馬圣明，蔣志惠，谷令彪，翁少亭，邢月騰，趙國(guó)鋒，張坤朋

（1.安陽工學(xué)院，河南省獸用生物制品研發(fā)與應(yīng)用國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，河南 安陽 455000；2 安陽九頭仙艾業(yè)有限公司，河南 安陽 455000）

艾草（Artemisia argyi H. Lév. & Vaniot）是我國(guó)傳統(tǒng)道地中藥，別名艾蒿、白蒿、冰臺(tái)、灸草、艾絨等，為菊科蒿屬植物，因其全草入藥，藥圣李時(shí)珍稱其為草藥，也有草中鉆石的稱號(hào)[1-2]。古籍中將艾分為北艾、海艾和薊艾3 類，其中北艾（Artemisia argyi L. cv. Beiai）為模式種，主要分布在亞洲、歐洲及北美的溫帶、寒溫帶及亞熱帶地區(qū)[3]。我國(guó)艾草有186 種，44 變種，隸屬于2 個(gè)亞屬，廣泛分布于我國(guó)的東北、華北、華東和華南和西南等各省區(qū)[4]。北艾與海艾、蘄艾、祁艾合稱中國(guó)歷史上的“四大名艾”。特別值得關(guān)注的是，湯陰北艾是河南省地方特產(chǎn)道地中藥材，種植面積大、產(chǎn)量高，為國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，富含多種藥理活性成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理學(xué)作用[5-7]。

慢性咽炎（Chronic pharyngitis）是咽部黏膜以及黏膜下淋巴組織的慢性炎癥，通常是上呼吸道慢性炎癥的一部分[8]。中醫(yī)認(rèn)為，慢性咽炎屬于一種痰凝氣聚的情志性疾患，也被稱為“梅核氣”，主要與情志不暢關(guān)系比較密切。慢性咽炎的主要臨床表現(xiàn)為咽部不適、咽干癢、紅腫、分泌物多而灼痛、易干惡，有異物感等癥狀[9]。急性咽炎反復(fù)發(fā)作、空氣干燥、粉塵和刺激性氣體污染等均可導(dǎo)致慢性咽炎的發(fā)生[10-11]。從天然植物中尋找安全、高效的抗炎成分，是開發(fā)新型抗炎藥物的重要途徑。研究證據(jù)表明，艾草中的多種活性成分可抑制巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)和炎癥組織中炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗炎作用[12-14]?；诖?，本研究建立家兔慢性咽炎動(dòng)物模型，通過藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究及治療效果觀察，探討湯陰北艾治療家兔慢性咽炎的效果，以期豐富湯陰北艾抗炎藥理活性的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)，為臨床應(yīng)用北艾防治慢性咽炎治療藥物的開發(fā)提供重要科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 北艾和家兔

湯陰北艾采集自河南省湯陰縣伏道鎮(zhèn)，經(jīng)晾曬風(fēng)干后，用粉碎機(jī)制備成粉劑；3 月齡健康家兔40 只，雌雄各半，（1.93±0.19 ）kg。

1.2 主要試劑

氨水（CAS NO：941116）購(gòu)自四川省德陽市化學(xué)試劑廠；松節(jié)油（CAS NO：8000-41-7）購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；喉頭噴霧器購(gòu)自云南晨業(yè)醫(yī)療器械有限公司；RNA isolater Total RNA Extraction Reagent（R401-01）、HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（R323-01）、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix （Q711-02）均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 家兔慢性咽炎造模及樣品采集

40 只家兔隨機(jī)分為正常組、自然恢復(fù)組、北艾組和金銀花組，每組10 只。其中，自然恢復(fù)組、北艾組和金銀花組家兔均為慢性咽炎造模組。慢性咽炎造模方法為：家兔連續(xù)用2.5%氨水噴其咽部14 d，2 次/d；第8 天時(shí)，用扁桃體注射針將0.5 mL 松節(jié)油注射于家兔咽部黏膜下。造模完成后，隨機(jī)處死造模組和正常組家兔各1 只，取咽喉部組織制備病理切片，觀察咽部組織病理學(xué)變化。隨后，北艾組和金銀花組家兔分別用北艾粉、金銀花粉連續(xù)飲水給藥14 d，而自然恢復(fù)組正常飲水。在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，正常組家兔常規(guī)飼養(yǎng)。觀察、記錄各組家兔造模前后的臨床癥狀、咽部的粘膜形態(tài)、色澤及分泌物情況，并測(cè)量體質(zhì)量、體溫。在造模完成后，隨機(jī)挑選造模組和正常組家兔各5 只，采集耳緣靜脈血樣，檢測(cè)血常規(guī)變化，并采集家兔咽組織，制備切片，HE 染色后作病理形態(tài)學(xué)觀察。

1.4 炎性因子qPCR 檢測(cè)

利用PrimerPremier 5.0 軟件設(shè)計(jì)兔TNF-α、IL-1β、IL-6 和GAPDH 基因的特異性引物對(duì)（表1），上述引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。根據(jù)RNA isolater Total RNA Extraction Reagent 試劑盒說明書按TRIzol 法提取樣品中的RNA。參照HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒說明書計(jì)算cDNA 合成體系。參照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 說明書配制qPCR 反應(yīng)體系。使用iQ5 iCycler 檢測(cè)系統(tǒng)（Bio Rad）進(jìn)行qPCR反應(yīng)，程序?yàn)?5℃、30 s；95℃、5 s；60℃、30 s，共 40 個(gè)循環(huán)，熔解曲線的程序?yàn)?5℃、15 s；60℃、60 s，1.75℃/min 升溫至 95℃，維持15 s，升溫過程通過連續(xù)采集熒光信號(hào)生成熔解曲線。每個(gè)待測(cè)基因均做3 個(gè)qPCR 技術(shù)重復(fù)，并計(jì)算平均值，選擇對(duì)照組，采用2-ΔΔCT 法計(jì)算待測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)水平，ΔΔCT=（實(shí)驗(yàn)組目的基因CT 值-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參CT 值）-（對(duì)照組目的基因CT 值-對(duì)照組內(nèi)參基因CT）。

表1 qRT-PCR 分析基因的特異性引物對(duì)

1.5 數(shù)據(jù)分析與處理

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，用Graph Pad Prism 6 軟件中的two-way ANOVA 方法計(jì)算P 值并分析差異顯著性。**P < 0.01 表示差異極顯著；*P < 0.05 表示差異顯著；#P ≥ 0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 慢性咽炎家兔模型的建立

3 月齡家兔在氨水和松節(jié)油造模后3 d 內(nèi)采食量及精神狀態(tài)基本正常，此后部分家兔陸續(xù)出現(xiàn)活動(dòng)減少、精神萎頓、搔抓口部、采食量下降、飲水頻繁而量少、咽部充血等臨床癥狀。而在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，正常組家兔生長(zhǎng)正常。第15 天分別隨機(jī)處死造模組和正常組家兔各1 只，取咽喉部組織制備病理切片，觀察咽部組織病理學(xué)變化。結(jié)果顯示，造模組家兔咽部組織大面積壞死，大量的細(xì)胞核固縮深染、破裂或溶解消失，與周圍組織融合呈無結(jié)構(gòu)的嗜酸性物，且周圍伴有大量的中性粒細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)；而正常組家兔咽部組織未見明顯異常和炎性改變（圖1）。結(jié)果表明，家兔慢性咽炎模型造模成功。

圖1 正常組與造模組家兔咽部組織病理圖（H.E.染色，100×）

2.2 臨床癥狀

造模完成后，北艾組在連續(xù)給藥4 d 后，家兔的活動(dòng)量、精神狀態(tài)、采食量、飲水量等逐漸恢復(fù)正常，且在北艾治療給藥后第10 天，家兔咽部充血癥狀完全消失。金銀花組家兔在治療后第3 天，慢性咽炎癥狀逐漸緩解，并在金銀花連續(xù)治療8 d 后，上述癥狀體征基本恢復(fù)正常。而自然恢復(fù)組家兔在造模完成后第14 天，上述臨床癥狀體征雖有所恢復(fù)，但仍具有慢性咽炎臨床表現(xiàn)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，正常組家兔臨床體征正常，未出現(xiàn)異常表現(xiàn)。結(jié)果表明，北艾和金銀花給藥均能有效緩解家兔慢性咽炎的臨床癥狀。

2.3 體質(zhì)量及體溫

家兔在造模第4 天開始，體質(zhì)量逐漸下降，造模完成后體質(zhì)量平均下降0.12 kg。造模完成后給藥治療14 d，北艾組、金銀花組和自然恢復(fù)組家兔體質(zhì)量均逐漸回升。其中，藥物治療14 d 后，北艾組、金銀花組和自然恢復(fù)組家兔體質(zhì)量分別增加0.08 kg、0.09 kg 和0.04 kg。而正常組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，體質(zhì)量持續(xù)上升，在實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束時(shí)體重平均增加0.19 kg（表2）。此外，我們檢測(cè)家兔的體溫發(fā)現(xiàn)，家兔在造模期間體溫持續(xù)處于較高的水平（＞38.86 ℃），造模結(jié)束后，用北艾或金銀花治療的家兔體溫逐漸恢復(fù)到正常體溫（約38.5 ℃），而正常組家兔在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)體溫相對(duì)恒定（約38.5 ℃）（表3）。上述結(jié)果表明，北艾和金銀花給藥均能有效促進(jìn)慢性咽炎家兔增重，維持恒定體溫。

表2 各組家兔體質(zhì)量變化 kg

表3 各組家兔體溫變化 ℃

2.4 白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)

造模完成后，隨機(jī)挑選造模組和正常組家兔各5 只，采集耳緣靜脈血樣，檢測(cè)血常規(guī)變化。結(jié)果顯示，與正常組相比，造模組家兔白細(xì)胞（WBC）總數(shù)增多，嗜中性粒細(xì)胞降低，而淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞增加。與自然恢復(fù)組相比，在用北艾和金銀花給藥治療后，北艾組和金銀花組家兔白細(xì)總數(shù)減少，嗜中性粒細(xì)胞增多，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞減少（表4）。結(jié)果顯示，北艾和金銀花給藥可有效改善慢性咽炎家兔白細(xì)胞分類情況。

表4 各組家兔白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)

2.5 組織病理切片

造模完成后，隨機(jī)挑選造模組和正常組家兔各3 只，采集家兔咽組織，制備切片作病理形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果顯示，自然恢復(fù)組家兔咽部組織大面積壞死，大量的細(xì)胞核固縮深染、破裂或溶解消失，與周圍組織融合呈無結(jié)構(gòu)的嗜酸性物，且周圍伴有大量的中性粒細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)；北艾組和金銀花組家兔咽部組織上皮完整，有小面積水腫，結(jié)蹄組織排列疏松，并伴有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；而正常組家兔咽部組織未見明顯異常和炎性改變（圖2）。結(jié)果提示，北艾和金銀花給藥可有效減輕慢性咽炎家兔充血腫脹癥狀，改善咽部組織病變情況。

圖2 各組家兔咽部組織病理圖（H.E.染色，100×）

2.6 炎癥因子表達(dá)（mRNA 轉(zhuǎn)錄水平）

采集各組家兔咽部組織制備RNA，用qRTPCR 法檢測(cè)各組樣品炎性因子基因TNF-α、IL-1β和IL-6 的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，造模組家兔TNF-α、IL-1β和IL-6 基因轉(zhuǎn)錄水平顯著高于正常組，而北艾組和金銀花組TNF-α、IL-1β和IL-6 基因轉(zhuǎn)錄水平顯著低于自然恢復(fù)組（圖3）。結(jié)果顯示，北艾和金銀花給藥可有效抑制慢性咽炎家兔炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6 的轉(zhuǎn)錄水平。

圖3 各組家兔咽部組織炎性因子的轉(zhuǎn)錄水平

3 討論

慢慢性咽炎為咽黏膜、黏膜下及淋巴組織的慢性炎癥[8]。此前研究證據(jù)表明，艾草對(duì)多種炎性病理反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用。艾草活性成分通過調(diào)控多種代謝通路，抑制巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)和炎癥組織中炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用[12-14]。據(jù)此，本研究建立了家兔慢性咽炎模型，通過藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究及治療效果觀察，探討湯陰北艾治療家兔慢性咽炎的效果。

根據(jù)慢性咽炎的病癥及發(fā)病原因，我們用氨水和松節(jié)油復(fù)合因素建立了3 月齡家兔慢性咽炎動(dòng)物模型。氨水是堿性刺激物質(zhì)，局部噴霧反復(fù)刺激可引起咽部黏膜充血水腫，誘發(fā)慢性炎癥。而松節(jié)油是一種油質(zhì)化學(xué)因子，在黏膜下注射松節(jié)油，讓組織對(duì)其緩慢吸收，能達(dá)到對(duì)咽部持續(xù)刺激的作用，符合慢性咽炎的發(fā)病因素[15]。我們用氨水和松節(jié)油直接作用于家兔咽部，結(jié)果發(fā)現(xiàn)造模組家兔陸續(xù)出現(xiàn)活動(dòng)減少、精神狀態(tài)委頓、搔抓口部、采食量下降、飲水頻繁而量少、咽部充血等與慢性咽炎相符的臨床癥狀。此外，進(jìn)一步的病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，造模組家兔咽部組織大面積壞死，大量的細(xì)胞核固縮深染、破裂或溶解消失，與周圍組織融合呈無結(jié)構(gòu)的嗜酸性物，且周圍伴有大量的中性粒細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)；與《中藥新藥治療慢性咽炎的臨床指導(dǎo)研究原則》中慢性咽炎病理形態(tài)一致，而正常組家兔咽部組織未見明顯異常和炎性改變，提示本實(shí)驗(yàn)成功建立家兔慢性咽炎模型。

湯陰北艾是中國(guó)四大名艾之首，其化學(xué)成分主要為揮發(fā)油類、黃酮類和多糖三大類，具有抗炎、抗病毒、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[3-6]。金銀花因具有清熱解毒、清咽利喉、化痰止咳的功效已廣泛應(yīng)用于臨床，在急性、慢性咽炎的治療中有較好的療效。據(jù)此，本研究選取了金銀花粉為陽性對(duì)照組。在用北艾粉和金銀花粉連續(xù)飲水給藥治療后，家兔慢性咽炎癥狀逐漸緩解，且能促進(jìn)家兔增重，維持恒定體溫。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，慢性咽炎的發(fā)生白細(xì)胞損害或激活，以及TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎癥因子基因的過度表達(dá)密切相關(guān)。TNF-α是由活性T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，具有促進(jìn)炎癥細(xì)胞聚集活化及釋放炎癥介質(zhì)的作用，是炎癥反應(yīng)的起始因子[16]。IL-1β可通過激活內(nèi)皮細(xì)胞增加誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，與TNF-α的釋放相互促進(jìn)，是引起發(fā)熱等炎癥反應(yīng)的誘因[17]。IL-6 是導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)環(huán)境紊亂主要外因之一，可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，北艾粉飲水給藥治療可有效減輕慢性咽炎家兔充血腫脹癥狀，顯著改善咽部組織炎癥病理反應(yīng)和白細(xì)胞分類情況。同時(shí)，TNF-α、IL-1β和IL-6 轉(zhuǎn)錄水平顯著低于自然恢復(fù)組。有意思的是，同等劑量下，與陽性對(duì)照組金銀花粉飲水給藥相比，北艾粉飲水給藥取得了同樣的治療效果，二者間的各項(xiàng)病理指標(biāo)變化并無顯著差異。因此，湯陰北艾能夠有效緩解慢性咽炎癥狀，可作為慢性咽炎的潛在治療藥物，其藥物靶點(diǎn)及確切藥效機(jī)理仍有待進(jìn)一步研究。