內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白IRE1、PERK、ATF6 在舌鱗癌中的表達(dá)及其功能的生物信息學(xué)分析

張勇濤，李霞，李曉齊，買麗亞木古麗·阿布都克尤木，張貴程，齊魯

（新疆醫(yī)科大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830092）

舌鱗狀細(xì)胞癌（Tongue Squamous Cell Carcinoma，TSCC）是口腔中最常見(jiàn)的癌癥之一。近年來(lái)的研究表明，全球舌鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病率逐年上升，尤其在年輕人中發(fā)病率逐漸提高[1-2]。TSCC 極易發(fā)生早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率較高，且易復(fù)發(fā)，因此導(dǎo)致5 年生存率較低，僅有55%[3-4]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，學(xué)者們對(duì)TSCC 的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行了廣泛的研究，但其機(jī)制至今仍不明確[5]。尋求改善TSCC 治療效果的新型診斷和預(yù)后生物標(biāo)記物，有效靶向治療TSCC，提高患者的生存質(zhì)量，成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。

肌醇需求酶1（Inositol-Requiring Enzyme 1，IRE1）是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白，在其細(xì)胞質(zhì)區(qū)同時(shí)存在激酶和核糖核酸內(nèi)酶結(jié)構(gòu)域。IRE1 在哺乳動(dòng)物中有IRE1α 和IRE1β 兩種構(gòu)型[6]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，IRE1通過(guò)激酶和核糖核酸內(nèi)酶結(jié)構(gòu)域觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)（Unfolded Protein Response，UPR），引起細(xì)胞凋亡[7]。蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（Protein Kinase R-like Endoplasmic Reticulum Kinase，PERK）是一種跨膜蛋白，有N 端壓力傳感結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域。PERK 通過(guò)誘導(dǎo)CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/Enhancer-Binding Protein Homologous Protein，CHOP）表達(dá)從而起到調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用[8]。激活轉(zhuǎn)錄因子6（Activating Transcription Factor 6，ATF6）作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白，包括ATF6α 和ATF6β 兩種構(gòu)型，屬于環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族[9]。激活的ATF6 被轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體進(jìn)行修飾，修飾過(guò)后的ATF6 可誘導(dǎo)UPR 基因表達(dá)[10]。IRE1、PERK、ATF6 可在多種腫瘤組織中發(fā)揮作用，然而，目前其在舌鱗癌組織中的功能和作用機(jī)制尚未闡明。

本研究旨在通過(guò)生物信息學(xué)方法，明確IRE1、PERK、ATF6 在舌鱗癌中的表達(dá)特點(diǎn)及其與預(yù)后的關(guān)系，以期揭示在舌鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為進(jìn)一步探索舌鱗癌的治療方案奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集

基因表達(dá)綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)中24 名舌鱗癌患者的23 個(gè)腫瘤組織和73 個(gè)組織學(xué)正常邊緣及鄰近正常組織的數(shù)據(jù)測(cè)序結(jié)果為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。利用GraphPad Prism 9.0 軟件分析GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中IRE1、PERK、ATF6mRNA 的表達(dá)情況。

1.2 生存分析

利用Kaplan - Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取頭頸部鱗癌患者的臨床特征及生存資料，分別分析IRE1、PERK、ATF6 的表達(dá)與總生存期（Overall Survival，OS）和無(wú)進(jìn)展生存期（Recurrence-Free Survival，RFS）之間的關(guān)系，并繪制Kaplan - Meier 曲線。

1.3 功能分析

利用GeneMANIA 數(shù)據(jù)庫(kù)繪制IRE1、PERK、ATF6 相關(guān)的蛋白、遺傳相互作用通路和蛋白共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因功能富集分析，了解與IRE1、PERK、ATF6 相互作用的關(guān)鍵基因以及參與的細(xì)胞組分、生物過(guò)程、生物功能。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用VALUE 作為IRE1、PERK、ATF6 mRNA表達(dá)量度，表達(dá)量使用中位數(shù)（四分位間距）來(lái)表示。采用Kaplan - Meier生存曲線對(duì)IRE1、PERK、ATF6高、低表達(dá)組患者進(jìn)行生存比較，計(jì)算95%置信區(qū)間（CI）的風(fēng)險(xiǎn)比（HR）和Log- rankP值。統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 IRE1、PERK、ATF6 在舌鱗癌中的表達(dá)

IRE1、PERK、ATF6 在組織學(xué)正常邊緣組織及鄰近正常組織中位表達(dá)量分別為2.115 19（2.115 19～2.574 66）、9.613 41（8.124 92～11.904 7）、8.716 88（7.539 33～9.654 82），在舌鱗癌組織中分別為2.115 19（2.115 19～2.117 89）、9.390 81（8.997 47～10.881 40）、8.899 36（7.992 67～9.804 02），其中ATF6 在舌鱗癌組織中表達(dá)高于組織學(xué)正常邊緣組織及鄰近正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；IRE1、PERK在舌鱗癌組織中表達(dá)與組織學(xué)正常邊緣組織及鄰近正常組織的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。

圖1 IRE1、PERK、ATF6 在舌鱗癌及癌旁正常組織中表達(dá)

2.2 IRE1、PERK、ATF6 的表達(dá)與舌鱗癌預(yù)后關(guān)系

IRE1 高表達(dá)組患者OS 高于低表達(dá)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[風(fēng)險(xiǎn)比（HR）=0.73，95%置信區(qū)間（95%CI）=0.55～0.97，P=0.028]；但I(xiàn)RE1 的表達(dá)與頭頸部鱗癌的RFS 無(wú)明顯關(guān)系（HR=0.49，95%CI=0.2～1.17，P=0.1）。PERK 高表達(dá)組患者OS 高于低表達(dá)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HR=0.74，95%CI=0.56 ～ 0.98，P=0.033）；但PERK 的表達(dá)與頭頸部鱗癌的RFS 無(wú)明顯關(guān)系（HR=0.68，95%CI=0.32～1.43，P=0.3）。ATF6 高表達(dá)組患者OS 低于低表達(dá)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HR=1.45，95%CI=1.1～1.91，P=0.008 1）；但ATF6 的表達(dá)與頭頸部鱗癌的RFS 無(wú)明顯關(guān)系（HR=1.99，95%CI=0.92～4.33，P=0.076）（圖2）。

圖2 IRE1、PERK、ATF6 表達(dá)與舌鱗癌的預(yù)后的關(guān)系

2.3 IRE1、PERK、ATF6 相互蛋白作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)及功能分析

篩選出熱休克蛋白5（Heat Shock Protein 5，HSPA5）、含三聯(lián)基元3（Tripartite Motif-containing 3，TRIM3）、TAO 激酶3（TAO kinase 3，TAOK3）等20 個(gè)與IRE1 相互作用的蛋白質(zhì)，激活轉(zhuǎn)錄因子4（Activating Transcription Factor 4，ATF4）、轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(β)樣2（Transducin (Beta)-Like 2，TBL2）、真核翻譯啟動(dòng)因子2亞基1α（Eukaryotic Translation Initiation Factor 2 Subunit 1 Alpha，EIF2S1）等20 個(gè)與PERK 相互作用的蛋白質(zhì)，X-框結(jié)合蛋白1（X-Box Binding Protein 1，XBP1）、CREB 調(diào)控轉(zhuǎn)錄輔激活蛋白2（CREB Regulated Transcription Coactivator 2，CRTC2）、早老素1（Presenilin 1，PSEN1）等20 個(gè)與ATF6相互作用的蛋白質(zhì)。每種蛋白質(zhì)相互作用包括物理相互作用（Physical Interactions）、共表達(dá)（Co-expression）、相互預(yù)測(cè)（Predicted）、共定位（Co-localization）、遺傳相互作用（Genetic Interactions）、通路（Pathway）和共享蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域（Shared Protein Domains）（圖3）。

圖3 IRE1、PERK、ATF6 相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

2.4 GO 分析

IRE1 及其相關(guān)蛋白富集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞組分中，具有蛋白質(zhì)結(jié)合（protein binding）、蛋白磷酸酶結(jié)合（protein phosphatase binding）等分子功能，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（response to endoplasmic reticulum stress）、泛素依賴性ERAD 途徑（ubiquitindependent ERAD pathway）等生物學(xué)過(guò)程。PERK 及其相關(guān)蛋白富集于胞液、細(xì)胞膜等細(xì)胞組分中，具有翻譯起始因子活性（translation initiation factor activity）、RNA 結(jié)合（RNA binding）等分子功能，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)（endoplasmic reticulum unfolded protein response）、細(xì)胞對(duì)葡萄糖饑餓的反應(yīng)（cellular response to glucose starvation）等生物學(xué)過(guò)程。ATF6 及其相關(guān)蛋白富集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核等細(xì)胞組分中，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)序列特異性DNA 結(jié)合（transcription regulatory region sequence-specific DNA binding）、蛋白質(zhì)異二聚化活性（protein heterodimerization activity）等分子功能，參與RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控（positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)（endoplasmic reticulum unfolded protein response）等生物學(xué)過(guò)程（圖4）。

圖4 IRE1、PERK、ATF6 相關(guān)蛋白的GO 分析

3 討論

先前研究認(rèn)為[11-13]，作為在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生中的重要反應(yīng)，未折疊蛋白反應(yīng)（URP）存在三種感受器，即IRE1、PERK、ATF6。在腫瘤細(xì)胞中這三種感受器可參與到腫瘤干細(xì)胞的調(diào)節(jié)與分化、免疫監(jiān)視、腫瘤血管生成等方面，發(fā)揮著促進(jìn)或抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。因此，IRE1、PERK、ATF6 的靶向治療將有希望成為腫瘤治療的新選擇。

IRE1、PERK、ATF6 在多種腫瘤組織中的表達(dá)存在上調(diào)狀態(tài)。李會(huì)敏等用免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)結(jié)腸癌組織中IRE1α 表達(dá)水平顯著高于癌旁組織[14]；周琲等報(bào)道PERK 在肝癌組織中高表達(dá)，在癌旁組織幾乎無(wú)高表達(dá)[15]；OU 等報(bào)道ATF6 在口腔鱗癌組織中及口腔癌細(xì)胞系中表達(dá)異常增高[16]。本研究結(jié)果顯示，ATF6 在舌鱗癌組織中表達(dá)高于組織學(xué)正常邊緣組織及鄰近正常組織，而IRE1、PERK 在舌鱗癌組織中表達(dá)與組織學(xué)正常邊緣組織及鄰近正常組織的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析原因，可能與研究納入樣本數(shù)和組織異質(zhì)性相關(guān)，未來(lái)需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步分析。

IRE1、PERK、ATF6 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。KIM 等報(bào)道IRE1-JNK（c-Jun 氨基末端蛋白激酶，c-Jun N-Terminal Protein Kainse）-CHOP 信號(hào)通路可誘導(dǎo)胃癌發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡，而下調(diào)IRE1 可阻斷其自噬細(xì)胞死亡過(guò)程[17]。CAI 等報(bào)道在胰腺導(dǎo)管腺癌中癌相關(guān)成纖維細(xì)胞可以采用內(nèi)皮細(xì)胞樣表型，并在體內(nèi)外直接促進(jìn)腫瘤血管生成，這一過(guò)程是由PERK-eIF2α（真核細(xì)胞起始因子2α，eukaryotic Initiation Factor-2α）-ERK1/2（細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2，Extracellular Signal-Regulated Kinase 1/2）軸調(diào)節(jié)[18]。COLEMAN 等報(bào)道結(jié)腸中ATF6 的持續(xù)腸道激活可促進(jìn)失調(diào)和微生物依賴性腫瘤的發(fā)生[19]。本研究富集分析發(fā)現(xiàn)，IRE1、PERK、ATF6 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能涉及包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在內(nèi)的多個(gè)通路，需進(jìn)一步通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)闡明作用機(jī)制，為患者治療提供新的思路。

IRE1、PERK、ATF6 在腫瘤預(yù)后預(yù)測(cè)方面也有報(bào)道。郭軍飛等報(bào)道IRE1a 通過(guò)促進(jìn)微小RNA-346（microRNA-346，miR-346）的高表達(dá)促使宮頸癌細(xì)胞順鉑耐藥，使得IRE1a 高表達(dá)的患者預(yù)后不良[20]。余玉等研究發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌中，PERK/eIF2α 通路的激活對(duì)癌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，抑制PERK 可以促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，提示PERK/eIF2α通路的激活與患者預(yù)后不良有關(guān)[21]。LIU 等通過(guò)對(duì)結(jié)腸癌患者隊(duì)列的組織芯片進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，ATF6 和蛋白磷酸酶2A 癌抑制因子（Cancerous Inhibitor of Protein Phosphatase 2A，CIP2A）的高表達(dá)水平與預(yù)后不良的趨勢(shì)相關(guān)，并進(jìn)一步驗(yàn)證了CIP2A 的表達(dá)受ATF6 調(diào)節(jié)[22]。本研究結(jié)果顯示，IRE1、PERK、ATF6 的表達(dá)與患者的RFS 無(wú)明顯關(guān)系，但與患者的OS 密切相關(guān)，IRE1 高表達(dá)（HR=0.73，95%CI=0.55～0.97，P=0.028）、PERK 高表達(dá)（HR=0.74，95%CI=0.56～0.98，P=0.033）、ATF6低表達(dá)（HR=1.45，95%CI=1.1～1.91，P=0.0081）的患者OS 更好。關(guān)于IRE1、PERK、ATF6 在舌鱗癌中的預(yù)后價(jià)值未來(lái)還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，ATF6 在舌鱗癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，同IRE1、PERK 與舌鱗癌患者不良預(yù)后相關(guān)。在未來(lái)抗腫瘤治療中，IRE1、PERK、ATF6 有可能作為新的腫瘤分子標(biāo)志物，為舌鱗癌的診斷和治療提供新的思路。本研究基于大數(shù)據(jù)分析，具有一定的局限性。因此，后續(xù)還需通過(guò)設(shè)計(jì)具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證和闡述IRE1、PERK、ATF6 在舌鱗癌中的表達(dá)、作用及其相關(guān)分子機(jī)制。