凡 瑾，王松海，劉 楠，陳 捷*

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，西安 710002）

肺癌（lung cancer）是世界上最常見的癌癥之一，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因，每年估計有2 200 萬新發(fā)病例和179 萬例死亡，在我國發(fā)病率及死亡率亦居首位[1]。惡性胸腔積液（malignant pleural effusion，MPE）指胸膜原發(fā)或繼發(fā)的惡性腫瘤，在所有癌癥患者中發(fā)病率高達(dá)15%，且隨癌癥患病率的上升和預(yù)期壽命的延長而增加，其中肺癌和乳腺癌占所有惡性胸腔積液的50%～65%[2-3]，常引起呼吸困難、咳嗽等癥狀。由于肺癌并發(fā)MPE 多為晚期腫瘤患者，機體狀態(tài)差，臨床多以支持治療為主，整體療效較差。

近年來，中醫(yī)藥療法在腫瘤治療中發(fā)揮著巨大的作用，紅景天是景天科紅景天屬植物，具有益氣扶正、滋陰養(yǎng)血、清燥潤肺等功效，紅景天苷（salidroside，Sal）是其主要活性成分，研究發(fā)現(xiàn)Sal 具有抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤、抑制腫瘤血管新生等多重作用[4-8]。本課題組通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)大株紅景天注射液對臨床MPE 患者惡性胸水的產(chǎn)生具有明顯的抑制作用，具體的機制可能與局部胸水中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的抑制有關(guān)，導(dǎo)致胸膜血管生成減少，血管通透性降低，從而抑制MPE 的產(chǎn)生。因此本次研究通過小鼠肺癌胸膜轉(zhuǎn)移MPE模型，同時給予Sal 或Sal 聯(lián)合順鉑胸腔注射并檢測其相關(guān)指標(biāo)變化，為Sal 的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗小鼠購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，60 只C57BL/6 小鼠，雌雄各半，鼠齡8 周，體質(zhì)量20 g，飼養(yǎng)在SPF 級環(huán)境下。

1.2 實驗藥物 Sal （HPLC 法檢測純度＞98%，CAS：82373-94-2），購自四川維克奇生物科技有限公司； 注射用順鉑（凍干型）（齊魯制藥有限公司，批號：1K0574B02）。實驗經(jīng)過動物倫理委員會審查，倫理審查編號：[（2021）動物倫審第（01）號]。

1.3 主要試劑 小鼠Lewis 肺癌瘤株GFP-LLC 細(xì)胞，上海研生實業(yè)有限公司提供。DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco 公司。兔抗大鼠VEGF 抗體（一抗）購自abcam（ab150375）公司， Beta-actin 抗體（一抗）購自abcam（ab8227）公司， 辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 的抗體（二抗）購自北京中杉（ZB-20301）公司。人腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）購自武漢賽培生物（批號：SP10205）；低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor--1α， HIF--1α）購自蘇州卡爾文生物科技有限公司（批號：E20181118A）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) GFP-LLC 細(xì)胞系培養(yǎng)于小牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基中（100 IU/mL 青霉素、100 IU/mL鏈霉素）CO25%，37℃的孵箱里培養(yǎng)。每3日傳代1次，取長勢良好對數(shù)期的細(xì)胞進行下一步操作，通過細(xì)胞板計數(shù)將細(xì)胞制成濃度為每毫升5.0×106個的細(xì)胞混懸液。

1.5 小鼠模型制備及分組 實驗動物選擇小鼠，將GFP-LLC 細(xì)胞制成濃度約每毫升2.5×106個（用PBS調(diào)整濃度）的混懸液。首先，將小鼠胸前區(qū)皮膚用碘伏進行消毒；其次，將制備好的LLC 細(xì)胞懸液用1 mL 注射器吸取并注入小鼠右側(cè)腋中線的胸腔中，約平第6 肋間隙，每只小鼠接種約0.2 mL 的細(xì)胞懸液。注射14 d 后CT 檢查表明建模成功。

選取40 只小鼠，每組8 只，進行如下處理。l）正常組：正常未加任何實驗C57BL/6 小鼠，胸腔注射0.9% NaCl 0.4 mL，每日1 次；2）模型組：在造模成功的基礎(chǔ)上，胸腔注射0.9% NaCl 0.4 mL，每日1 次；3）Sal 組：在造模成功的基礎(chǔ)上，皮下注射Sal（Sal 50 mg/kg），每日1 次；4）化療組（DDP 組）：在造模成功的基礎(chǔ)上，胸腔注射順鉑5 mg/kg，隔3 日1 次；5）Sal+DDP 組： 在造模成功的基礎(chǔ)上，給予紅景天苷每日1 次和順鉑隔 3 日 1 次（Sal 50 mg/kg +5 mg/kg）。 連續(xù)給藥2 周。第 15 天，頸椎脫臼法處死后立即解剖取材備用。

1.6 觀察指標(biāo) MPE 體積測量及相關(guān)樣本的收集：實驗處理結(jié)束后用乙醚麻醉各組小鼠，將小鼠仰臥位在解剖板上固定，小鼠胸部皮膚碘伏消毒，依次切開小鼠胸壁、胸膜等結(jié)構(gòu)，記錄各組小鼠胸水性狀，并用 1 mL 注射器收集胸水，后測量每只小鼠的胸水量。

MPE 樣本的處理：將各組收集的小鼠胸水分別放于1.5 mL 的EP 管里，再加入3.8%的抗凝劑枸椽酸鈉，抗凝劑的量約為胸水的1/9，并快速放入冰中冷凍。再放在4℃離心機中以2 500 rpm 離心10 min，取上清，并保存于-70 ℃冰箱。收集胸膜、肺、縱隔腫瘤組織，4%甲醛固定，-80 ℃保存的標(biāo)本備用。

生存周期計算：實驗結(jié)束后統(tǒng)計21 d 內(nèi)各組小鼠存活情況，計算每組小鼠生存周期。

胸壁轉(zhuǎn)移瘤計數(shù)：由2 名實驗者分別獨立的在解剖顯微鏡下觀察各組MPE 小鼠模型胸壁上癌瘤個數(shù)，如果轉(zhuǎn)移瘤融合成團塊則計為1個，后求其平均個數(shù)。

轉(zhuǎn)移瘤重測量：由2 名實驗者分別獨立在解剖顯微鏡下完整剝離各組MPE 小鼠胸壁上的轉(zhuǎn)移瘤，在稱重記錄后快速將標(biāo)本放在液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

通過酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測MPE 中HIF-1α、TNF 蛋白的表達(dá)水平；實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR 技術(shù)（real-time reverse transcription-PCR，Real-time RT-PCR）、蛋白質(zhì)印跡法（Western blot，WB）檢測胸水中VEGF 的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 15.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，定量資料取3 個獨立實驗的平均值，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，單因素方差分析（ANOVA）進行統(tǒng)計分析。檢測各組平均值之間的差異使用Dunnett' s 檢驗。P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組MPE 小鼠生存時間比較 與模型組比較，Sal 組、DDP 組生存時間雖有延長，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而Sal+DDP 聯(lián)合組生存時間明顯延長，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01），見表1 。

表1 各組MPE 小鼠生存時間比較（± s，n = 8）

表1 各組MPE 小鼠生存時間比較（± s，n = 8）

注：與模型組比較，## P ＜0.01

組別 生存期/d 生命延長率/%正常組 ＞21模型組 10.50±1.93 Sal 組 14.13±1.64 34.57 DDP 組 12.63±1.60 20.29 Sal+DDP 組 18.38±0.74## 75.05

2.2 各組MPE 小鼠胸腔積液體積、胸壁轉(zhuǎn)移瘤個數(shù)及轉(zhuǎn)移瘤質(zhì)量的比較 經(jīng)治療后，與模型組比較，各組小鼠MPE 積液體積，胸壁轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目，轉(zhuǎn)移瘤質(zhì)量均有所減輕，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01），見表2。

表2 各組MPE 小鼠胸腔積液、胸壁轉(zhuǎn)移瘤個數(shù)及轉(zhuǎn)移瘤質(zhì)量的比較（± s，n = 8）

表2 各組MPE 小鼠胸腔積液、胸壁轉(zhuǎn)移瘤個數(shù)及轉(zhuǎn)移瘤質(zhì)量的比較（± s，n = 8）

注：與模型組比較，## P ＜0.01

組別 胸腔積液/μL 轉(zhuǎn)移瘤個數(shù)/個 轉(zhuǎn)移瘤質(zhì)量 /mg正常組 0 0 0模型組 1 168±146 9.6±1.6 930.4±53.1 Sal 組 493±36## 5.2±0.7## 489.3±88.6##DDP 組 784±63## 4.7±0.7## 272.5±59.3##Sal+DDP 組 380±54## 3.6±1.1## 194.1±40.8##

2.3 各組MPE 小鼠血清中TNF-α、HIF-1α 水平比較 經(jīng)治療，與模型組比較，實驗組各組外周血中TNF-α 水平升高，HIF-1α 水平降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），見表3。

表3 各組MPE 小鼠血清中TNF-α、HIF-1α 水平比較（± s，n = 8）

表3 各組MPE 小鼠血清中TNF-α、HIF-1α 水平比較（± s，n = 8）

注：與模型組比較，# P ＜0.05

組別 TNF-α/（pg/mL） HIF-1α/（ng/L）正常組 174.3±9.86 50.5±3.74模型組 72.63±15.08 149.6±9.24 Sal 組 107.3±16.06# 91.01±15.95#DDP 組 136.3±16.54# 78.25±10.42#Sal+DDP 組 152.5±9.87# 61.63±7.93#

2.4 各組MPE 小鼠胸腔積液中VEGF 蛋白表達(dá)情況 通過Western blot 檢測，胸腔積液中VEGF 蛋白表達(dá)情況，見圖1。通過Real-time RT-PCR 檢測，與模型組比較，各組胸腔積液中VEGF mRNA 水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中DDP 組、Sal+DDP 組下降更明顯（P＜ 0.01），見表4。

圖1 各組MPE 小鼠胸腔積液中VEGF 蛋白表達(dá)情況（n = 8）

表4 Real-time RT-PCR 法檢測各組MPE 小鼠胸水中VEGF mRNA 相對表達(dá)量（± s，n = 8） μg/mL

表4 Real-time RT-PCR 法檢測各組MPE 小鼠胸水中VEGF mRNA 相對表達(dá)量（± s，n = 8） μg/mL

注：與模型組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

組別 VEGF mRNA正常組 100±0模型組 220.30±16.94 Sal 組 199.40±17.70#DDP 組 170.50±20.42##Sal+DDP 組 128.10±10.38##

3 討論

MPE 是原發(fā)性胸膜腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移至胸膜最常見的臨床癥狀，引起MPE 最常見的腫瘤包括：肺癌、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤等[9-10]。近年來由于惡性腫瘤的發(fā)病率逐漸升高，MPE 的發(fā)生率也有逐漸上升的趨勢。目前MPE 發(fā)病機制已由單一因素轉(zhuǎn)向多因素共同致病，除了淋巴回流障礙，近年來研究表明，MPE 的形成還包括胸膜腔過表達(dá)血管活性因子導(dǎo)致的血管新生和血管通透性增高，腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞在胸膜腔局部相互作用形成利于MPE 生成的免疫微環(huán)境等學(xué)說[11]。MPE 具有增長速度快、量大、血性居多、難以控制的特點，常伴有乏力、胸痛、呼吸困難等癥狀，臨床局部胸腔穿刺抽吸治療后易反復(fù)發(fā)作，生存周期較差，1、3、6 個月病死率分別為50%、60%、82%，其中位生存期僅為3 ～12 個月[12]。目前，MPE 治療方法雖然較多，比如胸膜固定術(shù)、導(dǎo)管引流術(shù)、胸腔灌注術(shù)，但總體有效率低，生存質(zhì)量差，難以達(dá)到徹底治愈的目的[13-16]。因此，如何有效的緩解MPE 引起的相關(guān)臨床癥狀并防止積液再次積聚是本病目前治療的主要目標(biāo)。中醫(yī)藥作為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，在腫瘤晚期治療方面具有創(chuàng)傷小、并發(fā)癥少、不良反應(yīng)輕的治療特點，因此在MPE 的治療中應(yīng)用越發(fā)廣泛。

紅景天苷作為紅景天的主要活性成分，不僅具有抗疲勞、抗氧化、抗衰老等生理調(diào)節(jié)作用，還具有抗炎、抗腫瘤、抗輻射作用，在心血管及呼吸系統(tǒng)疾病中應(yīng)用廣泛[17-18]。前期課題組通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)靜脈滴注紅景天苷聯(lián)合順鉑胸腔灌注可以抑制MPE 的產(chǎn)生，但是對于紅景天苷如何抑制胸水產(chǎn)生，是否與減輕腫瘤血管通透性有關(guān)尚不明確。因此本次研究，擬從動物實驗角度研究Sal 抑制MPE 產(chǎn)生的可能機制。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，小鼠MPE 體積、胸壁轉(zhuǎn)移瘤個數(shù)，轉(zhuǎn)移瘤重量在Sal 組、DDP 組和Sal+DDP 組均較模型組明顯減少，且聯(lián)合組小鼠生存周期明顯延長，說明Sal 和DDP 對MPE 和腫瘤生長均具有一定抑制作用（P＜0.05）。且Sal+DDP 聯(lián)合治療后，小鼠MPE 體積、胸壁轉(zhuǎn)移瘤個數(shù)、轉(zhuǎn)移瘤重量和生存期的改善情況較Sal 組、DDP 組更加明顯，提示Sal 在抑制MPE 生成、抗腫瘤等方面可與順鉑產(chǎn)生協(xié)同作用。

VEGF 是促進腫瘤血管生成的重要因子，對于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后都有重要意義。目前已知VEGF 調(diào)節(jié)血管通透性的作用是組胺的50 000 倍。有研究表明，VEGF 引起MPE 的產(chǎn)生可能與VEGF 增加小靜脈、微靜脈通透性，使得纖維蛋白、血漿蛋白外滲導(dǎo)致血管內(nèi)外滲透壓的失衡有關(guān)[19]。隨著腫瘤的進展，腫瘤體積不斷增大，對于氧氣的需求也必然增加，而腫瘤細(xì)胞內(nèi)相對雜亂無序的病理性新生血管不能滿足腫瘤生長所需的氧氣，從而使得腫瘤內(nèi)長期處于低氧乏氧狀態(tài)，低氧狀態(tài)又進一步刺激腫瘤細(xì)胞，使其通過旁分泌的方式大量分泌HIF-1α，而HIF-1α 可以刺激腫瘤細(xì)胞分泌VEGF-A，VEGF-A 可以與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGFR-2 受體結(jié)合，誘導(dǎo)MPE 的產(chǎn)生[20]。實驗結(jié)果表明，與模型組比較，Sal 組、DDP 組和Sal+DDP組小鼠HIF-1α 明顯下降，VEGF 水平較模型組顯著降低，聯(lián)合組下降水平更加顯著（P＜0.01），其可能與HIF-1α-VEGF 分子通路抑制相關(guān)。

TNF 是一種主要由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的核轉(zhuǎn)錄因子，正常生理下主要參與機體炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)控、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等[21]。TNF 主要分為TNF-α 和TNF-β 兩類，TNF-α 是目前臨床發(fā)現(xiàn)最強的抗腫瘤細(xì)胞活性因子，具有協(xié)同巨噬細(xì)胞活性以及其他免疫細(xì)胞活性的作用，從而提高機體殺滅腫瘤細(xì)胞的能力。TNF-α 還可以直接誘導(dǎo)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、直接損傷血管內(nèi)皮，導(dǎo)致血管內(nèi)皮完整性損壞，血栓形成，阻止腫瘤血供，最終導(dǎo)致腫瘤壞死凋亡[22]。通過ELISA 檢測TNF-α 水平，我們發(fā)現(xiàn)與模型組比較，Sal 組、DDP 組和Sal+DDP組小鼠TNF-α水平明顯上升，而MPE體積、轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量及重量明顯減少，這可能與抗腫瘤活性因子TNF-α 的激活密切相關(guān)。

綜上所述，中藥Sal 單用或Sal 聯(lián)合順鉑均可抑制MPE 的產(chǎn)生，減少胸壁轉(zhuǎn)移瘤個數(shù)及重量，延長小鼠生存時間，且聯(lián)合應(yīng)用時作用更顯著，其產(chǎn)生作用的機制可能與HIF-1α-VEGF 分子通路抑制及抗腫瘤活性因子TNF-α 的激活相關(guān)，為臨床使用紅景天制劑抑制MPE 的產(chǎn)生提供了一定的實驗依據(jù)。但由于本實驗設(shè)計的局限性，后續(xù)應(yīng)深入研究不同濃度Sal、聯(lián)用VEGF 激動劑或TNF-α 抑制劑對MPE 小鼠的影響。