摘要：[目的]分析亞硒酸鈉葉面噴施后對香榧（Torreya grandis）幼苗葉片代謝組的影響，探究亞硒酸鈉噴施后香榧葉片次生代謝物的累積情況及其對果實品質(zhì)的影響。[方法]以苗齡2年的香榧幼苗為供試材料，葉面噴施亞硒酸鈉（濃度為100 μg·L-1）2次，間隔15 d。第二次噴施后15 d，采取1年生葉片進行代謝組分析，以色譜．質(zhì)譜研究香榧幼苗葉片代謝物差異。[結(jié)果]在正離子模式下，處理組和對照組之間有909種差異代謝物，其中69種顯著變化（27種顯著上調(diào)，42種顯著下調(diào)）。在負離子模式下，出現(xiàn)433種差異代謝物，其中43種顯著變化（11種顯著上調(diào)，32種顯著下調(diào)）。對人體有益的一些次生代謝物顯著增加，如車前苷（2.827倍）、川芎內(nèi)酯（2.524倍）、6．唾液乳糖（2.021倍）、阿齊沙坦（1.931倍）。[結(jié)論]香榧葉片噴施亞硒酸鈉有利于促進對人體有益的次生代謝物的生物合成及其在葉片中的累積。

關(guān)鍵詞：香榧；硒肥；代謝組；生物強化

中圖分類號：S791.53 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2024）03-0203-10

硒是人體所必需的微量營養(yǎng)元素，隨著食物鏈進入人體，以兩種形式影響人體的健康。其一，參與蛋白的生物合成。在人體中，幾種氨基酸含有硒元素，如硒代半胱氨酸和硒代甲硫氨酸。含有這樣氨基酸的蛋白被稱為硒蛋白。在人的基因組中，有25個基因編碼硒蛋白，如谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）中的GPX1、GPX2、GPX3、GPX4和GPX6，氧還原蛋白還原酶（TXNRD）中的TXNRD1、TXRND2和TXRND3，碘化甲腺氨酸脫碘酶（DIO）中的Dl01、D102和D103c2]。其二，硒元素以配位體的形式參與蛋白的活動。例如，硒作為配位體參與調(diào)節(jié)硒結(jié)合蛋白SBP1的活動。這些蛋白在人體中具有多種重要的生理活動，如上述的GPXs可以作為抗氧化酶起作用，TXNRDs則在氧化還原信號轉(zhuǎn)導過程中起作用，DIOs參與甲狀腺激素的生物合成。人體對硒的攝入量將影響上述蛋白的生物合成及其活動。如果日常飲食中硒攝入量過多，則引起硒中毒。然而，日常飲食中硒攝入量偏少，則引起人體各種疾病。據(jù)統(tǒng)計，高達80%的人群經(jīng)歷過飲食性硒缺乏。硒攝入量不足引起的疾病中，最著名的例子就是克山病和卡斯欽-貝克病?？松讲〉陌l(fā)生與人體GPX1活動低下有關(guān)，硒元素的補充可以阻止克山病的發(fā)生。在卡斯欽·貝克病發(fā)生過程中，硒則與抗氧化和甲狀腺功能的維持有關(guān)。此外，硒的攝入量不足，還會引起其它疾病，如心臟病、癌癥、腮腺疾病等。因此，硒的足量攝人可以消除這些疾病，還可以用于治療南美洲錐蟲病。世界上許多國家，針對本國人群的身體狀況以及當?shù)氐乃林形暮?，制定了各自的硒攝人標準。

在日常生活中，人們可以通過飲食強化的方式來解決硒攝入不足的問題。鑒于硒的毒性，這種強化方式以生物強化為宜。植物的硒生物強化可以通過多種方式進行，如通過對植物有益的微生物的作用和葉面施用亞硒酸鈉、硒酸鈉、硒酸鉀。目前，人們已通過硒生物強化的方式來栽培一些農(nóng)作物、水果、蔬菜以及食用與藥用菌類，如水稻、大豆、小麥、蘋果、猴頭菇、靈芝、羽衣甘藍、薄葉二行芥、羊萵苣以及生菜和菠菜。堅果是人們?nèi)粘Ｊ秤玫男蓍e果品，也可以用于烘焙食品的生產(chǎn)，目前關(guān)于堅果類產(chǎn)品的硒生物強化研究報道較少，僅見巴西堅果。

近些年來，香榧（Torreya grandis Fort. exLindl.）果實作為休閑食品在我國越來越受到人們的青睞，對新品種選育及其產(chǎn)量研究尤受重視，但對其果實的硒生物強化研究很少。作者曾在施用硒肥條件下使用植物根內(nèi)生真菌印度梨形孢與香榧共生以促進其硒的累積。本研究對香榧幼苗葉片施加葉面肥亞硒酸鈉，然后對其代謝組進行了分析，以期了解硒葉面肥對香榧葉片代謝的影響，探討硒葉面肥的吸收轉(zhuǎn)化以及有益于人體健康的次生代謝物的累積。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料的培養(yǎng)及其硒肥處理

60株香榧實生幼苗從四川省雅安市業(yè)之欣種植專業(yè)合作社購買，苗齡2年。將每株香榧幼苗定植于1個塑料花盆（高30 cm，直徑25 cm）中。每盆裝入等量的園藝培養(yǎng)基質(zhì)（山東莘縣一畝田農(nóng)業(yè)科技有限公司生產(chǎn)）。將花盆連帶香榧幼苗移入人工智能溫室。根據(jù)培養(yǎng)基質(zhì)的濕度進行水分的日常管理。栽培1年后，將60株幼苗隨機分成2組，每組30株，對其中一組的葉片噴灑亞硒酸鈉（濃度為100 μg·L-1），另一組作為對照，噴灑去離子水，均以葉面全部噴濕為度。15 d后再重復1次。第二次噴施葉面肥后15 d時采樣。本研究只取幼苗中上部枝條上葉齡為1年的葉片為非靶向代謝組分析的實驗材料。采樣時，因考慮到每株所采的1年葉片數(shù)量不足，因而隨機采取2棵幼苗上的1年葉片合并為1個樣品。處理組和對照組各6個樣品，共計12個樣品。取樣后迅速以無菌水進行4次清洗，然后以液氮進行處理，保存于-80℃冰箱以待分析。

1.2 非靶向代謝組實驗方法

1.2.1 代謝物的提取

首先取100 mg液氮研磨的組織樣本，置于EP管中，加入500 μL的80%甲醇水溶液；然后進行渦旋震蕩，冰浴靜置5 min，離心20 min（15 000 g，4℃）。取一定量的上清加質(zhì)譜級水稀釋至甲醇含量為53%．離心20 min（15 000 g，4℃），收集上清，進樣LC-MS進行分析。所有樣品均采用正負離子化模式分析。

色譜儀采用Thermo Fisher（型號：VanquishUHPLC，德國）。液相色譜分析的條件如下：采用Hypersil Gold column （C18）色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），其柱溫：40℃；流速：0.2mL·min-1。正離子化模式下，流動相A：0.1%甲酸；流動相B：甲醇。負離子化模式下，流動相A：5 mmol·L-1醋酸銨，pH 9.0；流動相B：甲醇。液相色譜梯度洗脫程序如表1所示：

質(zhì)譜儀采用Fermo Fisher（型號：Q ExactiveTMHF，德國）。質(zhì)譜條件如下：掃描范圍選擇m/z100～1 500；ESI源的設(shè)置如下：噴霧電壓：3.5kV;鞘氣流速：35 psi；輔助氣流速：10 L·min-1;離子傳輸管溫度：320℃；離子導入射頻電平：60；輔助氣加熱器溫度：350℃；極性：正負離子化模式；MS/MS二級掃描為數(shù)據(jù)依賴性掃描。氮氣（純度≥99.999%）用作碰撞氣以便產(chǎn)生碎片離子，其能量水平設(shè)置為正常碰撞能量的30%。

1.2.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理和代謝物鑒定

首先將質(zhì)譜檢測得到的原始文件（.raw）導人CompoundDiscoverer 3.1（以下簡稱CD3.1）搜庫軟件中進行處理，對每個代謝物進行保留時間、質(zhì)荷比（m/z）等參數(shù)的簡單篩選，然后設(shè)置保留時間偏差0.2 min和質(zhì)量偏差5 mg·kg-1對不同樣品進行峰對齊，使鑒定更準確，隨后設(shè)置質(zhì)量偏差5 mg·kg-1、信號強度偏差30%、信噪比3、最小信號強度、加合離子等信息進行峰提取，同時對峰面積進行定量，再整合目標離子，然后通過分子離子峰和碎片離子進行分子式的預(yù)測，并與mzCloud（https：//www.mzcloud.org/）、mzVault和Masslist數(shù)據(jù)庫進行比對，用blank樣本去除背景離子，將原始定量結(jié)果依據(jù)公式：樣本原始定量值／（樣本代謝物定量值總和/QC1樣本代謝物定量值總和），進行標準化處理，得到相對峰面積；并將質(zhì)量控制（QC）樣本中相對峰面積的變異系數(shù)（CV）大于30%的化合物刪除，最后得到代謝物的鑒定和相對定量結(jié)果。數(shù)據(jù)處理部分基于Linux操作系統(tǒng)（CentOS版本6.6）以及R語言軟件包和Python軟件包進行，其中代謝物定性和定量分析采用Python軟件（Python-3.5.0）；代謝物分類、QC樣本控制、總樣品PCA分析均采用R語言（R-3.4.3）。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用KEGG數(shù)據(jù)庫（https：//www.genome.j p/kegg/pathway.html）、HMDB數(shù)據(jù)庫（https：//hmdb.ca/metabolites）和LIPIDMaps數(shù)據(jù)庫（http：//www.lipidmaps.org/）對鑒定到的代謝物進行注釋。多元統(tǒng)計分析部分，使用代謝組學數(shù)據(jù)處理軟件metaX[6]對數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)換后進行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判別分析（PLS-DA），進而得到每個代謝物的VIP值。單變量分析部分，基于t檢驗來計算各代謝物在兩組間統(tǒng)計學顯著性（P值），并計算代謝物在兩組間的差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）。差異代謝物篩選的默認標準為變量投影重要度（VariableImportance in the Projection， VIP）gt;1，P值＜0.05且FC≥2或FC≤0.5?；鹕綀D用R軟件包ggplot2繪制，可以綜合代謝物的VIP值、log2（FoldChange）和-logl0（p值）3個參數(shù)，來篩選感興趣的代謝物。聚類熱圖，用R軟件包Pheatmap進行繪制，使用z-score對代謝物數(shù)據(jù)進行歸一化。差異代謝物之間的相關(guān)性分析（Pearson相關(guān)系數(shù)）使用R語言中的cor（）進行，統(tǒng)計顯著性通過R語言中cor.mtest（）實現(xiàn)，P值＜0.05為在統(tǒng)計學上顯著，并用R語言中的corrplot軟件包繪制相關(guān)性圖。KEGG途徑氣泡圖用R語言中的軟件包ggplot2進行繪制。使用KEGG數(shù)據(jù)庫來研究代謝物的功能和代謝途徑，當xlngt;ylN時，認為該代謝途徑富集（其中，x為與該通路相關(guān)的差異代謝物的數(shù)目；y為與該通路相關(guān)的背景（所有）代謝物的數(shù)目；門為KEGG注釋的差異代謝物數(shù)目；N為KEGG注釋的背景（所有）代謝物的數(shù)目）；當代謝途徑的P值＜ 0.05時，認為該代謝途徑是顯著富集的。代謝物差異分析和KEGG富集分析均采用Python-3.5.0和R-4.0.3進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 總樣本和差異代謝物的PCA分析

對從6個硒處理樣本和6個對照樣本獲得的數(shù)據(jù)，采用PCA方法進行歸類分析，從總體上反映各組樣本之間的總體代謝差異和組內(nèi)樣本之間的變異大小。從圖1可以看出，在正負離子化模式下，6個硒處理樣本和6個對照樣本都處于95%的置信區(qū)間范圍內(nèi)，且QC樣本非常集中，表明實驗數(shù)據(jù)質(zhì)量高，可以滿足后續(xù)的分析。在差異代謝物的總體分布趨勢上，無論是在第一主成分方向上還是在第二主成分方向上，正負離子化模式下，硒處理和對照樣本的代謝物差異都不大，表明硒處理只引起香榧葉片內(nèi)少數(shù)代謝物發(fā)生差異變化（圖2）。

為了確定硒處理和對照之間的代謝物差異，采用有監(jiān)督的PLS-DA模型放大硒處理和對照之間的差異，并建立代謝物表達量與延平類別之間的關(guān)系模型。交叉驗證結(jié)果顯示，在正離子化模式下，R2Y（模型對分類變量y的可解釋性）和Q2Y（模型的可預(yù)測性）分別為0.95和0.53（圖3A）；在負離子化模式下，R2Y和Q2Y分別為0.98和0.63（圖3B）。在正負離子化模式下，其R2Y和Q2Y均大于0.5，且R2Y均大于Q2Y（圖3A，B）。這些結(jié)果表明擬合模型的準確度和預(yù)測能力良好。從PLS-DA得分圖可以看出，在正負離子化模式下，硒處理樣本和對照具有非常顯著的差別，且全部處于95%的置信區(qū)間內(nèi)（圖3A，B）。通過置換檢驗對模型有效性進行檢驗，其結(jié)果表明原模型具有良好的穩(wěn)定性，不存在過擬合現(xiàn)象，因為在正負離子化模式下，R2均大于Q2，且Q2回歸線在y軸上的截距小于0（圖3C，D）。

2.2 差異代謝物分析

在正離子化模式下，硒處理與對照之間存在909種差異代謝物，其中69種差異顯著（27種顯著上調(diào)，42種顯著下調(diào)）；在負離子化模式下，硒處理與對照之間存在433種差異代謝物，其中43種差異顯著（11種顯著上調(diào)，32種顯著下調(diào)）（表2）。其火山圖顯示，在正負離子化模式下，無論是顯著上調(diào)的代謝物還是顯著下調(diào)的代謝物，其VIP大致一致（圖4）。在正離子化模式下，顯著上調(diào)的代謝物前3種為N'-[6-（tert-butyl）thieno[3，2-d]pyrimidin-4-yl]-4-methylbenzohydrazide、4-dihyd roxy-l，4-dimethyl-7-（propan-2-ylidene）-decahydroazulen-6-one和butanedioicacid，其上調(diào)倍數(shù)分別為7.009、3.179和2.718；在負離子化模式下，顯著上調(diào)的代謝物前3種為polyphyllinV、C-pentosyl-apigenin O-p-coumaroylhexoside和plantagoside，其上調(diào)倍數(shù)分別為3.761、3.399和2.827（表3）。

2.3 KEGG通路富集分析

差異代謝物的KEGG通路富集結(jié)果如表4所示。在正離子化模式下，有27種KEGG通路顯著富集；在負離子化模式下，有11種KEGG通路顯著富集。在這些通路中，差異代謝物較多的通路為代謝途徑（9種差異代謝物）、嘌呤代謝途徑（3種差異代謝物）以及ABC轉(zhuǎn)運蛋白、氨基乙酰-tRNA生物合成通路、氨基酸合成通路、核黃素代謝通路、氨基糖和核苷糖代謝通路（各2種差異代謝物）。

3 討論

香榧果實作為國內(nèi)正在興起的休閑食品，日益為人們所接收，其消費量日益擴大。香榧果實的硒生物強化，可以適當滿足人們對硒的攝入量，進而增強人們的身體健康。硒肥葉面噴施是一個很好的途徑，在諸如葡萄、芒果、黃梨等上使用，促進了這些水果的硒的生物強化。然而，這些報道只對硒葉面肥對果樹生長、果實品種等進行了研究，沒有對硒肥施用對果樹葉片和果實的代謝組的影響進行探討。本研究實驗結(jié)果表明，香榧葉面施加亞硒酸鈉上調(diào)了許多次生代謝物（表3）。例如，川芎內(nèi)酯在葉片中增加2.524倍（與對照相比，表3）。川芎內(nèi)酯對人體和動物的生理具有重要影響。如在腦缺血再灌注，川芎內(nèi)酯可以通過激活依賴于PINK1/Parkin的中型噬菌體而減少海馬趾神經(jīng)元的傷害；在低氧口腔癌細胞中，通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫信號而誘導依賴于c-Myc的細胞凋亡。該次生代謝物還可以通過TLR4通路而促進與癌癥相關(guān)的纖維組織母細胞的凋亡。在經(jīng)過硒肥處理后，其葉片6．唾液乳糖含量增加2.021倍（表3）。有研究結(jié)果表明，人乳中的6-唾液乳糖通過抑制toll樣的受體（TLR4）而抑制正在壞死的小腸結(jié)腸炎的發(fā)展，在血管平滑肌細胞中，它還可以對血管緊張素II引起的繁殖、遷移以及成骨性轉(zhuǎn)換具有抑制作用。在葉面硒肥應(yīng)用后，阿齊沙坦含量增加1.931倍（表3，與對照相比）。阿齊沙坦是一種血管緊張素受體的阻斷劑，可用于治療高血壓。此外，該次生代謝物還可以用于治療高血糖引起的血腦障壁的滲透壓力過大。在施用硒葉面肥后，香榧葉片中車前子苷含量增加2.827倍（表3，與對照相比）。該次生代謝物首次從車前（Plantago asiatica L．）種子中分離鑒定，為一種新奇的甘露糖苷酶抑制劑，具有抑制免疫反應(yīng)的作用。該次生代謝物近來用于治療猴痘。由此可見，對香榧葉片噴施亞硒酸鈉葉面肥，可以增加很多對人體有益的次生代謝物。如果這些次生代謝物能在香榧果實中累積，無疑可以進入人體而增強人體的各種機能。因此，進一步的實驗需要對這些次生代謝物在香榧果實中累積進行分析。然而，正如前面所述，硒進入生物體后要么以離子形式存在，要么以氨基酸和蛋白質(zhì)形成存在，其含量可能很低，因此，本研究沒有檢測到含硒的次生代謝物。

KEGG富集通路分析表明，在亞硒酸鈉葉面噴施后，香榧葉片中的代謝途徑也發(fā)生很大的變化，其中包括黃酮類化合物的生物合成、氨基酸的生物合成以及碳固定途徑（表4）。碳固定途徑的富集，無疑表明了亞硒酸鈉葉面噴施后可增強香榧葉片的光合作用，進而促進光合產(chǎn)物的累積而促進其生長。黃酮類化合物對人體具有非常重要的作用，如充當抗氧化劑、抗癌、消炎。此外，香榧葉片噴施亞硒酸鈉增加了其氨基酸的生物合成，然而均沒有涉及到含硒氨基酸的合成通路富集（表4），這可能是質(zhì)譜圖庫中沒有相應(yīng)的硒氨基酸合成通路。因此，要檢測硒肥使用之后植物葉片中含硒氨基酸的生物合成途徑的變化，應(yīng)該在質(zhì)譜圖對比庫中增添含硒氨基酸的圖譜。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，對香榧進行葉面噴施硒肥可以顯著改變其代謝物的生物合成，其中一些代謝物對人體健康非常有益，因此香榧葉面噴施硒肥可以促進其葉片中有益于人體健康的代謝物的累積。

（責任編輯：彭南軒）

基金項目：湖北省林業(yè)科技支撐重點項目“香榧良種選育與苗木快速繁育技術(shù)”（2016-LYKJ01）。