孫曉雯 綜述 黃悅 張曉敏 審校

天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼科研究所 國家眼耳鼻喉疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心天津市分中心 天津市視網(wǎng)膜功能與疾病重點實驗室,天津 300384

孫曉雯,在職博士研究生,現(xiàn)在山東省日照市人民醫(yī)院眼科,日照 276800

微生物群落是人體的基本組成部分,包括細菌、真菌、病毒、古細菌等,體內(nèi)微生物的組成主要是細菌,其他含量較少[1]。美國科學(xué)院發(fā)起的人類微生物組學(xué)的研究由關(guān)注單個微生物體轉(zhuǎn)變到微生物的相互作用,揭示了人體內(nèi)微生物群落的多樣性[2]。研究發(fā)現(xiàn),正常的微生物群在防止病原菌增生方面起保護作用,因此,體內(nèi)微生物群失衡可能與疾病的發(fā)生有關(guān)[1]。最初的微生物組學(xué)研究主要集中在胃腸道、口腔、鼻腔、皮膚和泌尿生殖道這5個部位[3]。目前對腸道微生物群的研究相對成熟,研究結(jié)果提示腸道微生物群落與多種自身免疫性和炎癥性疾病有關(guān)[4]。研究發(fā)現(xiàn),相對體內(nèi)其他部位,眼表存在相對穩(wěn)定、多樣性低的核心微生物群,這些微生物群的功能主要是參與免疫調(diào)節(jié)和防止?jié)撛诓≡w的入侵[5]。正常眼部宿主-微生物和微生物-微生物的復(fù)雜相互作用表明微生物群的有益作用[6]。目前常用的微生物群的研究方法有培養(yǎng)、16S核糖體核糖核酸基因(16SrRNA)高通量測序及宏基因測序。研究微生物群在眼科疾病中的作用可以指導(dǎo)眼局部和全身抗生素的正確使用,以及為開發(fā)益生菌治療眼科疾病提供新的思路。近年來,隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展,眼表微生物群成為研究熱點,但眼表微生物群與眼表疾病關(guān)系的研究仍不成熟。本文主要對正常眼表菌群的組成、分布、影響因素及眼表菌群與干眼、角膜炎、瞼緣炎等眼表疾病的關(guān)系進行綜述。

1 正常眼表菌群的組成

眼表菌群是指存在于角膜和結(jié)膜的常駐細菌,不包括眼瞼菌群,目前認為眼瞼微生物是皮膚微生物群的一部分[5]。眼表直接暴露在外部環(huán)境中,容易受到各種抗原和病原體的影響,眼表除了起到作為物理屏障抵御外界環(huán)境的作用外,在先天免疫中也起著至關(guān)重要的作用。研究表明,眼表上皮細胞通過產(chǎn)生促炎細胞因子來識別和選擇性地對病原微生物做出反應(yīng)。由于眼表上皮細胞對共生菌無免疫應(yīng)答反應(yīng),雖然眼表與共生菌接觸,但健康人角膜和結(jié)膜上皮細胞不會發(fā)生炎癥反應(yīng)[3]。St Leger等[7]研究發(fā)現(xiàn),小鼠眼表黏膜存在乳腺炎棒狀桿菌,可引起眼部γδ+T細胞的白細胞介素-17(interleukin-17,IL-17)發(fā)生反應(yīng),沒有乳腺炎棒狀桿菌感染的小鼠角膜容易感染白念珠菌和銅綠假單胞菌。因此,眼表共生菌對外界病原微生物的入侵可能起到一定的保護作用,某些菌群的改變可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

應(yīng)用細菌培養(yǎng)方法鑒定的眼表菌群主要以革蘭陽性菌為主,尤其是葡萄球菌、鏈球菌、棒狀桿菌和丙酸桿菌,也存在一些革蘭陰性菌,如嗜血桿菌和奈瑟菌。但細菌培養(yǎng)方法對菌群鑒定存在檢出率低的缺點,主要能檢測出在標準培養(yǎng)基上快速生長的微生物[8]。

由于淚液的抗菌性和眼瞼的機械作用不利于細菌在眼表的定植,所以眼表相對于體內(nèi)其他部位含菌量低,應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)可以全面分析眼表菌群分布。16SrRNA高通量測序通過檢測細菌基因組部分保守序列來鑒定細菌種類,還可以分析菌群的多樣性和相對豐度及進行菌群比較等,物種鑒別只能分析到屬水平。宏基因測序是直接從樣品中提取全部微生物的DNA開展基因水平的分析,通過對基因序列進行功能注釋,分析不同基因的功能、參與的生物通路和抗生素耐藥性等,進一步量化微生物組成,物種鑒別能分析到種水平,同時也能對真菌、病毒、古細菌進行鑒定[9-10]。2011年,美國Bascom Palmer眼科研究所首次應(yīng)用16SrRNA高通量測序研究了眼表菌群,發(fā)現(xiàn)眼表菌群的多樣性,平均每個受試者有221種細菌,該細菌被分為5個門和59個屬,其中12個屬在所有研究對象中普遍存在,占總分類細菌DNA序列的96%以上,代表了眼表的“核心菌群”,包括共生性、環(huán)境性和機會性致病菌[11]。大部分研究發(fā)現(xiàn),在門水平,變形菌門、厚壁菌門和放線菌門是眼表的優(yōu)勢菌,其次為擬桿菌門。在屬水平上,各個研究存在一定差異,總的來說,大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)棒狀桿菌、葡萄球菌在眼表普遍存在,不同研究之間的相對豐度存在差異。正常人眼表菌群中也發(fā)現(xiàn)鏈球菌、丙酸桿菌、芽孢桿菌、葡萄球菌、慢生根瘤菌、鞘氨醇單胞菌等[1,6,11-13]。不同研究結(jié)果的差異考慮與取樣方法、檢測過程、環(huán)境、地區(qū)等不同因素的影響有關(guān)。

2 眼表菌群的分布及影響因素

2.1 眼表菌群的分布

眼表不同部位存在不同的細菌群落,結(jié)膜菌群存在垂直分布的特點。應(yīng)用無菌拭子進行結(jié)膜取樣時,同一部位施加不同壓力,取樣菌群的相對豐度存在顯著變化。用無菌拭子輕微擦拭結(jié)膜取樣,屬于厚壁菌門中的葡萄球菌屬、放線菌門中的棒狀桿菌屬增加,變形菌門減少;而用無菌拭子加壓擦拭結(jié)膜取樣,屬于變形桿菌門中的慢生根瘤菌屬、代爾夫特菌屬和鞘氨醇單胞菌屬明顯增加;考慮輕微擦拭結(jié)膜得到的菌群可能是眼表的暫時性菌群[11]。Ozkan等[5,14]的研究中用無菌拭子取球結(jié)膜樣本以及在翼狀胬肉手術(shù)中切除穹窿部結(jié)膜及角膜緣組織,應(yīng)用16SrRNA測序比較球結(jié)膜、穹窿部結(jié)膜、角膜緣的菌群分布,結(jié)果發(fā)現(xiàn)穹窿部結(jié)膜與角膜緣菌群分布無明顯差異,屬于變形菌門的假單胞菌占優(yōu)勢,而這2個部位與球結(jié)膜菌群分布有差別,球結(jié)膜中棒狀桿菌占優(yōu)勢,而假單胞菌較少;切除的穹窿部與角膜緣組織也代表了結(jié)膜深層組織,同時也證實了結(jié)膜菌群存在垂直分布的特點。Matysiak等[1]研究發(fā)現(xiàn),角膜和結(jié)膜菌群分布存在差異,該研究采用在角膜移植術(shù)中切除的角膜組織及使用結(jié)膜拭子獲取的球結(jié)膜標本分析角膜與結(jié)膜菌群分布,發(fā)現(xiàn)角膜中變形菌門為優(yōu)勢菌,而結(jié)膜中主要為厚壁菌門。Katzka等[15]研究發(fā)現(xiàn),不同材質(zhì)的結(jié)膜拭子也會影響菌群分析的結(jié)果,海藻酸鈣結(jié)膜拭子取樣的菌群最接近角膜上皮取樣的菌群分布。與腸道微生物群不同,眼表微生物含量低,不同因素對分析結(jié)果的影響較大。因此,最具代表性采樣方式仍需進一步研究。

2.2 年齡和性別對眼表菌群的影響

眼表菌群隨年齡的改變而發(fā)生變化。Katzka等[15]研究發(fā)現(xiàn),年齡較大者(65歲以上)眼表菌群的多樣性高,與腸道菌群中的變化類似[16]。新生兒在剛出生時結(jié)膜菌群多樣性更高,含有與宮頸相似的菌群,2 d后,從結(jié)膜中分離到的細菌菌落減少[17]。Zhou等[13]研究發(fā)現(xiàn),10歲以下兒童的結(jié)膜囊菌群多樣性增加,鏈球菌含量明顯增加,考慮可能與兒童免疫力低下、衛(wèi)生行為等因素有關(guān)。另一項應(yīng)用宏基因測序的研究發(fā)現(xiàn),45歲以上年齡組菌群的多樣性高,菌群在代謝功能、抗生素耐藥基因表達、相對豐度等方面與45歲以下年齡組存在顯著差異[18]。這些結(jié)果表明,從出生到青春期,眼部菌群可能先發(fā)生改變,然后趨于穩(wěn)定,到中老年時可能變得更加多樣化。隨年齡增長,可能通過改變眼表共生菌群來改變眼表的免疫動態(tài)平衡。Ozkan等[12]研究發(fā)現(xiàn),眼表菌群豐富度和多樣性隨年齡變化均無影響。Suzuki等[19]研究則發(fā)現(xiàn),眼表菌群的多樣性隨年齡增長而顯著降低,老年人結(jié)膜囊菌群主要為棒狀桿菌屬和奈瑟菌屬?？紤]不同研究之間的差異可能歸因于年齡分層、測序方法及樣本量的差異。

有研究發(fā)現(xiàn)性別對菌群的改變無影響[5,13]。而Ozkan等[12]研究發(fā)現(xiàn)男性的菌群多樣性指數(shù)高于女性。Wen等[18]研究發(fā)現(xiàn),在老年患者中,男性和女性眼表微生物組成和功能存在顯著差異,而在年輕患者中,男性和女性眼表微生物組成和功能無明顯差異?？紤]在眼表微生物群重塑過程中,年齡可能是較強的影響因素,而性別在與年齡相互作用時才影響微生物群。

2.3 環(huán)境對眼表菌群的影響

眼表微生物群的組成和功能存在地理差異。Deng等[9]應(yīng)用宏基因測序研究發(fā)現(xiàn),北京受試者結(jié)膜樣本中微生物群多樣性較高且具有獨特性,廣州和溫州受試者結(jié)膜微生物群的多樣性無明顯差異。痤瘡桿菌和銅綠假單胞菌分別是廣州和北京受試者結(jié)膜微生物群落中最豐富的菌群?；颊咦詮V州前往省內(nèi)周邊城市短途旅行后結(jié)膜菌群無明顯變化,而自廣州前往省外其他城市長途旅行后結(jié)膜菌群在多樣性、組成及功能等方面發(fā)生了顯著改變。在美國、中國、韓國、澳大利亞、岡比亞和北愛爾蘭對健康人眼表菌群的分析中發(fā)現(xiàn),其優(yōu)勢菌相似,但是不同菌群的相對豐度不同。因此,不同地區(qū)環(huán)境的不同可導(dǎo)致眼表菌群多樣性、相對豐度及優(yōu)勢菌的改變[20]。

2.4 局部使用抗生素對眼表菌群的影響

局部重復(fù)使用抗生素可以使眼表的耐藥菌群增加。Dave等[21]研究發(fā)現(xiàn),局部多次重復(fù)使用阿奇霉素和氟喹諾酮類抗生素后,結(jié)膜表面培養(yǎng)分離的表皮葡萄球菌百分比顯著增加,損害其他共生菌,增加抗生素的耐藥性,耐藥的表皮葡萄球菌比敏感的表皮葡萄球菌會引起更嚴重的眼內(nèi)炎癥。Yin等[22]研究發(fā)現(xiàn),局部重復(fù)使用莫西沙星可顯著增加眼表菌群的抗生素耐藥性。吳瓊等[23]研究了玻璃體內(nèi)藥物注射患者術(shù)前局部使用抗生素對眼表菌群的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)眼表局部使用抗生素使結(jié)膜囊菌群的多樣性減少,眼表共生菌(葡萄球菌、棒狀桿菌)明顯減少,致病菌(鏈球菌、不動桿菌)增加。Iwasaki等[24]研究發(fā)現(xiàn),白內(nèi)障術(shù)后局部預(yù)防性使用左氧氟沙星后1個月眼表菌群的多樣性降低,對左氧氟沙星的耐藥性增加,末次局部使用左氧氟沙星后6～9個月敏感性菌群才能恢復(fù)。因此,應(yīng)盡量避免眼局部重復(fù)使用抗生素來預(yù)防和控制感染,減少耐藥菌的產(chǎn)生。

3 眼表菌群與眼表疾病

3.1 眼表菌群與干眼

研究發(fā)現(xiàn),干眼患者眼表菌群的多樣性降低,優(yōu)勢菌減少。干眼患者眼表富含擬桿菌,而假單胞菌、變形桿菌在健康人群中含量較高。眼表菌群組成和多樣性的改變在干眼的發(fā)生中起著重要作用,優(yōu)勢菌的改變可能會影響眼表的自身免疫,減少免疫球蛋白的產(chǎn)生[25]。Graham等[26]采用常規(guī)培養(yǎng)和16SrRNA測序比較正常人和干眼患者眼表菌群,只在干眼患者中發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌和催產(chǎn)克雷伯菌等細菌,而且細菌計數(shù)升高與杯狀細胞的減少有關(guān),杯狀細胞減少導(dǎo)致淚膜變薄,促進了外部病原體的侵入。Andersson等[27]研究發(fā)現(xiàn),水樣缺乏型干眼患者眼表菌群多樣性較健康人減少,細菌組成發(fā)生改變,芽孢桿菌被鑒定為水樣缺乏型干眼組的細菌標志物,假單胞菌被鑒定為健康對照組的細菌生物標志物。因此,考慮淚液分泌減少可引起細菌多樣性和成分的改變。

Qi等[28]研究發(fā)現(xiàn),有無自身免疫性干眼患者眼表菌群的多樣性無明顯差異,但菌群的組成結(jié)構(gòu)不同。放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門在自身免疫性干眼組中含量較高,無自身免疫性干眼組中變形桿菌含量明顯升高。棒狀桿菌屬在自身免疫性干眼組中含量顯著增加,該屬已被證明與自身免疫有關(guān),可以影響巨噬細胞的功能,因此,棒狀桿菌可能促進了干眼的免疫變化;2個組患者的眼表參數(shù)與菌群豐度的相關(guān)性不同,推測2個組間存在不同的免疫狀態(tài),同一細菌在不同免疫狀態(tài)下的功能可能發(fā)生改變。

Zhang等[29]應(yīng)用細菌培養(yǎng)方法發(fā)現(xiàn),瞼板腺功能障礙(meibomian gland dysfunction,MGD)患者比健康人結(jié)膜囊細菌培養(yǎng)陽性率高,細菌特征更復(fù)雜。Dong等[30]研究發(fā)現(xiàn),MGD患者與健康人相比菌群的多樣性無明顯變化,重度MGD患者與輕、中度MGD患者及健康對照組的細菌群落組成有顯著差異。MGD患者結(jié)膜囊葡萄球菌和鞘氨醇單胞菌含量明顯升高,棒狀桿菌減少,重度MGD組葡萄球菌相對豐度顯著高于其他各組,而且葡萄球菌的相對豐度與瞼板腺丟失程度相關(guān)。已有研究證明,棒狀桿菌作為眼表共生菌,可保護宿主免受病原微生物感染[7]。Jiang等[31]研究發(fā)現(xiàn),隨著MGD程度的加重,眼表細菌組成更加復(fù)雜。重度MGD組的結(jié)膜細菌分離率和菌種數(shù)量均顯著高于輕度、中度MGD和健康對照組,重度MGD組表皮葡萄球菌細菌分離率也明顯高于其他各組。因此,MGD中棒狀桿菌的減少可能導(dǎo)致眼表對病原菌的抵抗力下降,是結(jié)膜囊病原菌增生的因素,這也為抗生素治療重度MGD提供了理論依據(jù)。

因此,不同類型干眼患者眼表菌群的分布不同,細菌發(fā)揮的作用也不同,眼表微生物與干眼的具體作用機制仍需進一步研究。

3.2 眼表菌群與瞼緣炎

Lee等[32]研究發(fā)現(xiàn),瞼緣炎患者眼表葡萄球菌屬、鏈球菌屬、棒狀桿菌屬和芽孢桿菌屬的相對豐度均高于健康人,丙酸桿菌明顯低于健康人,考慮丙酸桿菌可能是預(yù)防瞼緣炎的一種共生菌,瞼緣炎可能是由混合皮膚微生物群落的感染引起的。Graham等[26]研究發(fā)現(xiàn),芽孢桿菌等計數(shù)的增加與瞼緣炎發(fā)生有關(guān)。Yan等[33]研究發(fā)現(xiàn),蠕形螨性瞼緣炎患者眼表菌群的組成與健康人有顯著差異,蠕形螨性瞼緣炎患者結(jié)膜囊藍藻菌的相對豐度明顯高于健康人,厚壁菌門和棒狀桿菌的相對豐度明顯升高;引起眼瞼蠕形螨感染的主要潛在因素是芽孢桿菌、厚壁菌、藍藻菌、乳桿菌和鏈球菌。此外,蠕形螨的數(shù)量和類型會影響特定的眼表細菌?？紤]蠕形螨可能作為媒介傳播皮膚和環(huán)境的菌群,導(dǎo)致瞼緣炎的發(fā)生。因此,在治療蠕形螨性瞼緣炎時,在除螨和瞼緣清潔的同時,抗菌治療也非常重要。而蠕形螨與細菌在瞼緣炎發(fā)病中的因果關(guān)系仍需進一步探討。

3.3 眼表菌群與角膜炎

Ren等[34]研究發(fā)現(xiàn),細菌性角膜炎患者眼表放線桿菌和棒狀桿菌顯著減少,變形桿菌、假單胞菌、擬桿菌和志賀菌明顯增多,因此,細菌性角膜炎的易感因素可能不是簡單的某一細菌屬含量的波動,而是整體菌群失衡。Kang等[10]研究發(fā)現(xiàn),外傷性角膜炎患者眼表微生物群落的豐富度和均勻度顯著降低,變形桿菌和假單胞菌較健康人明顯增加。Ge等[35]研究發(fā)現(xiàn),真菌性角膜炎患者患眼和對側(cè)眼均出現(xiàn)結(jié)膜菌群多樣性降低和結(jié)構(gòu)的改變,棒狀桿菌和葡萄球菌含量降低,假單胞菌和冷桿菌含量升高。St Leger等[7]研究發(fā)現(xiàn),乳腺炎棒狀桿菌是眼表共生菌,通過誘導(dǎo)IL-17+γδ+T細胞反應(yīng),保護眼表免受白念珠菌和銅綠假單胞菌感染。因此健康人眼表菌群保護性和侵襲性細菌的失衡可促進角膜炎的發(fā)生,推測通過調(diào)節(jié)眼表菌群來預(yù)防和治療感染性眼病似乎是有希望的。

4 小結(jié)與展望

健康的眼表具有相對穩(wěn)定、多樣性相對較低的核心微生物群。16SrRNA測序和宏基因測序等分子生物學(xué)檢測技術(shù)揭示了眼表豐富的微生物群落。眼表微生物群落參與免疫調(diào)節(jié),可受多種宿主、環(huán)境、病理因素影響而發(fā)生變化。正常的眼表微生物群在防止病原菌增生方面起著保護作用,菌群失衡與疾病發(fā)生有關(guān),不同細菌在疾病中的作用不同。目前對眼表微生物菌落的研究還比較局限,對于眼表微生物菌落與疾病之間的作用機制仍有待進一步研究。未來的研究不僅需要了解微生物群落的組成變化,還需要了解微生物種群的數(shù)量差異及功能變化,對眼表疾病發(fā)生機制有更深入的認識,為益生菌用于眼科疾病防治奠定基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突