UPLC-MS/MS 法同時測定心脈通膠囊中5 種皂苷的含量

周宇星，肖小武，付輝政，彭常春，易耀江，梁國嬪，潘蕾*

（1.江西省藥品檢查員中心，江西南昌 330029，2.江西省藥品檢驗檢測研究院，江西南昌 330029；3.江西濟(jì)民可信藥業(yè)有限公司，江西宜春 336000）

心脈通膠囊具有通脈養(yǎng)心、降壓降脂、活血化瘀的功效，臨床上主要用于高血壓、高脂血癥等，處方是由牛膝、當(dāng)歸、丹參、粉葛、鉤藤、毛冬青、槐米、決明子、三七、夏枯草十味藥組成[1-2]，經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局官網(wǎng)查詢，涉及江西濟(jì)民可信藥業(yè)有限公司和貴州益佰制藥股份有限公司兩家生產(chǎn)企業(yè)。心脈通膠囊中三七為原粉入藥。三七為五加科植物三七（Panax notoginseng）的干燥根和根莖，在保護(hù)心血管系統(tǒng)方面有顯著的藥理作用[3]，如以三七以及三七總皂苷提取物的三七通舒膠囊、血塞通膠囊和注射液[4-6]等已成為治療心腦血管疾病等領(lǐng)域一線中藥制劑?，F(xiàn)代研究表明，三七含有皂苷類、黃酮類、甾醇類、氨基酸等多種化學(xué)成分，其中皂苷類化合物是三七的主要藥效成分[7]?！吨袊幍洹?020 版也均以皂苷類化合物為主要質(zhì)控指標(biāo)對三七藥材、三七提取物以及含三七藥味的成方制劑進(jìn)行質(zhì)量控制[8]。目前對心脈通膠囊的質(zhì)量控制技術(shù)研究報道主要集中在葛根、槐米以及丹參[9-11]等方面，而文獻(xiàn)報道采用HPLC-ELSD 法測定3 種皂苷含量的心脈通軟膠囊也僅由三七、山楂葉和川芎處方組成，而非當(dāng)歸等十味藥材組成的心脈通膠囊[12]。因此，本試驗參考相關(guān)研究[13-15]采用UPLC-MS/MS 技術(shù)建立了同時測定心脈通膠囊中三七皂苷R1以及人參皂苷Re、Rg1、Rb1、Rd 共計5 種皂苷的含量測定方法，此方法可為心脈通膠囊的質(zhì)量控制和評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1290 Ⅱ-6470 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，配備MassHunter 色譜工作站，美國Agilent 公司；BSA 124S-CW 電子天平，德國Sartorius 公司。

人參皂苷Re 對照品，批號：111754-202028，純度以93.9%計，中國食品藥品檢定研究院；人參皂苷Rg1對照品，批號：110703-201933，純度以94.3%計，中國食品藥品檢定研究院；三七皂苷R1對照品，批號：110745-201921，純度以100%計，中國食品藥品檢定研究院；人參皂苷Rd 對照品，批號：111818-202104，純度以100%計，中國食品藥品檢定研究院；人參皂苷Rb1對照品，批號：111704-202028，純度以93.1%計，中國食品藥品檢定研究院。

市售心脈通膠囊2 個生產(chǎn)廠家16 批樣品，樣品S1～S13 為江西濟(jì)民可信藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號分別 為210303、210304、210305、210201、210202、210203、210204、210301、210302、210503、210504、210701 和210702，規(guī)格0.25 g/ 粒；樣品S14～S16 為貴州益佰制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號分別為200721、200614、200808，規(guī)格0.48 g/粒。陰性對照樣品為心脈通按處方缺三七同法制成，由江西濟(jì)民可信藥業(yè)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱為Waters Acquity BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），以0.1%甲酸水溶液為流動相B，甲醇為流動相A，按表1 進(jìn)行梯度洗脫；進(jìn)樣量3 μL，柱溫25 ℃，流速0.3 mL/min；ESI 離子源，采用正離子多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）監(jiān)測模式，質(zhì)譜采集參數(shù)見表2[16]。

表1 流動相洗脫程序

表2 離子對和質(zhì)譜檢測參數(shù)

1.2.2 溶液的配制

1.2.2.1 對照品儲備溶液的制備

分別精密稱取R111.96 mg、Re 15.76 mg、Rg112.30 mg、Rb113.56 mg 及Rd 10.72 mg，分別置100 mL、100 mL、100 mL、50 mL 及100 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻；然后分別精密吸取上述溶液各10 mL，分別置于100 mL 容量瓶中，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。

1.2.2.2 供試品溶液的制備

取樣品中的內(nèi)容物約1.0 g，精密稱定，轉(zhuǎn)入具塞錐形瓶，加入甲醇50 mL 后蓋緊塞子，稱量。在60 ℃下回流120 min，冷卻至室溫，再次稱量，用甲醇補(bǔ)足減失的量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液1 mL 置100 mL 容量瓶中加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.3 線性關(guān)系的考察

用移液管分別取“1.2.2.1”項下的對照品儲備液0.05 mL、0.25 mL、0.25 mL、0.50 mL、2.50 mL，分別置100 mL、100 mL、50 mL、50 mL、100 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“1.2.1”項下色譜、質(zhì)譜條件測定峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 專屬性實驗

精密量取“1.2.2.1”項下的對照品儲備液0.25 mL置50 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液；取陰性樣品按“1.2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液；分別取供試品溶液（S1）、對照品溶液、陰性對照溶液，按“1.2.1”項下條件進(jìn)行測定。

1.2.5 精密度試驗

分別取“2.4”項下的對照品溶液、陰性樣品溶液及供試品溶液按“1.2.1”項下的色譜、質(zhì)譜條件，重復(fù)實驗6 次。

1.2.6 準(zhǔn)確度

采用加樣回收試驗，精密稱取已知含量的本品（S1）0.5 g，按相對于本品80%、100%、120%的含量比例精密添加R1、Re、Rg1、Rb1及Rd 混合對照品溶液，按“1.2.2.2”項下制備溶液，并照“1.2.1”項下條件測定，計算回收率。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗

取樣品（S1），按“1.2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，室溫下放置，分別在0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h 取樣，按“1.2.1”項下的色譜質(zhì)譜條件測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性

各成分在各自濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，見表3。

表3 回歸方程與線性范圍

2.2 專屬性

比較供試品溶液色譜及對照品色譜，陰性對照樣品中其他成分對目標(biāo)物質(zhì)峰無干擾，見圖1 和圖2。

圖1 5 種人參皂苷的MRM TIC 圖

圖2 5 種皂苷的MRM 圖

2.3 精密度

三七皂苷R1的峰面積RSD為2.3%、人參皂苷Re 的峰面積RSD為1.9%、Rg1的峰面積RSD為2.1%、Rb1的峰面積RSD為1.7%、Rd 的峰面積RSD為1.9%，表明儀器精密度良好。

2.4 準(zhǔn)確度

如表4 所示，R1平均回收率為96.34%、Re 平均回收率為98.05%、Rg1平均回收率為97.29%、Rb1平均回收率95.94%、Rd 的回收率為97.82%，RSD分別為2.97%、2.67%、2.76%、2.26%及2.54%，方法準(zhǔn)確度良好。

表4 樣品5 種皂苷加樣回收率

2.5 穩(wěn)定性

樣品配制24 h 內(nèi)，R1的峰面積RSD為1.6%、Re 的峰面積RSD為0.9%、Rg1的峰面積RSD為1.1%、Rb1的峰面積RSD為1.7%、Rd 的峰面積RSD為1.2%，表明樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 實際樣品測定

按上述擬定的方法，對收集的樣品中5 個皂苷含量進(jìn)行測定，結(jié)果見表5。

表5 心脈通膠囊中5 個皂苷成分的含量測定結(jié)果（n=4）

3 結(jié)論與討論

3.1 檢測方法的選擇

本試驗最先考察了HPLC 的203 nm 低波長檢測方法，但因心脈通膠囊中基質(zhì)復(fù)雜，加之三七占比很低、低波長處檢測基線背景燈存在較大的干擾，故本試驗采用靈敏度高、專屬性強(qiáng)的LC-MS/MS 測定方法。

3.2 測定組分的選擇

《中國藥典》2020 版一部對三七以人參皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1三個組分來控制，三七總皂苷以三七皂苷R1及人參皂苷Re、Rg1、Rb1、Rd 五個組分來控制，且皂苷為三七的主要功效成分，故本試驗以三七皂苷R1和人參皂苷Re、Rg1、Rb1、Rd 五個組分為測定組分。

3.3 樣品結(jié)果分析

《中國藥典》2020 版一部規(guī)定三七中含人參皂苷Rg1、Rb1以及三七皂苷R1總量不得少于5.0%。心脈通膠囊中三七以原粉入藥，心脈通膠囊中三七的處方量僅以人參皂苷轉(zhuǎn)移率70%計算，暫擬定限度為本品含三七以人參皂苷Rb1、Rg1及三七皂苷R1總量計，每l g 不得少于186.0 μg。從樣品檢測結(jié)果上看，樣品均高于此限度，但不同批次間的含量存在差異，可能是三七投料或者生產(chǎn)工藝不同。

3.4 小結(jié)

本文考察了市場中兩個生產(chǎn)企業(yè)不同批次心脈通膠囊中三七皂苷R1和人參皂苷Re、Rg1、Rb1、Rd等5 個皂苷的含量，且通過設(shè)置擬定限度對收集的樣品進(jìn)行質(zhì)量評價。建立的超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法同時測定心脈通膠囊中三七皂苷R1和人參皂苷Re、Rg1、Rb1、Rd 等5 個皂苷的方法，操作簡單、重現(xiàn)性高、結(jié)果準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可考慮用于心脈通膠囊的質(zhì)量控制和評價。