川牛膝對淡水石斑魚部分血清抗氧化指標(biāo)的影響

孫曉旺，鄭艷坤，馬 林，李明澤，尤宏爭，畢相東，孫學(xué)亮*

（ 1. 天津市水產(chǎn)研究所，天津 300221 ；2. 天津市農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，天津 300161 ； 3. 天津農(nóng)學(xué)院，天津 300192 ）

淡水石斑魚（Cichlasoma managuense）屬于脊索動物門、脊椎動物亞門、硬骨魚綱、輻鰭亞綱，別稱石斑魚。淡水石斑魚原產(chǎn)自中美洲尼加拉瓜，廣東、江西等養(yǎng)殖單位引入后進(jìn)行推廣養(yǎng)殖[1]。淡水石斑魚具有生長速度快、耐低氧、抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)，不僅肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，而且外形美觀、體態(tài)優(yōu)美，既可以作為商品魚食用，還可以作為觀賞魚，是一種值得推廣的淡水優(yōu)良品種[2]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對淡水石斑魚的養(yǎng)殖技術(shù)愈發(fā)重視，淡水石斑魚的養(yǎng)殖規(guī)模也越來越大，逐漸成為淡水養(yǎng)殖中的重要品種[1-3]。

川牛膝（Radix cyathulae）屬于植物界、被子植物門、雙子葉植物綱、莧科，別稱白牛膝、拐牛膝、肉牛膝，為莧科植物川牛膝的干燥根[4]。采集時需秋、冬二季采挖，除去蘆頭、須根及泥沙，烘或曬至半干，堆放回潤，再烘干或曬干[5]。其味甘、微苦，性平，具有逐瘀通經(jīng)，通利關(guān)節(jié)、利尿通淋等功效[5]。川牛膝用于治療經(jīng)閉癥瘕、胞衣不下、跌撲損傷、風(fēng)濕痹痛、足痿筋攣、尿血血淋等[5]。張鈺芹等[6]研究發(fā)現(xiàn)，牛膝多糖還可通過調(diào)控腫瘤的微環(huán)境，改善機(jī)體的血液流變性，起到抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。

目前，國內(nèi)外學(xué)者對淡水石斑魚的研究主要集中在養(yǎng)殖繁育、肌肉營養(yǎng)等方面，川牛膝作為添加劑對淡水石斑魚的體內(nèi)抗氧化性的相關(guān)研究尚未見報道。本研究使用中草藥川牛膝添作為飼料添加劑飼養(yǎng)淡水石斑魚，旨在研究和評價川牛膝對淡水石斑魚體內(nèi)抗氧化性的影響，為淡水石斑魚的健康養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用450 尾淡水石斑魚，購自天津市七里海水產(chǎn)養(yǎng)殖場。平均體長（15.20±1.20） cm、體質(zhì)量（50.20±2.30） g，隨機(jī)分為5組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)30尾魚，飼養(yǎng)于15 個長38 cm×寬26 cm×高36 cm 的水族箱中。水溫為（37.0±0.5） ℃，pH 值7.24，溶氧為6.0～6.2 mg/L。飼料選用福州海馬牌石斑魚商品飼料（Q/FZHM 005），飼料營養(yǎng)水平見表1，每日投喂飼料量約為魚體重的1%。試驗用川牛膝購自天津市中草藥店，選取川牛膝植物根莖，使用研磨機(jī)械充分研磨成粉狀。

表1 試驗飼料營養(yǎng)水平Tab.1 Nutrient levels of the experimental diets 單位：%

1.2 試驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理

試驗設(shè)置5 個濃度梯度，在基礎(chǔ)飼料中分別添加0、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的川牛膝（包括1個對照組和4個濃度梯度試驗組），每組設(shè)3個重復(fù)。試驗期間，每天9：00和15：00分別對應(yīng)投喂含不同川牛膝濃度的飼料，每日投喂飼料量約為魚體重的1%。每日密切觀察受試淡水石斑魚的狀態(tài)，若發(fā)現(xiàn)魚體死亡，則及時撈出，稱重，記錄。

1.3 測定指標(biāo)及方法

分別在試驗開始第7、第14、第21 和第28 d 對試驗魚進(jìn)行采樣，每個水族箱中每次取5條受試淡水石斑魚。使用2 mL注射器從受試淡水石斑魚的尾柄處插入受試魚體的動脈中采集血液，注入已標(biāo)記好的離心管中，離心管中事先加入適量肝素，防止血液凝固，將已標(biāo)記好的離心管放入冰水中，避免無關(guān)因素對試驗造成影響。取完同一水箱的魚血液樣品，4 ℃冰箱內(nèi)保存，并在1 d內(nèi)對血液進(jìn)行離心處理（4 ℃、4 000 r/min 離心10 min）。使用南京建成生物科技有限公司試劑盒對各血清樣品測定抗氧化指標(biāo)，包括谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、超氧化物歧化酶（CAT）、丙二醛（MDA）和總抗氧化能力（T-AOC）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理與統(tǒng)計，SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析，Duncan's 法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 川牛膝對淡水石斑魚血清GSH-Px 活性的影響（見表2）

表2 川牛膝對淡水石斑魚血清GSH-Px活性的影響Tab.2 Effect of Radix cyathulae on the serum GSH-Px activity of the Cichlasoma managuense 單位：U/mL

由表2 可知，試驗第14 d 時，0.5%川牛膝添加組淡水石斑魚血清GSH-Px活性顯著高于對照組、1.5%川牛膝添加組和2.0%川牛膝添加組（P＜0.05）；試驗第7 d和21 d時，2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清GSH-Px 活性顯著高于0.5%川牛膝添加組和1.5%川牛膝添加組（P＜0.05）；試驗28 d時，2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清GSH-Px活性顯著高于對照組（P＜0.05），但與其余各濃度組相比差異不顯著（P＞0.05）。

對照組淡水石斑魚在試驗第7、第21 d 時淡水石斑魚血清GSH-Px 活性顯著高于試驗第14、第28 d（P＜0.05）；2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚試驗第21 d 時的血清GSH-Px活性顯著高于試驗第14、第28 d（P＜0.05）。

2.2 川牛膝對淡水石斑魚血清SOD活性的影響（見表3）

由表3 可知，試驗第7 d 時，對照組淡水石斑魚血清SOD 活性顯著高于1.0%川牛膝添加組、1.5%川牛膝添加組、2.0%川牛膝添加組（P＜0.05）；試驗第14、第21 d 時，1.5%川牛膝添加組淡水石斑魚血清SOD活性顯著高于對照組（P＜0.05）；試驗第28 d 時，對照組淡水石斑魚血清SOD 活性顯著低于各試驗組（P＜0.05）。對照組淡水石斑魚試驗第7 d 時的血清SOD 活性顯著高于試驗第28 d（P＜0.05）；1.0%川牛膝添加組、1.5%川牛膝添加組和2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚試驗第14 d 時的血清SOD 活性顯著高于試驗第21 d時（P＜0.05）；且1.5%川牛膝添加組淡水石斑魚試驗第14 d時的血清SOD活性最高（P＜0.05）。

2.3 川牛膝對淡水石斑魚血清CAT活性的影響（見表4）

表4 川牛膝對淡水石斑魚血清CAT活性的影響Tab.4 Effect of Radix cyathulae on the serum CAT activity of the Cichlasoma managuense 單位：U/mL

由表4可知，試驗第7 d時，2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清CAT活性顯著高于對照組和1.0%川牛膝添加組（P＜0.05）；試驗第14 d 時，0.5%川牛膝添加組淡水石斑魚血清CAT 活性顯著高于2.0%川牛膝添加組（P＜0.05）；試驗第21、28 d 時，1.5%川牛膝添加組CAT 活性顯著高于2.0%川牛膝添加組（P＜0.05）。0.5%川牛膝添加組各時間點(diǎn)淡水石斑魚的CAT 活性差異不顯著（P＞0.05）；1.0%川牛膝添加組淡水石斑魚試驗第28 d 時的血清CAT 活性顯著高于其他時間點(diǎn)（P＜0.05）；1.5%川牛膝添加組淡水石斑魚試驗第21 d 時的血清CAT 活性顯著高于試驗第7 和第14 d（P＜0.05）；2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚試驗第7 d時的血清CAT活性最高，顯著高于其他組（P＜0.05）。

2.4 川牛膝對淡水石斑魚血清MDA含量的影響（見表5）

表5 川牛膝對淡水石斑魚血清MDA含量的影響Tab.5 Effect of Radix cyathulae on the serum MDA concentration of the Cichlasoma managuense 單位：U/mL

由表5可知，對照組淡水石斑魚在試驗第7 d時的血清MDA 含量顯著高于其他時間點(diǎn)（P＜0.05），且顯著高于1.5%川牛膝添加組和2.0%川牛膝添加組（P＜0.05）。試驗第14 d 時，1.5%川牛膝添加組和2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清MDA 含量顯著高于試驗第7 d 時（P＜0.05）。試驗第21 d 時，0.5%川牛膝添加組和1.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清MDA 含量顯著低于試驗第28 d 時（P＜0.05）。試驗第28 d 時，0.5%川牛膝添加組、1.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清MDA 含量顯著高于對照組（P＜0.05）。

2.5 川牛膝對淡水石斑魚血清T-AOC的影響（見表6）

表6 川牛膝對淡水石斑魚血清T-AOC的影響Tab.6 Effect of Radix cyathulae on the serum T-AOC of the Cichlasoma managuense 單位：U/mL

由表6可知，試驗第7 d時，2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清T-AOC 顯著高于其他組（P＜0.05）；試驗第14 d時，0.5%川牛膝添加組和2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清T-AOC顯著高于對照組、1.0%川牛膝添加組和1.5%川牛膝添加組（P＜0.05）；試驗第21 d 時，0.5%川牛膝添加組淡水石斑魚血清T-AOC 顯著高于對照組（P＜0.05）；試驗第28 d 時，1.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清T-AOC顯著高于對照組、0.5%川牛膝添加組和2.0%川牛膝添加組（P＜0.05）。

1.5%川牛膝添加組淡水石斑魚試驗第28 d 時淡水石斑魚的血清T-AOC 顯著高于試驗第7、第14 d（P＜0.05）。2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚各時間點(diǎn)的血清T-AOC差異均不顯著（P＞0.05）。

3 討論

3.1 川牛膝對淡水石斑魚血清GSH-Px活性的影響

GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種活性氧自由基清除劑，與CAT和SOD共同組成了機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)[7-8]。GSH-Px 能夠清除機(jī)體內(nèi)的過氧化氫和脂質(zhì)過氧化物，阻止活性氧自由基對生物體內(nèi)的損傷，確保機(jī)體正常的生命活動[9]。本試驗結(jié)果表明，試驗第14 d 時，0.5%川牛膝添加組淡水石斑魚血清GSH-Px活性顯著高于對照組、1.5%和2.0%川牛膝添加組；試驗第21 d時，2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清GSH-Px 活性顯著高于0.5%、1.0%和1.5%川牛膝添加組，表明川牛膝對GSH-Px的影響在逐漸累積。試驗28 d 時，2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清GSH-Px 活性顯著高于對照組，但與其余各添加組相比差異不顯著，表明試驗第21 d 與28 d 間淡水石斑魚血清GSH-Px 活性存在一個峰值。2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚各時間點(diǎn)的血清GSH-Px活性存在顯著差異，其中試驗第21 d 時的血清GSH-Px 活性顯著高于試驗第14 d 和28 d。綜上所述，川牛膝添加量為2.0%時，淡水石斑魚血清GSH-Px活性在試驗第21 d時顯著高于其他時間點(diǎn)，在21 d 與28 d 之間到達(dá)峰值，之后下降；川牛膝濃度為0、0.5%、1.0%、1.5%時，各時間點(diǎn)測得的數(shù)據(jù)之間差異不顯著。結(jié)果表明，川牛膝濃度為2.0%時對淡水石斑魚血清GSH-Px活性的影響較明顯。這與唐靜[10]研究中對小鼠灌胃不同劑量的川牛膝后，T-SOD、CAT、GSH-Px 的活性和T-AOC均有不同程度的升高的試驗結(jié)果基本吻合。

3.2 川牛膝對淡水石斑魚血清SOD活性的影響

SOD 別名肝蛋白，是一種內(nèi)源性抗氧化金屬酶，能夠消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的自由基和活性氧，防止脂質(zhì)過氧化，還具有抗衰老的特殊效果[11-13]。倪青松等[14]用含不同濃度川牛膝的飼料飼喂仔雞7 d，發(fā)現(xiàn)川牛膝多糖可通過提高血清抗氧化性指標(biāo)水平提高機(jī)體的免疫能力。本試驗中，對照組淡水石斑魚血清SOD活性隨時間推移逐漸降低，試驗第28 d 時活性顯著低于第7 d 時。通過飼料中加入川牛膝，試驗第28 d 時，各添加組淡水石斑魚血清SOD活性均顯著高于對照組；其中，1.0%、1.5%、2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清SOD活性的峰值均出現(xiàn)在試驗第14 d，之后出現(xiàn)不同程度的下降，在試驗第28 d時略有回升。與1.0%、2.0%川牛膝添加組相比，1.5%川牛膝添加組淡水石斑魚血清SOD活性除在試驗第7 d時略低外，在其余各時間點(diǎn)均為最高。綜上所述，川牛膝對淡水石斑魚血清SOD的作用效果在試驗第14 d時最為明顯，且川牛膝添加濃度為1.5%時效果最佳。這與玄一凡等[13]得出的在虹鱒飼料中添加2%復(fù)方中草藥能夠增強(qiáng)虹鱒幼魚血清SOD活性的研究結(jié)果相似，表明飼料中適量添加中草藥能夠提升魚類的抗氧化性能，但過量添加反而會降低魚類抗氧化性，對魚體產(chǎn)生不良影響。

3.3 川牛膝對淡水石斑魚血清CAT活性的影響

CAT 是一種酶類清除劑，又稱為觸酶，是以鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶[15]。CAT可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內(nèi)的過氧化氫，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一[15-16]。羅李媛等[17]從川牛膝中提取川牛膝多糖，測定并證實(shí)其參與了機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫，從而提高機(jī)體的免疫力；川牛膝還具有促進(jìn)動物體生長發(fā)育的功能。本試驗中，試驗第21 d 時，1.5%川牛膝添加組淡水石斑魚血清CAT活性顯著高于試驗第7、第14 d，說明在添加濃度為1.5%，川牛膝對淡水石斑魚血清CAT活性具有明顯的增強(qiáng)效果；試驗第28 d時，2.0%川牛膝添加組CAT活性顯著低于其余各組，說明淡水石斑魚血清CAT 活性在試驗第21 d 和第28 d 之間存在一個最低值。根據(jù)這一特性，在生產(chǎn)中可根據(jù)實(shí)際需求適當(dāng)調(diào)節(jié)川牛膝的添加濃度。綜上所述，CAT對川牛膝的刺激反應(yīng)非常靈敏，但注意在實(shí)際生產(chǎn)中不宜持續(xù)性地使用川牛膝增強(qiáng)淡水石斑魚的CAT活性。

3.4 川牛膝對淡水石斑魚血清MDA含量的影響分

MDA 由乙醛和甲酸乙酯在堿作用下縮合而得，可在高真空下升華精制，主要用于醫(yī)藥中間體或感光色素的原料[18]。在生物體內(nèi)，自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物為MDA，會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性，更具有潛在的致癌性[18-19]。由于動物肉品變質(zhì)主要是由于脂類物質(zhì)的氧化，而MDA作為脂類物質(zhì)的氧化產(chǎn)物，其含量可間接反映動物脂類氧化的程度[20]。本試驗結(jié)果顯示，受試淡水石斑魚血清MDA 含量對于川牛膝的刺激在低濃度時（如0.5%、1.0%）反應(yīng)較遲緩，在試驗第21 d時，川牛膝才開始對MDA指標(biāo)產(chǎn)生影響。川牛膝添加濃度為1.5%和2.0%時，淡水石斑魚血清MDA含量在試驗第7 d和第14 d時存在顯著差異。因此，在一定的范圍內(nèi)，隨著川牛膝添加濃度升高可增加魚血清MDA 的含量。試驗第21 d 時，飼料中添加低濃度的川牛膝（如0.5%、1.0%），淡水石斑魚血清MDA 含量顯著低于對照組和其他添加組，表明較低濃度的川牛膝可在試驗第21 d 時降低淡水石斑魚血清MDA 含量，降低魚體內(nèi)脂類的氧化程度。

3.5 川牛膝對淡水石斑魚血清T-AOC的影響

T-AOC 能夠反映魚體抗氧化能力的總體表現(xiàn)，是機(jī)體防御體系中酶促及非酶促中各因子抗氧化能力的總和，可較為全面地體現(xiàn)魚體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)對外界不良因素刺激的代償能力[19]。王麗新[21]通過觀察黃芪提取液對自然衰老小鼠皮膚中T-AOC、ATP 酶活性的影響及小鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)在用藥前后的變化，證明了黃芪提取液在延緩小鼠皮膚自然衰老方面的作用。本試驗中，除2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚各時間點(diǎn)的血清T-AOC不存在顯著差異外，其余各濃度組之間均存在顯著差異；飼料中川牛膝添加濃度為1.0%時，試驗第28 d時，淡水石斑魚血清T-AOC 最高。綜合而言，川牛膝對淡水石斑魚血清T-AOC的影響效果呈波浪形。唐靜[10]給小鼠灌胃不同劑量川牛膝多糖，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)的T-SOD、CAT、GSH-Px的活性和T-AOC 均有不同程度的升高，這與本試驗結(jié)果基本吻合。

4 結(jié)論

不同濃度的川牛膝作為飼料添加劑能夠?qū)Φ唪~血清抗氧化指標(biāo)產(chǎn)生影響。在各添加濃度下，川牛膝對淡水石斑魚血清GSH-Px、CAT活性在試驗第21 d時的影響效果最明顯，而SOD 活性、MDA 含量與T-AOC 在試驗28 d時達(dá)到最大值。研究表明，川牛膝對淡水石斑魚的抗氧化功能具有促進(jìn)作用，但每項抗氧化指標(biāo)的最適濃度不同；為提高其血清GSH-Px、CAT、SOD 的活性和T-AOC，降低MDA 含量，在養(yǎng)殖過程中可預(yù)先添加0.5%川牛膝，再根據(jù)實(shí)際情況適量增加川牛膝的添加濃度，以達(dá)到最優(yōu)的養(yǎng)殖效果。