劉飛 姜蕾 丁真真 魏健 張?zhí)? 吳江超

摘要：酵母菌在乳制品發(fā)酵過程中對(duì)其風(fēng)味提升、品質(zhì)改良有重要作用。為獲得具有良好發(fā)酵特性的酵母菌株，該研究以喀什地區(qū)岳普湖縣發(fā)酵驢乳為原料，從中分離篩選到9株酵母菌。結(jié)合WL培養(yǎng)基菌株形態(tài)特征及生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將9株菌初步鑒別為葡萄汁有孢漢遜酵母、克魯維畢赤酵母、釀酒酵母和拜爾接合酵母。同種各選一株活性較強(qiáng)的菌株J2、J4、J6、J9，對(duì)其耐受性及發(fā)酵特性進(jìn)行研究，得出J6菌株的發(fā)酵能力及耐受性較優(yōu)，以期為發(fā)酵驢乳制品的開發(fā)提供幫助。

關(guān)鍵詞：酵母菌；分離篩選；耐受性；發(fā)酵特性

中圖分類號(hào)：TS201.3????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A???? 文章編號(hào)：1000-9973（2023）12-0075-04

Study on Separation， Identification and Fermentation Characteristics of Yeast in Fermented Donkey Milk

LIU Fei， JIANG Lei， DING Zhen-zhen， WEI Jian， ZHANG Tian， WU Jiang-chao

（College of Life and Geographic Science， Kashi University， Kashi 844006， China）

Abstract： Yeast plays an important role in improving flavor and quality during the fermentation of dairy products.In order to obtain yeast strains with good fermentation characteristics， in this study， with fermented donkey milk in Yopurga County， Kashgar area as the raw material， nine strains of yeast are isolated and screened from it. Based on the morphological characteristics of the strains in WL medium and the results of physiological and biochemical experiments， the nine strains are preliminarily identified as Hanseniaspora uvarum， Pichia kluyveri， Saccharomyces cerevisiae and Zygosaccharomyces. Select J2， J4， J6 and J9， one strain with higher activity from each species， to study their tolerance and fermentation characteristics. It is concluded that J6 strain has better fermentation ability and tolerance， in order to provide assistance for the development of fermented donkey dairy products.

Key words： yeast; separation and screening; tolerance; fermentation characteristics

收稿日期：2023-06-23

基金項(xiàng)目：喀什大學(xué)校內(nèi)課題（（19）2647）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（S201910763004）

作者簡(jiǎn)介：劉飛（1993－），男，講師，博士研究生，研究方向：乳制品發(fā)酵。

發(fā)酵驢乳是生驢乳在特定發(fā)酵劑作用下，經(jīng)發(fā)酵制成的風(fēng)味優(yōu)良、形態(tài)均一的凝乳狀產(chǎn)品[1]。驢乳發(fā)酵后的風(fēng)味物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到較大提升[2]，在乳酸菌、酵母菌作用下，發(fā)酵驢乳中乳酸、醋酸、醇類、胞外多糖和游離氨基酸等風(fēng)味活性物質(zhì)含量明顯增加[3]，并提高了人體對(duì)鈣、鐵、磷、維生素及蛋白質(zhì)的吸收利用率[4]，使非酯化脂肪酸含量增加，更易消化吸收[5]。而酵母菌作為發(fā)酵過程中的重要參與者，在發(fā)酵食品中應(yīng)用廣泛，如在發(fā)酵肉制品、酒類、黃豆醬、醬油[6]及發(fā)酵乳品生產(chǎn)中，對(duì)產(chǎn)品的風(fēng)味提升、品質(zhì)改良有重要作用[7-8]。因此，對(duì)發(fā)酵驢乳中酵母菌的分離篩選及發(fā)酵特性研究對(duì)其產(chǎn)品風(fēng)味提升、品質(zhì)改良有重要意義。

酵母菌種類繁多，在食品、藥品、發(fā)酵行業(yè)及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有很高應(yīng)用價(jià)值[9]。目前，酵母菌的分離鑒定技術(shù)較成熟，楊雪峰等[10]利用WL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基鑒定葡萄酒中相關(guān)酵母菌，王冠群等[11]通過YPD菌落形態(tài)、WL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基聚類分析研究新疆傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的酵母菌菌群結(jié)構(gòu)。本文使用YPD及WL培養(yǎng)基對(duì)新疆岳普湖縣發(fā)酵驢乳中的酵母菌進(jìn)行分離、篩選、純化和表型初步鑒定，對(duì)活性較優(yōu)菌株的發(fā)酵特性及耐受性進(jìn)行研究，以期得到可提升發(fā)酵乳制品風(fēng)味品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的優(yōu)良酵母菌株，為新疆發(fā)酵驢乳制品的開發(fā)研究提供一些幫助。

1 材料與儀器

1.1 樣品采集

從新疆岳普湖縣農(nóng)戶家中采集鮮驢乳，用滅菌的玻璃瓶密封貼標(biāo)后于－4 ℃冰盒中保藏。隨后加入少量酸奶于30 ℃發(fā)酵8 h，進(jìn)行酵母菌篩選實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

酵母浸出粉胨葡萄糖（YEPD）培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 L。

酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）瓊脂培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L。

WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：葡萄糖50 g、瓊脂20 g、蛋白胨5 g、酵母浸粉4 g、氯化鈣0.125 g、硫酸鎂0.125 g、氯化鉀0.425 g、磷酸二氫鉀0.55 g、氯化鐵0.002 5 g、硫酸錳0.002 5 g、溴甲酚綠0.022 g、蒸餾水1 L，pH 5.5，121 ℃滅菌20 min。

1.3 儀器及設(shè)備

BSA224S萬分之一天平 美國(guó) Mettler Toledo 公司；LE2002E/02電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；BCD-265F冷藏冷凍箱 合肥榮事達(dá)電子電器集團(tuán)有限公司；LAC-5040S全自動(dòng)高壓滅菌鍋 諸城市衡石機(jī)械有限公司；PHS-3C型pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DNP-9272智能生化培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SHZ-B水浴恒溫振蕩器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；S/NS 1115989光學(xué)顯微鏡 義烏市楚達(dá)光學(xué)儀器廠。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 酵母菌的分離與純化

取1 mL酸驢乳樣品于9 mL無菌水中充分混勻，28 ℃恒溫培養(yǎng)12 h。取1 mL接種于YEPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃活化24～48 h，梯度稀釋10-2～10-7。吸取200 μL不同濃度的菌液加到含有氯霉素（50 mg/mL）的YPD培養(yǎng)基中進(jìn)行涂布，28 ℃培養(yǎng)24 h。觀察菌落形態(tài)后挑取表面光滑濕潤(rùn)、中間隆起、具有典型酵母菌形態(tài)特征的單菌落進(jìn)行平板劃線，純化培養(yǎng)2次后在顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)及繁殖方式，于4 ℃保藏備用。

2.2 WL培養(yǎng)基菌株形態(tài)觀察

將通過YPD培養(yǎng)基純化保藏的菌種活化后，劃線接種于WL培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d觀察記錄菌落的顏色和形態(tài)[12]。

2.3 生理生化實(shí)驗(yàn)

以YPD培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，配制糖發(fā)酵、碳源、氮源同化實(shí)驗(yàn)所需培養(yǎng)基。參照《真菌鑒定手冊(cè)》[13]及《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[14]對(duì)驢酸乳中初篩到的酵母菌進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合菌株在WL培養(yǎng)基中的形態(tài)特征和生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)菌株進(jìn)行初步鑒別。

2.4 發(fā)酵特性研究

2.4.1 產(chǎn)氣性能的測(cè)定

酵母菌的產(chǎn)氣情況在一定程度上反映了菌株的發(fā)酵能力。選擇杜氏小管發(fā)酵法測(cè)定菌株的產(chǎn)氣性能[15]：在10 mL YEPD液體培養(yǎng)基中加入0.5 mL菌液，放入倒置的杜氏小管（管內(nèi)無氣體）中，于28 ℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h。記錄產(chǎn)氣時(shí)間、產(chǎn)氣量，重復(fù)測(cè)定3次，篩選出生長(zhǎng)和發(fā)酵性能較好的菌株。

2.4.2 還原糖的測(cè)定

將酵母菌接種至YEPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)72 h。采用3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定還原糖含量[16]，每隔24 h測(cè)定一次發(fā)酵液中還原糖含量。

2.5 耐受性的測(cè)定

2.5.1 溫度耐受性實(shí)驗(yàn)

將酵母菌劃線接種于YPD固體培養(yǎng)基中，在不同溫度（30，35，40，45，50 ℃）條件下培養(yǎng)5 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況。通過菌株的生長(zhǎng)情況，測(cè)定其溫度耐受性[17]。

2.5.2 pH耐受性實(shí)驗(yàn)[18]

用乳酸調(diào)節(jié)YEPD液體培養(yǎng)基的pH值為2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5。按接種量2%接入不同pH值的15 mL試管中（內(nèi)放倒置的杜氏小管），28 ℃恒溫靜置培養(yǎng)3 d。觀察各杜氏小管內(nèi)氣體充盈情況，判斷各菌株的pH耐受性。

2.5.3 糖耐受性[19]

以YPD培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，配制不同葡萄糖濃度的固體培養(yǎng)基，葡萄糖濃度設(shè)置為300，350，400，450，500 g/L。將酵母菌株劃線接種在不同葡萄糖濃度的YPD培養(yǎng)基中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h觀察菌株在不同葡萄糖濃度培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況。

3 結(jié)果與分析

3.1 酵母菌的分離篩選

3.1.1 酵母菌的分離

驢乳自然發(fā)酵后搖勻涂布，挑取單菌落。在YPD培養(yǎng)基中分離純化得到9株酵母菌，編號(hào)為J1～J9。其中J6、J9 YPD培養(yǎng)基劃線結(jié)果見圖1。隨后通過鏡檢觀察各菌株的形態(tài)結(jié)構(gòu)，J1、J2為圓形，無假菌絲，有子囊孢子；J3、J4、J5、J8、J9為橢圓形，有假菌絲和子囊孢子；J6、J7為卵圓形，具有明顯的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，繁殖方式為芽殖，有假菌絲，較弱。

3.1.2 WL培養(yǎng)基菌株形態(tài)特征及生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將通過YEPD液體培養(yǎng)基活化后的菌株接種于WL培養(yǎng)基中，進(jìn)行劃線分離觀察其菌落顏色、大小及形態(tài)特征。與Cavazza等描述的菌株形態(tài)特征比對(duì)分析（見圖2和表1）后，可初步鑒定菌株J1、J2、J5表型為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniapora uvarum），菌株J3、J4為克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri），菌株J6、J7為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），菌株J8、J9為拜爾接合酵母（Zygosaccharomyces）[20-22]。

在同類別酵母中選取活性較好的菌株J2、J4、J6、J9進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

由表2可知，在碳源同化實(shí)驗(yàn)中4株菌均可同化蔗糖，J2不可同化乳糖，J4、J6不可同化木糖，J6對(duì)乳糖的同化能力較弱。氮源同化中J4、J6、J9均不能同化硝酸鉀，除J4外，其他3株菌均可同化尿素。糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中除J4不能利用麥芽糖、蔗糖發(fā)酵產(chǎn)氣外，其他3株菌均可利用麥芽糖、蔗糖。根據(jù)生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[14]描述以及結(jié)合WL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基表型觀察，可初步鑒別菌株J2為葡萄汁有孢漢遜酵母，J4為克魯維畢赤酵母，J6為釀酒酵母，J8為拜爾接合酵母。

3.2 發(fā)酵特性結(jié)果

3.2.1 產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4株菌的產(chǎn)氣能力見表3。

由表3可知，菌株J6的產(chǎn)氣能力最強(qiáng)，在24 h就可使杜氏小管中產(chǎn)生一半氣體，在48 h可使杜氏小管中充滿氣體。菌株J9的產(chǎn)氣能力較強(qiáng)，48 h可使杜氏小管中產(chǎn)生3/4氣體。菌株J4的產(chǎn)氣能力最弱，在48 h才使杜氏小管中產(chǎn)生1/4氣體。

3.2.2 還原糖測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果

酵母菌生長(zhǎng)代謝中通過糖代謝生產(chǎn)代謝產(chǎn)物。因此，還原糖的測(cè)定可以反映微生物的生長(zhǎng)代謝能力。利用測(cè)定還原糖含量的方法來反映菌株的發(fā)酵能力。

由圖3可知，在第1天時(shí)菌株J4消耗的還原糖含量相對(duì)較多，第2天時(shí)菌株J9的還原糖總消耗量較多，而第3天時(shí)J6發(fā)酵液中剩余的還原糖含量最少，說明其消耗的還原糖含量最多，發(fā)酵能力相對(duì)最優(yōu)；菌株J9次之，還原糖含量也較低，說明其也具有較好的發(fā)酵能力；而菌株J2發(fā)酵液中剩余的還原糖含量最多，消耗量最少，說明其發(fā)酵消耗還原糖的能力相對(duì)較差。

3.3 酵母菌耐受性測(cè)定

3.3.1 菌株耐溫性

酵母菌生長(zhǎng)需要一定的溫度條件，在適宜溫度下才能進(jìn)行正常發(fā)酵，但若超過或者低于適宜溫度則生長(zhǎng)能力會(huì)受到抑制[23]。將實(shí)驗(yàn)菌株J2、J4、J6、J9在不同溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

由表4可知，生長(zhǎng)溫度在50 ℃時(shí)酵母菌全部失去生長(zhǎng)能力；45 ℃時(shí)菌株J2、J9停止生長(zhǎng)，J4、J6生長(zhǎng)緩慢；而在40 ℃下菌株J2也停止生長(zhǎng)，J9生長(zhǎng)緩慢，J4和J6還可正常生長(zhǎng)；35 ℃下菌株J4的生長(zhǎng)活性最好。因此，綜合各溫度條件下菌株的耐受性情況，可得出菌株J4的耐溫性相對(duì)較好，J2相對(duì)較差。

3.3.2 pH耐受性測(cè)定

酵母菌一般在pH值為4.5～5.5時(shí)生長(zhǎng)較好[24]。在過酸環(huán)境中其生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，發(fā)酵能力下降，甚至沒有活性。菌株J2、J4、J6、J9在不同pH值培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)產(chǎn)氣情況見表5。

由表5可知，pH值在3.0～4.5范圍內(nèi)，各菌株的產(chǎn)氣能力相差不大，說明其發(fā)酵生長(zhǎng)沒有受到較大影響；而當(dāng)pH為2.5時(shí)，菌株J2停止產(chǎn)氣，其他菌株產(chǎn)氣量變?yōu)?/2，說明各菌株的生長(zhǎng)活性開始受到抑制；在pH為2.0時(shí)，菌株J6的產(chǎn)氣能力沒有受到影響，而菌株J4、J9的產(chǎn)氣量變?yōu)?/4，產(chǎn)氣能力下降。綜上可以看出，菌株J6在各pH值下的產(chǎn)氣能力相對(duì)較強(qiáng)，生長(zhǎng)活性較好，酸耐受性最優(yōu)。

3.3.3 糖耐受性測(cè)定

糖濃度對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)活性具有一定影響[25]，一般乳制品中糖濃度在12%～20%時(shí)酵母菌的生長(zhǎng)發(fā)酵能力最好，隨著糖濃度的增加，生長(zhǎng)能力逐漸受到抑制。菌株J2、J4、J6、J9對(duì)不同糖濃度的耐受性結(jié)果見表6。

由表6可知，當(dāng)糖濃度在300，350 g/L時(shí)各菌株生長(zhǎng)狀況均較好，未受到抑制。而當(dāng)糖濃度達(dá)到400 g/L時(shí)，菌株J2的生長(zhǎng)活性略有下降，但仍可生長(zhǎng)，其他菌株的生長(zhǎng)活性依舊較強(qiáng)，不受影響。當(dāng)糖濃度達(dá)到450 g/L時(shí)，菌株J6的生長(zhǎng)活性較弱，菌株J2停止生長(zhǎng)，菌株J4、J9仍有較好的生長(zhǎng)能力。而當(dāng)糖濃度為500 g/L時(shí)，只有菌株J9還具有較好的生長(zhǎng)活性，菌株J4的生長(zhǎng)受到抑制，菌株J6停止生長(zhǎng)。因此可以看出，在高糖濃度下菌株J4 的耐受性最優(yōu)，菌株J2的糖耐受性相對(duì)較差，在糖濃度高于400 g/L時(shí)停止生長(zhǎng)。

4 結(jié)論

從喀什地區(qū)岳普湖縣發(fā)酵驢乳中分離純化得到9株酵母菌。將菌株分離純化后接種到WL固體培養(yǎng)基中，觀察形態(tài)特征表型并結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將9株酵母菌初步鑒定為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniapora uvarum）、克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和拜爾接合酵母（Zygosaccharomyces）4類。隨后同種各選取一株活性較強(qiáng)的菌株進(jìn)行發(fā)酵特性和耐受性研究，測(cè)定了菌株在不同溫度、pH和糖濃度下的生長(zhǎng)情況。最后得出菌株J6的產(chǎn)氣能力及還原糖消耗速率較優(yōu)，說明其發(fā)酵能力相對(duì)較強(qiáng)，且在耐酸性實(shí)驗(yàn)中pH為2.0時(shí)仍具有一定的發(fā)酵能力，耐酸性也相對(duì)較優(yōu)。而菌株J4的耐溫性相對(duì)較好，各溫度下的生長(zhǎng)情況均較優(yōu)。菌株J9在不同糖濃度中均有良好的生長(zhǎng)活性，耐糖性最優(yōu)。但結(jié)合發(fā)酵特性及耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，菌株J6的綜合發(fā)酵、耐受能力較優(yōu)。在后續(xù)的研究中，對(duì)菌株J6在乳制品發(fā)酵中的風(fēng)味及潛在益生性再進(jìn)行研究篩選，以期得到一株可提升發(fā)酵乳制品風(fēng)味及功能特性的優(yōu)良菌株。

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