吳 苑, 黎祖鳴, 吳思儀, 陳劍坤, 李際強(qiáng)*, 陳 海*, 蔡書賓*

(1)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院, 廣州 511400;2)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院, 廣州 511400)

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(obstructive sleep apnea, OSA)以打鼾、頻繁的淺呼吸、呼吸暫停、低氧血癥、夜間睡眠障礙和白天嗜睡為特點(diǎn),而間歇性低氧(intermittent hypoxia, IH)是OSA一個(gè)關(guān)鍵病理生理過(guò)程[1, 2]。世界范圍內(nèi),OSA的患病率約為17%[3]。許多研究顯示,OSA與高血壓、冠心病、中風(fēng)以及其他心腦血管疾病密切相關(guān)[4-6]。由于目前診斷方法的復(fù)雜性和持續(xù)氣道正壓通氣(continuous positive airway pressure, CPAP)治療較差的依從性,目前OSA患者的診斷和治療率很低。因此,從臨床和理論的角度而言,有必要進(jìn)行對(duì)OSA進(jìn)一步深入研究。

隨著轉(zhuǎn)錄物組測(cè)序等高通量技術(shù)的發(fā)展,研究人員通過(guò)分析OSA的miRNA表達(dá)譜[7, 8],以研究表觀基因組調(diào)控在OSA發(fā)生和發(fā)展中的作用。環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)是一種內(nèi)源性非編碼RNA,與miRNA不同的是,它形成一個(gè)閉環(huán)結(jié)構(gòu),是基因轉(zhuǎn)錄的重要組成部分,其末端有一個(gè)5′端和一個(gè)3′端[9]。幾乎所有物種中都表達(dá)circRNA,且具有疾病特異性,因其可抵御RNA酶的降解,與線性RNA相比,具有更高的組織和循環(huán)穩(wěn)定性[10]。circRNA的另一個(gè)特點(diǎn)是它的“miRNA海綿”功能,它能有效地降低miRNA的表達(dá),以進(jìn)一步調(diào)節(jié)下游mRNA的表達(dá)[11]。既往研究表明,circRNA在腫瘤、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[12-15]。本研究擬通過(guò)轉(zhuǎn)錄物組測(cè)序、生物信息學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量法(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)驗(yàn)證等方法,對(duì)OSA大鼠模型的circRNA和mRNA譜進(jìn)行分析,并構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),以期為闡明OSA的發(fā)生機(jī)制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周大的SPF級(jí)Wistar雄性大鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)SCXK(粵)2013-0002],體重180～200克,自由攝入食物和取水,飼養(yǎng)條件:室溫20～26 ℃,相對(duì)濕度40%～70%,實(shí)行12 h∶12 h光暗照明循環(huán),保持動(dòng)物房環(huán)境安靜。根據(jù)是否進(jìn)行缺氧處理分為缺氧組(IH)和對(duì)照組(NC)。本研究已經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)動(dòng)物福利與倫理分會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)2019011)。

1.2 儀器和試劑

儀器:PCR擴(kuò)增儀(Applied Biosystems,美國(guó))、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Thermo,美國(guó))、熒光定量PCR儀(伯樂公司,美國(guó)),illumina Hiseq X10測(cè)序儀(Illumina,美國(guó))。

試劑:Rnase R(Epicentre,Madison,USA)、Arraystar Super RNA Labeling 試劑盒(Arraystar, Rockville, USA)、小鼠白介素6(interleukin-6, IL-6)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒(Abcam, Cambridge, UK)。

1.3 阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征動(dòng)物模型的構(gòu)建

為構(gòu)建OSA動(dòng)物模型,每天8:00到16:00之間將雄性Wistar大鼠關(guān)在同一個(gè)IH有機(jī)玻璃室中,最初向室內(nèi)輸送氮?dú)?持續(xù)90 s。然后,該室被填充壓縮空氣,持續(xù)90 s。因此,每個(gè)周期共持續(xù)180 s。在IH期間,氣體流速設(shè)定為每個(gè)循環(huán)玻璃室中最低氧氣濃度的5%,并逐漸恢復(fù)到21%,玻璃室的壓力保持在大氣水平。而對(duì)照組持續(xù)暴露在21%的氧氣中。在非實(shí)驗(yàn)時(shí)間(16∶00-08∶00)期間,所有的動(dòng)物都正常攝入水和食物[16],實(shí)驗(yàn)周期共4周。造模4周后,皮下注射水合氯醛麻醉缺氧組和對(duì)照組大鼠,取血、支氣管和肺組織后,大鼠被脫臼處死。

1.4 蘇木精-伊紅染色觀察阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征大鼠支氣管和肺組織病理變化

各組大鼠左側(cè)支氣管和肺組織在室溫下采用4%多聚甲醛固定過(guò)夜,在梯度濃度乙醇中脫水(70%、80%、90%和100%);將組織浸入二甲苯中直至透明,在60 ℃石蠟中包埋2 h;將組織塊切成5 μm薄片,在水中攤開并轉(zhuǎn)移到載玻片上,于60 ℃干燥24 h;將切片在二甲苯中脫蠟,以梯度濃度乙醇(100%、95%、85%和75%)中脫水;切片在蘇木精中染色5 min,沖洗后使用伊紅染色3 min,在梯度濃度乙醇中脫水(每次2 min,分別以75%、85%、95% 的比例脫水; 每次5 min,以100% 的比例脫水),在二甲苯中透明2次,每次10 min;使用中性樹膠封片,在光學(xué)顯微鏡下觀察組織厚度、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、水腫和出血等情況。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清中炎癥因子水平

各組大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血,靜置2 h,室溫下3 500 r/min離心10 min,取上清,按照ELISA試劑盒說(shuō)明檢測(cè)血清中IL-6、VEGF、TNF-α和ICAM-1的表達(dá)水平。

1.6 CircRNA和mRNA差異分析及質(zhì)量控制

通過(guò)Qubit 2.0對(duì)RNA濃度進(jìn)行初步定量,分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度及純度,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總 RNA降解程度、基因組DNA污染和蛋白質(zhì)污染,以及Agilent 2100檢測(cè)RNA的完整性及插入片段大小等質(zhì)量控制,結(jié)果提示樣品質(zhì)量合格。

丟棄含有20%以上的低質(zhì)量堿基或適配序列污染的低質(zhì)量讀數(shù),用BWA(v0.7.12)[17]memalignment模塊將高質(zhì)量的讀數(shù)與人類參考基因組(hg19)對(duì)比。使用CIRI軟件[18]對(duì)circRNA進(jìn)行識(shí)別和定性,其過(guò)程如下:首先,丟棄與基因組連續(xù)對(duì)齊的讀數(shù),不作任何修剪;剩余的讀數(shù)被用于circRNA候選檢測(cè);再提取終端序列(錨)并重新對(duì)齊,以找到獨(dú)特的錨位置,以反方向(頭對(duì)尾)對(duì)齊的錨表示circRNA的拼接(反拼接);最后,用以下標(biāo)準(zhǔn)來(lái)過(guò)濾所產(chǎn)生的剪接事件:(1)剪接位點(diǎn)兩側(cè)的GT/AG信號(hào);(2)明確的斷點(diǎn)檢測(cè);(3)延伸過(guò)程中不超過(guò)2個(gè)錯(cuò)配;(4)斷點(diǎn)位于錨點(diǎn)內(nèi)最多2個(gè)核苷酸;(5)支持頭到尾剪接接頭的獨(dú)立讀數(shù)少于2個(gè)?？缭?個(gè)確定的反接點(diǎn)的讀數(shù)被歸一化,由讀數(shù)映射(spliced tags reads per million mapping, TPM),這允許在2個(gè)circRNA之間進(jìn)行表達(dá)比較。使用已報(bào)道的統(tǒng)計(jì)模型[19]對(duì)2個(gè)樣本進(jìn)行差異表達(dá)分析。P<0.05和差異倍數(shù)≥2的circRNA認(rèn)為是差異表達(dá)的circRNAs。

丟棄低質(zhì)量讀數(shù)后用HISAT[20]以默認(rèn)參數(shù)與人類基因組(hg19)進(jìn)行比對(duì)。使用RSeQC[21]測(cè)量基因表達(dá)豐度,即每百萬(wàn)映射讀數(shù)中的每千堿基讀數(shù)(reads per kilobase per million mapped reads, RPKM)。使用heatmap R包進(jìn)行所有樣本的無(wú)監(jiān)督聚類,得出差異mRNA。

1.7 預(yù)測(cè)和富集分析

使用TargetScan[22]和miRanda[23]在線分析工具預(yù)測(cè)circRNA-miRNA和miRNA-mRNA的相互作用關(guān)系。采用R包c(diǎn)lusterProfiler、enrichplot、GOplot、ggplot2對(duì)差異的circRNA和mRNA進(jìn)行基因本體論(Gene ontology, GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析及可視化。其中,GO分析包括生物學(xué)過(guò)程(biological process, BP)、細(xì)胞組成(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF)。

1.8 關(guān)鍵RNA的qRT-PCR驗(yàn)證

根據(jù)試劑盒的說(shuō)明,每個(gè)支氣管組織樣本分別與聚丙烯載體(MRC,OH,USA)、TRIzol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)和氯仿混合以提取總RNA。常規(guī)使用RNeasy Mini 試劑盒以提純RNA(Qiagen,Hilden,德國(guó))。然后,使用NanoDrop 2000(Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)檢測(cè)RNA的純度和濃度。使用PrimeScript RT試劑盒(TaKaRa,中國(guó)大連),將OSA組和對(duì)照組的支氣管樣本提取的RNA按照試劑盒的說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用以下PCR擴(kuò)增設(shè)置:在95 ℃下進(jìn)行15 s的初始變性步驟,然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán),在95 ℃下變性5 s,在61 ℃下退火15 s。使用SYBR Green PCR試劑盒(TaKaRa,中國(guó)大連),對(duì)關(guān)鍵的mRNA和circRNA進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征大鼠模型

在IH有機(jī)玻璃室內(nèi)進(jìn)行缺氧和復(fù)氧循環(huán)4周,IH組大鼠的體重急劇增加(Fig.1A);取大鼠左側(cè)肺和支氣管組織,HE染色后于顯微鏡下觀察,結(jié)果提示,與對(duì)照組相比,IH組的大鼠普遍出現(xiàn)肺泡壁和支氣管組織變厚、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、水腫和出血等情況(Fig.1B); ELISA檢測(cè)血清中炎癥因子水平,結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,IH組的大鼠血清中IL-6(352.36±43.82比191.32±63.65,P=0.023)、VEGF(8.65±0.21比1.41±0.32,P<0.001)、TNF-α(7.51±0.7比2.89±0.97,P=0.003)和ICAM-1(1.34±0.11比0.83±0.01,P=0.001)的水平明顯上升(Fig.1C)。以上結(jié)果表明,OSA大鼠模型構(gòu)建成功。

Fig.1 Construction and verification of the IH rat model (A) Body weights of rats in different groups. (B) Histological sections of bronchial and lung tissues from different groups of rats (hematoxylin and eosin staining; magnification × 200, scale bar=300 μm). (C) The concentrations of ICAM-1, IL-6, VEGF and TNF-α were determined by ELISA. NC control group, IH OSA group. (*P <0.05, **P <0.01,****P <0.0001)

2.2 阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征大鼠模型circRNA和mRNA的表達(dá)譜分析

每組隨機(jī)抽取1個(gè)支氣管樣本進(jìn)行circRNA和mRNA測(cè)序。差異表達(dá)分析結(jié)果顯示,共有411個(gè)差異表達(dá)的circRNA,其中表達(dá)上調(diào)的circRNA有230個(gè),表達(dá)下調(diào)的circRNA有181個(gè)(Fig.2A),差異表達(dá)的circRNA在染色體上的分布正如Fig.2B所示;共有1 846個(gè)差異表達(dá)的mRNA,其中表達(dá)上調(diào)的mRNA有1 238個(gè),表達(dá)下調(diào)的mRNA有608個(gè)(Fig.3A),差異表達(dá)的mRNA在染色體上的分布正如Fig.3B所示。差異倍數(shù)最大的前6個(gè)circRNA(Table 1)和mRNA(Table 2)定義為關(guān)鍵RNA。

Table 1 Top 6 significantly dysregulated circRNAs in IH

Table 2 Top 6 significantly dysregulated mRNAs in IH

Fig.2 Analysis of circRNAs with differential expression in the OSA rat model using bioinformatics (A) A scatter plot (left panel) and heat map (right panel) illustrate the distributions of cicRNAs. (B) Distribution of differentially expressed circRNAs on chromosomes. (C) KEGG pathway analysis of differentially expressed circRNAs. (D) GO pathway analysis of differentially expressed circRNAs. NC control group, IH OSA group

Fig.3 Analysis of differentially expressed mRNAs in the IH rat model using bioinformatics The distributions of mRNAs were more clearly displayed in (A) scatter plots (left panel) and heat maps (right panel). (B) Distribution of differentially expressed mRNAs on chromosomes. (C) KEGG pathway analysis of differentially expressed mRNAs. (D) GO pathway analysis of differentially expressed mRNAs. NC control group, IH OSA group

2.3 關(guān)鍵RNA功能富集分析

對(duì)關(guān)鍵的circRNA和mRNA進(jìn)行富集分析。關(guān)鍵circRNA的KEGG結(jié)果表明,其主要富集在代謝通路、PI3K-Akt信號(hào)通路和焦點(diǎn)黏附等通路,Fig.2C展示了KEGG前20條通路。GO富集分析結(jié)果表明,差異基因主要參與細(xì)胞周期相關(guān)過(guò)程、生物調(diào)節(jié)和代謝過(guò)程等生物學(xué)過(guò)程,差異基因產(chǎn)物主要分布于細(xì)胞、組成細(xì)胞的各種化學(xué)成分和細(xì)胞器等細(xì)胞成分,參與了結(jié)合、催化活性、分子功能調(diào)節(jié)器等分子功能(Fig.2D)。

關(guān)鍵mRNA的 KEGG結(jié)果表明,其主要富集在代謝途徑、PI3K-Akt信號(hào)途徑和細(xì)胞黏附分子等通路,Fig.3C展示了KEGG前20條通路。GO富集分析結(jié)果表明,差異基因參與細(xì)胞周期相關(guān)過(guò)程、生物調(diào)節(jié)和代謝過(guò)程等生物學(xué)過(guò)程,差異基因產(chǎn)物主要分布于細(xì)胞、組成細(xì)胞的各種化學(xué)成分和細(xì)胞器等細(xì)胞成分,參與了結(jié)合、催化活性、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性等分子功能(Fig.3D)。

2.4 關(guān)鍵mRNA和circRNA的qRT-PCR驗(yàn)證

通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證關(guān)鍵mRNA(Table 2)。其中,Csap1(169.55±11.36比0.97±0.78,P<0.0001)、Ctrb1(2.79±0.35比1±0.08,P=0.001)、Dlx2(1.78±0.19比1.04±0.35,P=0.032)、Mab21l2(1.55±0.13比0.9±0.09,P=0.002)在IH組的表達(dá)水平較NC組明顯升高,Gnmt的表達(dá)在兩組間無(wú)明顯差異(1.02±0.09比0.98±0.09,P=0.612),Glycam1在IH組的表達(dá)水平較NC組明顯降低(0.77±0.05比0.99±0.09,P=0.021)。其中,Csap1和Ctrb1的表達(dá)與測(cè)序結(jié)果一致,Glycam1、Dlx2和Mab21l2的表達(dá)與測(cè)序結(jié)果相反,而Gnmt的表達(dá)與測(cè)序結(jié)果相似(Fig.4A)。即通過(guò)qRT-PCR成功驗(yàn)證了關(guān)鍵mRNA中的Csap1和Ctrb1的mRNA表達(dá)。

Fig.4 The qRT-PCR analysis of chosen mRNAs and circRNAs (A) The expression of chosen mRNAs. (B) Analysis of circRNA cyclization by sanger sequencing and agarose gel electrophoresis. (C) The expression of selected circRNAs in qRT-PCR verification. NC control group, IH OSA group. (*P < 0.05,**P <0.01, ***P <0.001, sample size in each group, n=3)

通過(guò)sanger測(cè)序和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步驗(yàn)證關(guān)鍵circRNA(Table 2)。其中,chr17∶2440591|27442626的測(cè)序不成功,而chr9∶54232163|54235344的測(cè)序是雙峰,其他4個(gè)circRNA可成功測(cè)序并進(jìn)一步通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)其表達(dá)(Fig.4B)。通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證所選擇的4個(gè)circRNA(Fig.4C)。與測(cè)序結(jié)果不同的是,IH組和NC組相比,chr4∶58714647|58725647(1.19±0.12比1±0.02,P=0.053)和chr15∶55151603|55154467(1.04±0.04比0.99±0.07,P=0.349)的表達(dá)水平無(wú)明顯的差異。與NC組相比,IH組的chr9∶52042693|52047844(2.03±0.12比1±0.08,P<0.001)和chr4∶64889575|64899587(0.62±0.04比0.98±0.03,P<0.001)的表達(dá)水平具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,且與測(cè)序結(jié)果一致。即通過(guò)qRT-PCR成功驗(yàn)證了關(guān)鍵circRNA中的chr9∶52042693|52047844和chr4∶64889575|64899587的表達(dá),可用以進(jìn)一步構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

Table 3 The construction of circRNA-miRNA-mRNA

2.5 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與驗(yàn)證

使用TargetScan[22]和miRanda[23]在線分析工具,對(duì)qRT-PCR成功驗(yàn)證的circRNA和mRNA進(jìn)行circRNA-miRNA與miRNA-mRNA相互作用關(guān)系的預(yù)測(cè)分析。TargetScan分析結(jié)果提示,chr4∶64889575|64899587與rno-miR-181a-5p和rno-miR-320-3p有互作關(guān)系,chr9∶52042693|52047844與rno-miR-145-5p和rno-miR-351-5p有相互作用關(guān)系;miRanda分析結(jié)果提示,OSA大鼠支氣管差異表達(dá)的mRNA中,Creb1能作為rno-miR-181a-5p的靶基因,Igf1r可作為rno-miR-320-3p的靶基因,Tsc2能作為rno-miR-145-5p的靶基因,Pten可作為rno-miR-351-5p的靶基因(Table 3)。即chr4∶64889575|64899587-rno-miR-181a-5p-Creb1,chr4∶64889575|64899587-rno-miR-320-3p-Igf1r,chr9∶52042693|52047844-rno-miR-145-5p-Tsc2和chr9∶52042693|52047844-rno-miR-351-5p-Pten是與OSA發(fā)生發(fā)展?jié)撛谙嚓P(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)。

對(duì)潛在的4條ceRNA網(wǎng)絡(luò)組成分子(Fig.5A)在肺組織和支氣管組織中的表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,結(jié)果表明,miR-181a-5p、miR-145-5p、Crebl和Igf1r在肺組織和支氣管組織的表達(dá)趨勢(shì)不一致,miR-320-3p、miR-351-5p 在肺組織與支氣管組織中表達(dá)趨勢(shì)一致,chr4∶64889575|64899587、chr9∶52042693|52047844、Tsc2和Pten在肺組織與支氣管組織中表達(dá)趨勢(shì)均與測(cè)序數(shù)據(jù)一致,即成功驗(yàn)證chr9∶52042693|52047844-miR-351-5p-Pten這一ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(Fig.5B, Table 4)。

Table 4 The qRT-PCR analysis of circRNA-miRNA-mRNA

Fig.5 Construction and verification of circRNA-miRNA-mRNA networks (A) Construction of the circRNA-miRNA-mRNA networks. (B)The qRT-PCR analysis of constructed circRNA-miRNA-mRNA pathways in both bronchus and lung tissues. NC control group, IH OSA group. (*P <0.05, **P <0.01,****P <0.0001, sample size in each group, n=3)

3 討論

間歇性缺氧是OSA一個(gè)特征性的病理生理改變,然而,其發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制尚不明確。circRNA最初于1979年在真核生物的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)[24],與疾病的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān),同時(shí)也是miRNA的調(diào)節(jié)器。circRNA能穩(wěn)定地存在于血液和唾液中[25-27],對(duì)miRNA發(fā)揮長(zhǎng)效抑制作用[28],參與調(diào)控人類的免疫反應(yīng)和細(xì)胞代謝等生命活動(dòng)。因此,本文采用生物信息學(xué)、轉(zhuǎn)錄物組測(cè)序和qRT-PCR驗(yàn)證相結(jié)合的方法,研究OSA發(fā)生間歇性缺氧的分子機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn),在OSA中明顯差異表達(dá)的6個(gè)circRNA尚未見文獻(xiàn)報(bào)道,但它們選擇性轉(zhuǎn)錄的mRNA參與了各種各樣的細(xì)胞活動(dòng)。既往研究表明,Mkln1,即chr4∶58714647|58725647的線性轉(zhuǎn)錄物,參與細(xì)胞基質(zhì)的構(gòu)建,其促進(jìn)細(xì)胞黏附[29, 30]。col3a1(chr9∶52042693|52047844的線性轉(zhuǎn)錄物)在慢性間歇性缺氧小鼠的頦舌肌組織中差異表達(dá),與OSA上呼吸道肌肉損傷有潛在相關(guān)性[31];非典型激酶RIOK1(Chr17∶27440591|27442626的線性轉(zhuǎn)錄物),可以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和侵入[32-34]。chr15∶55151603|55154467的線性轉(zhuǎn)錄物RB1與腫瘤發(fā)生相關(guān)[35]。Creb3l2是一種cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白質(zhì),是Chr4∶64889575|64899587的線性轉(zhuǎn)錄物,可以治療低糖基化[36]。Gls是Chr9∶54232163|54235344的線性轉(zhuǎn)錄物,其過(guò)度活動(dòng)可導(dǎo)致谷氨酸過(guò)剩,Gls缺失會(huì)降低乳腺腫瘤微血管密度,增加血管周圍支持細(xì)胞覆蓋率,改善灌注,減少缺氧[37, 38];同時(shí),Gls還對(duì)Th17和Th1細(xì)胞分化及相關(guān)炎癥反應(yīng)有調(diào)控作用[39]。

在OSA中明顯差異表達(dá)的6個(gè)mRNA中,唾液蛋白Csap1上調(diào)幅度最大,GlyCAM1在過(guò)敏性肺部炎癥肺組織中差異表達(dá),與中央記憶型T細(xì)胞在肺部的浸潤(rùn)相關(guān)[40],血液中GlyCAM1會(huì)中和炎癥刺激后的白細(xì)胞釋放的L-selectin[41, 42]。Dlx2表達(dá)水平降低與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[43];白內(nèi)障與MAB21L2的突變有關(guān)[44],Gnmt在肝炎、動(dòng)脈粥樣硬化、潰瘍性結(jié)腸炎等炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用[45, 46]。對(duì)表達(dá)下調(diào)的mRNA進(jìn)行GO富集分析,結(jié)果表明,其主要富集在細(xì)胞周期相關(guān)過(guò)程等生物學(xué)過(guò)程,結(jié)合、催化活性和分子轉(zhuǎn)導(dǎo)器活性等分子功能。關(guān)鍵circRNA和mRNA的KEGG分析結(jié)果均提示,代謝和PI3K-Akt信號(hào)通路在OSA發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色。本研究中,通過(guò)qRT-PCR對(duì)關(guān)鍵mRNA進(jìn)行驗(yàn)證,部分mRNA結(jié)果與測(cè)序結(jié)果不一致,原因可能與驗(yàn)證基因數(shù)量較少、表達(dá)量低、方法學(xué)差異等因素相關(guān)。

考慮到circRNA-miRNA和miRNA-mRNA在OSA中級(jí)聯(lián)放大的影響,circRNA-miRNA-mRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能是其關(guān)鍵的調(diào)節(jié)途徑。本研究中驗(yàn)證的chr9∶52042693|52047844-miR-351-5p-Pten調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未見文獻(xiàn)報(bào)道,但其中的分子分別與一些病理生理過(guò)程相關(guān)。在缺血/再灌注中,miR-351-5p是一個(gè)關(guān)鍵的標(biāo)志物和治療靶標(biāo)[47];研究表明,miR-351能同時(shí)靶向血管緊張素II和VEGF,介導(dǎo)二者在缺氧引起的微血管功能異常中的串?dāng)_[48];同時(shí),對(duì)大鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行研究,結(jié)果表明,miR-351-5p能抑制PTEN表達(dá),推動(dòng)細(xì)胞促炎癥環(huán)境的建立[49]。以上結(jié)果表明,chr9∶52042693|52047844-miR-351-5p-Pten調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能在OSA缺氧和炎癥反應(yīng)等病理生理過(guò)程中扮演重要角色。本研究存在一定的局限性,因缺乏臨床樣本,未進(jìn)一步在人類組織中對(duì)chr9∶52042693|52047844-miR-351-5p-Pten調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作進(jìn)一步的驗(yàn)證,后續(xù)研究將收集人類血液樣本深入研究。

本研究結(jié)果表明,chr9∶52042693|52047844-miR-351-5p-Pten可能通過(guò)ceRNA機(jī)制參與阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征的發(fā)生和發(fā)展。