消癌舒來(lái)源于貴州省少數(shù)民族民間驗(yàn)方,主要由斑蝥、牡蒿、牛蒡3味藥組成,具有“破血逐淤,散結(jié)消癥,攻毒蝕瘡”等功效[1-2]。民間使用發(fā)現(xiàn)其對(duì)宮頸癌具有顯著療效,故擬作為6類(lèi)新藥進(jìn)行研發(fā)。目前缺乏對(duì)消癌舒用藥安全性評(píng)價(jià)的研究,根據(jù)《藥品注冊(cè)管理辦法》[3],消癌舒屬于未在國(guó)內(nèi)上市銷(xiāo)售的由中藥、天然藥物組成的非注射給藥復(fù)方制劑,處方符合中醫(yī)藥理論,有一定的民間用藥經(jīng)驗(yàn),故采用嚙齒類(lèi)動(dòng)物,按擬臨床給藥途徑(口服)進(jìn)行急性毒性及長(zhǎng)期毒性研究進(jìn)行藥物安全性評(píng)價(jià)。通過(guò)急性毒性試驗(yàn)觀(guān)察小鼠的外觀(guān)、活動(dòng)情況、分泌物、排泄物、死亡情況及中毒反應(yīng),通過(guò)長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)觀(guān)察消癌舒長(zhǎng)期給藥后對(duì)大鼠體質(zhì)量、攝食量、血液學(xué)、血清生化、臟器系數(shù)及組織病理學(xué)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性KM小鼠60只,體重(20±2)g,由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào)為SCXK(渝)2007-2006;雌性SD大鼠120只,體重(200±20) g,由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào)為SCXK(渝)2012-0005;飼養(yǎng)于遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)動(dòng)物房。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物倫理要求。

1.2 試劑與儀器 消癌舒膠囊(由貴州景紅生物科技發(fā)展有限責(zé)任公司提供,批號(hào)為20130911,規(guī)格為0.4 g/粒)。倒置顯微鏡(日本 OLYMPUS公司);全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司);組織脫水機(jī)(德國(guó) Leica公司);石蠟包埋機(jī)(德國(guó) Leica公司)。

1.3 急性毒性試驗(yàn)

1.3.1 測(cè)定半數(shù)致死量(LD50) 雌性KM小鼠40只,分別編號(hào)并輸入Excel表格,通過(guò)計(jì)算機(jī)產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)字進(jìn)行隨機(jī)分組,每組10只,分別為消癌舒2.36、2.94、3.68、4.6 g/kg組,禁食不禁水12 h 后,單次灌胃給藥,每次0.2 mL/10 g,觀(guān)察小鼠一般情況(體重、飲食、皮毛、行為、分泌物、排泄物等)及中毒、死亡情況,連續(xù)觀(guān)察14 d[4]。

1.3.2 最大耐受量實(shí)驗(yàn) 雌性KM小鼠20只,消癌舒27.6 g/kg,分3次灌胃給藥,給藥容積0.4 mL/10 g(最大給藥容積),觀(guān)察小鼠的外觀(guān)、活動(dòng)情況、分泌物、排泄物、死亡情況及中毒反應(yīng)(中毒反應(yīng)的癥狀、嚴(yán)重程度、起始時(shí)間、持續(xù)時(shí)間、是否可逆)等,連續(xù)觀(guān)察14 d,并計(jì)算小鼠消癌舒的最大耐受量倍數(shù),小鼠的最大耐受量倍數(shù)=每只小鼠的耐受藥量/小鼠的平均體重(20 g)×成人的平均體重(50 000 g)/成人每日用量(倍)。

1.4 長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)

1.4.1 分組與給藥 雌性SD大鼠120只,適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,隨機(jī)(同上)分為4組,每組30只:空白對(duì)照組(蒸餾水)及消癌舒低(1 g/kg)、中(2.3 g/kg)、高劑量組(4.6 g/kg)。消癌舒采用雙蒸水配制成相應(yīng)濃度的混懸液,每日灌胃給藥1次,每周給藥6 d,停藥1 d,連續(xù)給藥3、6個(gè)月。分別于給藥3、6個(gè)月及停藥后1個(gè)月(恢復(fù)期),每組取10只大鼠標(biāo)本,進(jìn)行血液學(xué)、血清生化指標(biāo)及組織病理檢查[5]。

1.4.2 大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量及一般狀況檢查 試驗(yàn)期間,每日觀(guān)察動(dòng)物的外觀(guān)體征、行為活動(dòng)、腺體分泌、呼吸、糞便,攝食量(1次/周),體重(1次/周)等。

1.4.3 大鼠血液學(xué)檢查 末次給藥結(jié)束24 h后,大鼠稱(chēng)重,使用4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(50 mg/kg)[6],取腹主動(dòng)脈全血,使用全自動(dòng)的血液分析儀檢測(cè)白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血小板(PLT)、網(wǎng)織紅細(xì)胞(RETIC)計(jì)數(shù),中性粒細(xì)胞(NEUT)、淋巴細(xì)胞(LYMPH)、單核細(xì)胞(MONO)、嗜酸細(xì)胞(EO)、嗜堿細(xì)胞(BASO)百分比,血紅蛋白(HGB)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白(MCHC)濃度,紅細(xì)胞壓積(HCT)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白量(MCH)、凝血酶原時(shí)間(PT-SEC)。

1.4.4 大鼠血清生化指標(biāo)檢查 大鼠腹主動(dòng)脈取血,1 500 r/min離心15 min制備血清,使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)K+、Na+、Cl+濃度、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、尿素氮(UREA)、肌酐(CR)、血糖(GLU)、總膽紅素(TBIL)、肌酸磷酸激酶(CK)。

1.4.5 大鼠系統(tǒng)尸檢、臟器指數(shù)及病理學(xué)檢查 經(jīng)腹主動(dòng)脈采血后處死,取心臟、腦、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟、腎上腺、胸腺、子宮、卵巢稱(chēng)重并計(jì)算臟器系數(shù),計(jì)算公式:臟器指數(shù)=臟器重/體重×100%。取心臟、卵巢、子宮、乳腺、腦(大腦、小腦、腦干)、脊髓(頸、胸、腰段)、垂體、胸腺、甲狀腺、甲狀旁腺、食管、唾液腺、胃、十二指腸、空?qǐng)?、回腸、盲腸、結(jié)腸、肝臟、腎臟、腎上腺、脾臟、胰腺、氣管、肺、主動(dòng)脈、坐骨神經(jīng)、膀胱、骨髓、淋巴結(jié),使用10%福爾馬林固定48 h后進(jìn)行石蠟包埋,制備組織切片(4 μm),HE染色、光學(xué)顯微鏡采集圖像分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠急性毒性試驗(yàn) 消癌舒各組小鼠實(shí)驗(yàn)期間,一般情況良好(體重、飲食、皮毛、行為、分泌物、排泄物等),未見(jiàn)死亡,不能求出半數(shù)致死量(LD50);最大耐受量試驗(yàn)期間消癌舒組小鼠活動(dòng)正常,皮毛光滑,口、鼻、眼等未見(jiàn)異常分泌物及死亡現(xiàn)象,大小便均未見(jiàn)異常,小鼠體重逐漸增加,與對(duì)照組比較無(wú)差異。小鼠的最大耐受量倍數(shù)=每只小鼠的耐受藥量/小鼠的平均體重(20 g)×成人的平均體重(50 000 g)/成人每日用量(倍)=27.6 g/1 000 g×19.59 g/20 g×50 000 g/3.6 g(倍)=375(倍)。

2.2 大鼠長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)

2.2.1 大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量及一般狀況檢查 各組大鼠進(jìn)食與活動(dòng)均正常,均未出現(xiàn)呼吸異常、嘔吐、流涎或腹瀉等現(xiàn)象,大小便正常。給藥3個(gè)月,消癌舒各劑量組大鼠體重下降,其中高劑量組體重下降最明顯,與空白對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);給藥6個(gè)月及停藥1個(gè)月,消癌舒各劑量組大鼠的體重亦無(wú)顯著變化(圖1)。給藥3個(gè)月,消癌舒各劑量組大鼠攝食量與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異;給藥6個(gè)月,中、高劑量組攝食量有所降低,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。停藥1個(gè)月消癌舒各劑量組大鼠的攝食量均恢復(fù)正常(圖1)。

A:大鼠攝食量變化;B:大鼠體重變化;*、**:與對(duì)照組比較,給藥3個(gè)月n=30,給藥6個(gè)月n=20,恢復(fù)期1個(gè)月n=10。

2.2.2 消癌舒連續(xù)給藥對(duì)大鼠血液學(xué)的影響 消癌舒連續(xù)給藥3個(gè)月,給藥組RBC、HGB、HCT、MCHC、PLT增加,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05),其它血液學(xué)指標(biāo)未見(jiàn)異常(表1)。消癌舒連續(xù)給藥6個(gè)月,給藥組NEUT增加、LYMPH降低,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),其它血液學(xué)指標(biāo)未見(jiàn)異常(表2)。消癌舒停藥1個(gè)月血液學(xué)指標(biāo)均未見(jiàn)異常(表3)。

表1 消癌舒連續(xù)給藥3個(gè)月對(duì)大鼠血液學(xué)的影響

表2 消癌舒連續(xù)給藥6個(gè)月對(duì)大鼠血液學(xué)的影響

表3 消癌舒停藥1個(gè)月(恢復(fù)期)對(duì)大鼠血液學(xué)的影響

2.2.3 消癌舒連續(xù)給藥對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響 消癌舒連續(xù)給藥3個(gè)月,各項(xiàng)血清生化指標(biāo)未見(jiàn)異常(表4)。消癌舒連續(xù)給藥6個(gè)月,給藥組TP、ALB降低,UREA、GLU增加,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其它血清生化指標(biāo)未見(jiàn)異常(表5)。消癌舒停藥1個(gè)月血清生化指標(biāo)均未見(jiàn)異常(表6)。

表4 消癌舒連續(xù)給藥3個(gè)月對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響

表5 消癌舒給藥6個(gè)月對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響

表6 消癌舒停藥1個(gè)月(恢復(fù)期)對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響

2.2.4 消癌舒連續(xù)給藥對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響 消癌舒連續(xù)給藥3、6個(gè)月及停藥1個(gè)月大鼠各臟器指數(shù)(心臟、肺臟、胸腺、肝臟、脾臟、腎臟、腎上腺、卵巢、子宮、腦)與空白對(duì)照組比較均無(wú)明顯變化(表7～9)。

表7 消癌舒連續(xù)給藥3個(gè)月對(duì)大鼠臟器指數(shù)的影響

表8 消癌舒連續(xù)給藥6個(gè)月對(duì)大鼠臟器指數(shù)的影響

表9 消癌舒停藥1個(gè)月(恢復(fù)期)對(duì)大鼠臟器指數(shù)的影響

2.2.5 消癌舒連續(xù)給藥對(duì)大鼠臟器組織形態(tài)學(xué)的影響 消癌舒連續(xù)給藥3、6個(gè)月及停藥1個(gè)月大鼠各臟器(心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、等)大體檢查未發(fā)現(xiàn)明顯病變,組織病理學(xué)檢查各臟器均未見(jiàn)明顯的與供試品毒性有關(guān)的病理病變(圖3)。

A:空白組;B高劑量組;HE, ×200。

3 討論

消癌舒膠囊主要成分斑蝥、刺梨、牡蒿具有抗腫瘤[7-9]、抗病毒[10]、抗氧化[11-13]和免疫調(diào)節(jié)[14-15]等活性,本課題組前期藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[1-2],消癌舒明顯抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖及遷移,對(duì)小鼠宮頸癌細(xì)胞株U14移植瘤及人宮頸癌Hela細(xì)胞裸鼠移植瘤具有明顯抑制作用,同時(shí)消癌舒還具有顯著的抗炎和鎮(zhèn)痛作用。

KM小鼠急性毒性研究發(fā)現(xiàn),消癌舒毒性較低,未能測(cè)出半數(shù)致死量,故采用最大耐受量試驗(yàn)。即灌胃給予最大溶解度最大容積的消癌舒27.6 g/kg,24 h內(nèi)分3次給藥,結(jié)果發(fā)現(xiàn)消癌舒組小鼠外觀(guān)正常,未見(jiàn)活動(dòng)減少,嗜睡、蜷縮、松毛等現(xiàn)象,無(wú)小鼠死亡,眼、耳、口、鼻未見(jiàn)異常分泌物,體重逐漸增加,與空白組比較無(wú)明顯差異。說(shuō)明在此最大給藥劑量下(27.60 g/kg),消癌舒對(duì)小鼠無(wú)明顯急性毒性反應(yīng),其耐受量是人用量的375倍。

消癌舒對(duì)SD大鼠進(jìn)行長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)結(jié)果表明,消癌舒1、2.3、4.6 g/kg(約相當(dāng)于臨床劑量3、6、12 倍)給藥后,消癌舒各劑量組大鼠的體重及攝食量在給藥初期均有降低,后期均恢復(fù)正常,說(shuō)明消癌舒在給藥早期引起的大鼠體重及攝食量下降可能是因?yàn)楣辔复碳に鶎?dǎo)致,與藥物關(guān)系不大。消癌舒給藥180 d,給藥組NEUT、UREA、GLU增加,LYMPH、TP、ALB降低,其它血液學(xué)及血清生化指標(biāo)未見(jiàn)異常,消癌舒停藥1個(gè)月后,所有血液學(xué)及血清生化指標(biāo)均恢復(fù)正常。消癌舒給藥3、6個(gè)月及恢復(fù)期各劑量組大鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦、卵巢、子宮等臟器系數(shù)均未見(jiàn)明顯異常,臟器系數(shù)能夠反映藥物對(duì)臟器的影響,反映該實(shí)質(zhì)器官發(fā)生萎縮、退行性改變,充血、水腫、增生及肥大等變化[16]。組織病理學(xué)檢查各臟器均未見(jiàn)明顯的與供試品毒性有關(guān)的病理病變。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明消癌舒為無(wú)毒或低毒,臨床用藥量安全,為后續(xù)的臨床用藥試驗(yàn)提供了理論支撐。