高效液相色譜法同時測定艾絨中4 種成分

任榮軍，湛建峰△，陳虹球，盧大良，江宏池

（1. 湖南省岳陽市檢驗檢測中心，湖南 岳陽 414022； 2. 湖南理工學(xué)院，湖南 岳陽 414006； 3. 湖南省高圣生物科技股份有限公司，湖南 岳陽 414301）

艾絨是制作灸療用品的主要原料，其質(zhì)量直接影響臨床效果［1-5］。其為菊科植物艾Artemisia argyiLévl. et Van. 的葉片及葉桿經(jīng)反復(fù)曬杵、捶打、碾碎，篩去梗，去除雜質(zhì)及微小粉塵而得到的細(xì)軟絨狀物。2020 年版《中國藥典（一部）》艾葉項下炮制品僅收載了醋艾炭，而未收載艾絨［6］，同時，全國共有15 個?。ㄗ灾螀^(qū)）市的中藥炮制規(guī)范中收載了艾絨及其炮制方法，但無相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容。有研究報道，艾葉中酚酸類含量達(dá)3.28%～4.81%，是主要潛在的藥效活性物質(zhì)之一［6-10］。鑒于此，本研究中建立了同時測定艾絨中綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C 含量的高效液相色譜（HPLC）法，以為其質(zhì)量控制提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2695e/2489 型高效液相色譜儀，含二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；XS-105型電子分析天平（梅特勒- 托利多儀器< 上海> 有限公司，精度為0.01 mg）；SB 5200D 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥

綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110753 - 201716，含量99.3%）；異綠原酸A 對照品（批號為B21539，含量98%），異綠原酸B 對照品（批號為B21540，含量98%），異綠原酸C 對照品（批號為B21541，含量98%），均購自上海源葉生物科技有限公司；艾絨樣品（湖南省高圣生物科技股份有限公司，批號分別為20210101，20210201，20210301，等級分別為1，2，3 級，編號分別為S1，S2，S3）；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C1（82）100A柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min 時10%A →12%A，10～15 min時12%A →20%A，15～35 min 時20%A →28%A，35～36 min 時28%A →90%A，36～40 min 時90%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：325 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μL［11-14］。

2.2 溶液制備

分別取綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C對照品9.86 mg、10.48 mg、11.86 mg、12.02 mg，精密稱定，置同一20 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得混合對照品貯備液；精密量取1 mL，置25 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容，即得混合對照品溶液。取樣品0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理30 min，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗：精密量取2.2項下混合對照品溶液、供試品溶液各適量，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜圖中，在與混合對照品溶液色譜圖相應(yīng)位置有色譜峰，且分離度均大于1.5，理論板數(shù)按待測成分峰計均大于3 000。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Chlorogenic acid 2.Isochlorogenic acid B 3.Isochlorogenic acid A 4.Isochlorogenic acid CA.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.2項下混合對照品溶液（含綠原酸19.58μg/mL、異綠原酸A 20.54μg/mL、異綠原酸B 23.25 μg/ mL、異綠原酸C 23.56 μg/ mL）2，5，10，15，20μL，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（X，ng）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果（n=5）Tab.1 Results of the linear relation test（n = 5）

精密度試驗：精密吸取2.2項下混合對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C峰面積的RSD分別為0.92%，0.30%，0.34%，0.33%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密量取2.2 項下供試品溶液適量，室溫下分別于0，2，4，8，12，24 h時按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C 峰面積的RSD分別為1.02%，0.34%，0.32%，0.31%（n=6），表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取同一樣品適量，精密稱定，共6 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算平均含量。結(jié)果綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C的平均含量分別為0.409，1.841，0.379，0.893 mg/ g，RSD分別為1.72%，1.72%，1.44%，1.32%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：稱取已知含量的同一樣品（綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C 的平均含量分別為0.409，1.841，0.379，0.893 mg/g）約0.5 g，精密稱定，分別精密加入混合對照品貯備液（含綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C 0.489 5，0.524 0，0.593 0，0.601 0 mg/ mL）1 mL，水浴蒸干，按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n = 6）

耐用性考察：精密稱取樣品（編號S1）適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件［色譜柱分別為Phenomenex Luna C18（2）100A 柱和Topsil C18柱，規(guī)格均為（250 mm × 4.6 mm，5 μm）］進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結(jié)果表明，色譜柱發(fā)生變化時，本方法能滿足試驗要求，耐用性良好。

2.4 樣品含量測定

取樣品各適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.3 Results of the content determination of four components in samples（mg / g，n = 3）

3 討論

現(xiàn)有報道對艾絨的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究較少，而采用HPLC法檢測其活性成分含量的研究尚未見報道。武娟等［12］以蘄艾艾絨為研究對象，從揮發(fā)油、總黃酮含量、燃燒熱值等方面進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，筆者既往以湘艾艾絨為研究對象，在薄層鑒別、色值、總灰分、含絨量等方面對艾絨的等級分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了探索性研究，在薄層鑒別上采用艾葉作為對照藥材，檢視條件相比2020 年版《中國藥典（一部）》［6］增加了熒光檢視，可有效鑒別艾絨及其常見偽品青蒿；在等級標(biāo)準(zhǔn)研究中采用色值、總灰分和含絨量3個指標(biāo)參數(shù)，可較好地對不同的艾絨樣品進(jìn)行等級劃分。基于以上數(shù)據(jù)，本研究中擬建立能同時測定艾絨中4種成分含量的HPLC法。

預(yù)試驗中，考察比較了甲醇- 0.4%磷酸水溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液2 種流動相（等度洗脫），結(jié)果發(fā)現(xiàn)待測成分分離效果均不理想，又選擇后者進(jìn)行梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)主峰峰形和分離度均較好；提取溶劑分別選擇20%，50%，70%，90%甲醇，結(jié)果以50%甲醇提取時4種成分提取率均較高；考察比較了加熱回流與超聲處理2 種方法，提取結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，故選擇簡便快速的超聲處理；同時考察了超聲處理30，60，90 min時的效果，結(jié)果無顯著差異，故選擇超聲處理30 min。樣品含量測定結(jié)果表明，樣品含絨量越高等級越高、4 種酚酸類成分含量越低。艾絨在制作過程中，篩選次數(shù)越多，含絨量和純度越高，含艾葉碎片就越少，由此推斷，艾絨中酚酸類成分主要存在于葉肉碎片中，但需通過分揀艾葉不同部位進(jìn)行進(jìn)一步檢測加以證明。

綜上所述，本研究中建立的HPLC 法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于艾絨的質(zhì)量控制。