢測試劑盒，武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 材料預(yù)處理

茯磚茶由黑茶金花湖南省重點實驗室制得，以茯磚茶為原料提取茯茶素B 按照文獻報道進行[5]。DF-10 培養(yǎng)基：在DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入終濃度為10%的FBS、終濃度為100 U/mL 的青霉素以及終濃度為0.1 mg/mL 的鏈霉素。

1.3.2 Hela 細胞毒性檢測

抑制腫瘤細胞異常增殖是評價抗癌藥物療效的重要指標[6]，因而可以通過探究茯茶素B 溶液對宮頸癌細胞增殖的影響來判斷其是否有可能夠成為治療宮頸癌的藥物。Hela 細胞在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為DF-10 完全培養(yǎng)基。待Hela 細胞生長至對數(shù)生長期，消化細胞并調(diào)整濃度為1.0×105cells/mL，按每孔0.1 mL 接種到96 孔培養(yǎng)板中，設(shè)置無細胞的空白對照。采用CCK-8 試劑盒檢測茯茶素B對Hela細胞活性的影響，按照試劑盒說明書操作。茯茶素B 終濃度分別為0 μg/mL（只加生理鹽水，作為陰性對照）、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL和300 μg/mL。每組3個復(fù)孔。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育2 h。每孔加入10 μL CCK-8試劑，混勻后培養(yǎng)2 h。用酶標儀測定450 nm 吸光度，按公式（1）計算細胞活力。

式中，Ai為50 ～300 μg/mL 茯茶素B處理組吸光度值，A0為空白對照組吸光度值，Ab為陰性對照組吸光度值。

1.3.3 Hela 細胞增殖能力檢測

取35 mm 培養(yǎng)皿，每皿接種2 mL 濃度為1×105cells/mL 的HeLa 細胞。置于細胞培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h，細胞完全貼壁。分別加入終濃度為40 μg/mL順鉑（陽性對照），終濃度為50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL 的茯茶素B（實驗組），以及生理鹽水（陰性對照）。各組設(shè)置9 個重復(fù)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 后，各組分別取3 皿細胞消化并用血球計數(shù)板計數(shù)。具體操作：吸棄上清，無菌PBS洗一遍，加入200 μL 胰酶，37 ℃消化8 min。加入300 μL DF-10 終止消化，吹打為單細胞后全部轉(zhuǎn)移至1.5 mL 無菌EP 管，取20 μL 細胞懸液加入等體積0.45%的臺盼藍染液進行染色，最后吸取10 μL 染色的細胞懸液至干凈血球計數(shù)板中進行計數(shù)。

1.3.4 PLK1 mRNA 水平檢測

細胞總RNA 提取按照試劑盒說明書進行。取200 ng RNA 按照HiScript III All-in-one RT SuperMix說明書合成cDNA。用12 ng cDNA 為qPCR 反應(yīng)模板，引物序列如表（1）所示。反應(yīng)體系25 μL，包括2×SYBR MasterMix 10 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，cDNA 模板（12 ng/μL）1 μL，DEPC 水8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，3 min；95 ℃，15 s 及60 ℃，40 s 反應(yīng)40 個循環(huán)；溶解曲線95 ℃，15 s；60 ℃，15 s；95 ℃，15 s。用2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR 引物體系

1.3.5 PLK1 蛋白表達檢測

取對數(shù)生長期的Hela 細胞，用不同濃度茯茶素B（0 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL）處理48 h。RIPA 裂解緩沖液與蛋白酶抑制劑按照100 ∶1 的體積比混合，在冰上裂解30 min，以12 000 r/min 離心10 min，獲得細胞總蛋白。采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白質(zhì)樣品通過SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)膜，再用新鮮的5%脫脂牛奶在室溫下封閉2 h。將膜與一抗（PLK1 Rabbit mAb，A21082）在1 ∶2 000 稀釋比例下4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜5 次，每次8 min，室溫下進行二抗（HRP Goat Antirabbit IgG，AS014）孵育，稀釋度為1∶10 000，孵育2 h。采用ECL 檢測試劑盒進行顯影，內(nèi)參為β-actin。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析均采用GraphPad Prism 8.0.2 進行處理，所有結(jié)果以平均數(shù)±標準差表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），PLK1 表達水平與腫瘤抑制率相關(guān)性采用Spearman 法分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 茯茶素B 對Hela 細胞活性的影響

如圖2 所示，宮頸癌細胞的活性隨著茯茶素B 濃度的增加而逐漸減小，即抑癌作用隨著茯茶素B 濃度的增強而不斷增加，呈現(xiàn)出一定的量-效關(guān)系。對宮頸癌細胞活性抑制作用最強的茯茶素B 濃度為300 μg/mL，若繼續(xù)提高藥物濃度，對癌細胞的作用效果可能更強，但藥物負荷過高可能對機體肝腎功能產(chǎn)生損害[7]。因此，茯茶素B 對抑制腫瘤生長的最佳濃度需要通過動物實驗來加以優(yōu)化。

圖2 茯茶素B 濃度對Hela 細胞活性的影響

2.2 茯茶素B 對Hela 細胞增殖的影響

由圖3 可知，未加藥物的空白對照組Hela 細胞數(shù)隨培養(yǎng)時間延長而不斷增多，可以排除細胞自身原因造成的假抑制現(xiàn)象。而經(jīng)茯茶素B 作用過后的宮頸癌細胞個數(shù)與加藥時間呈負相關(guān)：隨著作用時間的延長，Hela 細胞個數(shù)不斷減少，即細胞受到藥物的抑制作用越強烈。

圖3 茯茶素B 加藥時間對Hela 細胞增殖的影響

為了探討茯茶素B 抑制宮頸癌細胞增殖可能的機制，對不同濃度茯茶素B 處理的Hela 細胞提取總RNA和總蛋白。根據(jù)前期的文獻，Polo樣激酶1（PLK1）是調(diào)控細胞周期的一個關(guān)鍵激酶，也是很多抗癌藥物的作用靶點之一，因此對茯茶素B 處理前后癌細胞中PLK1 的mRNA（圖4）和蛋白相對表達水平（圖5）進行了分析。結(jié)果顯示：茯茶素B 能夠抑制Hela 細胞中PLK1 的mRNA 和蛋白表達，并且這種下調(diào)作用均呈現(xiàn)出濃度依賴性。

圖4 茯茶素B 對Hela 細胞PLK1 mRNA 表達水平的影響

圖5 茯茶素B 對Hela 細胞PLK1 蛋白表達水平的影響

為了直接分析茯茶素抑制效力與PLK1 蛋白表達量之間的相關(guān)性，對其進行相關(guān)性分析，顯示茯茶素B 對Hela 細胞的抑制率與癌細胞中PLK1 表達水平呈顯著的負相關(guān)，如圖6 所示。因此，茯茶素B 很可能通過下調(diào)細胞周期蛋白PLK1 的表達從而限制癌細胞的擴增，但詳細的分子機制以及調(diào)控通路還有待未來深入研究。

圖6 茯茶素B 對Hela 細胞抑制率與PLK1 蛋白表達水平相關(guān)性分析

3 結(jié)論與展望

3.1 結(jié)論

茯茶素B 對宮頸癌細胞的抑制作用具有明顯的量-效關(guān)系和時-效關(guān)系，且茯茶素B 能夠以劑量依賴的方式下調(diào)Hela 細胞中PLK1 的蛋白表達水平，這可能是其抑制腫瘤增殖的一種作用途徑，但具體的機制還有待闡明。

3.2 展望

當(dāng)前放療、手術(shù)以及化療仍然是癌癥中最為常見的幾種治療手段[8]。但是在治療過程中，化療藥物對腫瘤細胞的針對性作用較弱，對正常細胞也會產(chǎn)生一定的傷害?；熕幬镌谑褂眠^程中，還會產(chǎn)生許多的副作用，對人體的傷害比較大。紫杉醇、長春新堿等一系列天然抗腫瘤藥物在臨床醫(yī)學(xué)中的廣泛應(yīng)用，極大地刺激了廣大學(xué)者對這一領(lǐng)域的研究興趣[9]。這也使得對天然抗腫瘤藥物的尋找與研究變得更加深入。本文從黑茶的健康功效出發(fā)，針對茯磚茶中分離的天然化合物功能開展研究，初步證實茯茶素B 對宮頸癌細胞具有抑制作用。利用茯茶素B 作為治療宮頸癌等惡性腫瘤的輔助用藥，不僅易于獲得，而且使用安全、毒副作用小，將茯茶素B 開發(fā)成抗腫瘤的藥物具有較好的前景[10]。