靜水壓法誘導虹鱒三倍體試驗

摘" 要：以虹鱒（Oncorhynchus mykiss）二倍體雌魚為母本，二倍體偽雄魚為父本，采用靜水壓法，研究誘導虹鱒三倍體的產(chǎn)生，初步探索靜水壓法誘導虹鱒三倍體的適宜條件。結果顯示，虹鱒三倍體誘導率受處理起始時間、處理壓力和持續(xù)時間的影響。靜水壓誘導虹鱒三倍體的最佳條件為處理起始時間30 min～40 min，靜水壓壓力65 MPa～70 MPa，持續(xù)時間4 min～6 min。

關鍵詞：虹鱒（Oncorhynchus mykiss）；三倍體；靜水壓法

中圖分類號：S961.2；S965.122文獻標志碼：A

文章編號：1674-2419（2024）06-0701-04

虹鱒（Oncorhynchus mykiss）屬鮭形目（Salmoniformes）、鮭科（Salmonidae）、大麻哈魚屬（Oncorhynchus），是中國主養(yǎng)的冷水魚品種之一。因其營養(yǎng)價值高、口感豐富、無肌間刺、易加工制作，備受消費者喜愛，因此人們對虹鱒的需求旺盛，虹鱒人工養(yǎng)殖行業(yè)得以迅速完善[1]。虹鱒三倍體即不育虹鱒，與普通虹鱒相比，具有個體大、生長速度快、養(yǎng)殖周期短、餌料系數(shù)低、肉質(zhì)品質(zhì)高、抗病力強、商品價值高等優(yōu)點[2-6]。虹鱒三倍體苗種18月齡可生長到3 kg以上，是制作生魚片的理想魚類，相比于虹鱒二倍體，養(yǎng)殖利潤可增加30%左右[3]。因此，開展虹鱒三倍體育種研究對虹鱒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重大意義。

目前，中國大多采用熱休克法誘導虹鱒三倍體，但熱休克法會對虹鱒的受精卵造成某種程度的損傷。靜水壓法的原理是利用均質(zhì)流體（如水）對物體施加全方位且均勻的壓力，抑制細胞第二極體的排出而產(chǎn)生三倍體的過程。與熱休克法相比，靜水壓法對受精卵的刺激相對較小且處理時間較短，效果優(yōu)于熱休克法[7]。該試驗以二倍體雌魚為母本，二倍體偽雄魚為父本，采用靜水壓法，研究誘導虹鱒三倍體的適宜條件。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

受精卵的采集、孵化及靜水壓誘導的過程、在石河子瑪河鱒魚園進行，倍性鑒定在新疆天蘊有機農(nóng)業(yè)有限公司尼勒克縣實驗室進行。

1.2 試驗材料

選擇體表無傷、健康活潑、性腺發(fā)育良好的3+齡二倍體雌魚和二倍體偽雄魚作為親魚，雌雄比例2∶1。

1.3 試驗儀器

靜水壓力機（型號APVM 2.7），流式細胞儀（型號CyFlow Cube 8）。

1.4 試驗方法

1.4.1 采精和采卵

在室外采卵過程中利用遮陽傘、網(wǎng)保障全程避光。采精、卵前將魚體擦拭干凈，避免水、污物流入采集好的精、卵中。將精液采集至燒杯中，避光在5℃～10℃的低溫保存；將卵擠入塑料盆中，每10萬粒卵加入精液5 mL。

1.4.2 人工授精

人工授精應在避光環(huán)境中進行，授精方式為干法授精[8]。將精液加入盛有卵的塑料盆中，加入清水激活精子，用羽毛輕輕攪拌，使精卵充分接觸。再加入少量清水，快速而均勻地攪拌1 min，再換水攪拌2～3次，盡量去除過量的精液、未受精的死卵和血塊等雜物。漂洗完成后，受精卵需遮光分組靜置。

1.4.3 加壓實驗

采用單因素實驗法，在水溫8℃～10℃左右條件下，設置20 min、30 min、40 min 3個處理起始時間梯度，起始時間是指從精子卵子受精后漂洗完成，進行遮光靜止時開始計時，至放入靜水壓力機達到既定壓力的時間；60 MPa、65 MPa、70 MPa 3個處理壓力；4 min、5 min、6 min 3個加壓持續(xù)時間。

采用靜水壓法進行虹鱒三倍體的誘導，利用靜水壓力機對虹鱒的受精卵進行一定強度的靜水壓處理。待到既定的受精時間，將靜置后的受精卵倒入靜水壓力機內(nèi)的小鋼桶內(nèi)，勻速加壓至既定壓力后，開始計時，待到達處理壓力的持續(xù)時間后，緩慢逐步進行梯度降壓至常壓，每組用卵約2 000粒。三倍體虹鱒誘導試驗方案見表1。

1.4.4 受精卵孵化

受精卵采用常規(guī)桶式孵化器流水孵化，孵化室內(nèi)進行遮光處理，保證受精卵孵化階段所需的暗光條件，并減少振動。每周使用亞甲基藍對受精卵進行消毒處理。當孵化積溫達到220℃·d，胚胎出現(xiàn)黑色眼點后，統(tǒng)計受精卵成活率。

1.4.5 倍性鑒定

分別在受精卵發(fā)眼階段、魚苗上浮階段、魚苗全長3 cm～4 cm時采用流式細胞儀（CyFlow Cube 8）進行三倍體虹鱒的倍性鑒定[9]，以二倍體虹鱒血液為對照組，通過分析紅細胞細胞核中相對DNA含量確定倍性，三倍體虹鱒紅細胞的DNA含量為二倍體的1.5倍左右。

2 結果

2.1 處理起始時間的確定

靜水壓法誘導虹鱒三倍體，不同處理起始時間的誘導結果見圖1。從圖中可以看出，在處理壓力為70 Mpa，靜水壓持續(xù)時間為4 min時，處理起始時間為20 min時和處理起始時間為30 min、40 min的受精卵成活率和三倍體率之間均存在顯著差異（P＜0.05），處理起始時間為30 min和40 min的受精卵成活率和三倍體率均不存在顯著差異（P＞0.05）。受精卵成活率和三倍體率隨著處理起始時間的延長，均呈現(xiàn)上升趨勢。

綜合以上分析，在處理壓力為70 Mpa，壓力持續(xù)時間為4 min時，最佳處理起始時間為40 min。

2.2 靜水壓持續(xù)時間的確定

靜水壓法誘導虹鱒三倍體，不同靜水壓持續(xù)時間的誘導結果見圖2。從圖中可以看出，在處理起始時間為40 min，處理壓力為70 Mpa時，靜水壓持續(xù)時間為4 min和持續(xù)時間為5 min、6 min的受精卵成活率之間存在顯著差異（P＜0.05），靜水壓持續(xù)時間為4 min、5 min、6 min時受精卵三倍體率均不存在顯著差異（P＞0.05）。受精卵成活率隨著靜水壓持續(xù)時間的延長，呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。受精卵三倍體率隨著處理起始時間的延長，呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢。

綜合以上分析，在處理起始時間為40 min，處理壓力為70 Mpa時，最佳靜水壓持續(xù)時間為4 min。

2.3 靜水壓處理壓力的確定

靜水壓法誘導虹鱒三倍體，不同靜水壓壓力的誘導結果見圖3。從圖中可以看出，在處理起始時間為40 min，靜水壓持續(xù)時間為6 min時，靜水壓壓力為60 Mpa、65 Mpa、70 Mpa時受精卵成活率之間均存在顯著差異（P＜0.05），受精卵三倍體率均不存在顯著差異（P＞0.05）。受精卵成活率隨著靜水壓壓力的增大，呈現(xiàn)下降的趨勢。受精卵三倍體率隨著靜水壓壓力的增大，呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢。

綜合以上分析，在處理起始時間為40 min，靜水壓持續(xù)時間為6 min時，最佳處理壓力為65 Mpa。

3 討論

該試驗中，受精卵的成活率和孵化率較低，分析原因主要有以下兩點：一是親魚的質(zhì)量不佳，導致受精卵質(zhì)量差，成活率低；二是操作手法不夠熟練，操作方式有待改進，在加壓操作過程中反復傾倒轉(zhuǎn)運受精卵產(chǎn)生的振動可能會影響成活率。三是孵化環(huán)境有待改善，孵化水溫不穩(wěn)定也是影響孵化率的因素之一。

加壓起始時間是影響靜水壓法誘導虹鱒三倍體的因素之一，加壓起始時間是指從精子卵子受精后漂洗完成，進行遮光靜止時開始計時，放入靜水壓力機達到既定壓力的時間。在該試驗中，加壓起始時間為30 min、40 min相比于加壓起始時間為20 min的受精卵成活率和三倍體率顯著上升，在40 min時達到最高。該試驗結果顯示，隨著加壓起始時間的延長，受精卵成活率和三倍體率均呈現(xiàn)上升趨勢，這與陳落落等[7]研究結果基本一致。陳落落等[7]的研究表明，采用靜水壓法的起始時間處于10 min～30 min的時間

范圍內(nèi)，虹鱒受精卵的發(fā)眼率及上浮率皆隨著起始時間的增加而顯著提高，在30 min時達到頂峰，初步確定了誘導虹鱒三倍體最優(yōu)的起始時間在30 min～35 min內(nèi)，該研究還指出，虹鱒受精卵在未吸水之前較軟具有黏性，隨著胚胎吸水膨脹，其對外界的水溫、靜水壓等理化因子的抵抗力會隨之上升，更有利于虹鱒三倍體的誘導，該試驗也印證了這一觀點。

該試驗采用靜水壓法人工誘導虹鱒三倍體，通過對照實驗，篩選出誘導虹鱒三倍體的最佳條件為：受精卵靜置40 min后，在65 MPa的靜水壓力下處理4 min，此條件下受精卵成活率和三倍體率最高。

參考文獻：

[1]劉翰吉.低魚粉飼料中添加色氨酸對三倍體虹鱒生長性能、抗氧化機能及腸道健康的影響[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學，2021.

[2]王慶龍.金鱒和虹鱒繁殖與育種關鍵技術研究[D].青島：中國海洋大學，2014.

[3]李復永，孫學禮.虹鱒魚三倍體的人工繁育試驗[J].河北漁業(yè)，2015（10）：59-61.

[4]龍強，宗虎民，陳冰君.虹鱒魚三倍體的育種技術[J].北京水產(chǎn)，2004（5）：36-37.

[5]沈希順，李立海，王昭明.虹鱒魚三倍體生產(chǎn)規(guī)模制種技術研究[J].北京水產(chǎn)，2005（1）：37-41.

[6]TIWARY B K， KIRUBAGARAN R， RAY A K.The Biology of Triploid Fish[J]. Reviews in Fish Biology and Fisheries， 2004，14（4）：391-402.

[7]陳落落，溫海深，李吉方，等.靜水壓法誘導虹鱒三倍體技術研究[J].水產(chǎn)研究， 2019，6（2）：53-62.

[8]張榮吉，賈鐘賀，王炳謙.虹鱒親魚培育與人工繁殖技術[J].黑龍江水產(chǎn)，2009（3）：7-9.

[9]王偉，柳廣昊，姜旭陽，等.三倍體虹鱒制種技術與倍性鑒定[J].黑龍江水產(chǎn)，2014（4）：26-29.

Triploid test of Oncorhynchus mykiss induced by hydrostatic pressure

SHI Chunming1， LI Chunyu2， YANG Bowen1， ZHANG Yu1， JIAO Fei1， XING Junxia1， HAN Ruibang2， CAI Lingang1

（1.Xinjiang Institute of Fishery Science， Urumqi 830000， Xinjiang China; 2. Xinjiang Tianyun Organic Agriculture Co.， LTD.， Nilek 835700， Xinjiang China）

Abstract：Using the diploid female of rainbow trout （Oncorhynchus mykiss） as the mother and the diploid pseudomale as the father， the hydrostatic pressure method was used to induce triploid of rainbow trout， and the appropriate conditions for inducing triploid of rainbow trout by hydrostatic pressure method were initially explored. The results showed that the triploid induction rate of rainbow trout was affected by the initial time， pressure and duration of treatment. The optimum conditions for inducing triploid of rainbow trout by hydrostatic pressure were the initial treatment time of 30 min～40 min， hydrostatic pressure of 65 MPa～70 MPa， and duration of 4 min～6 min.

Keywords：Oncorhynchus mykiss; Triploid; Hydrostatic method

基金項目：新疆維吾爾自治區(qū)重點研發(fā)任務專項（2022B02006）。

作者簡介：時春明（1997- ）男，高級農(nóng)藝師。研究方向：瀕危魚類的養(yǎng)殖和漁業(yè)工程。E-mail：1006487270@qq.com。