王娜

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，廣東廣州 510670）

氟蟲腈是由法國(guó)羅納-普朗克公司于1981 年研制出的一款全新苯基吡唑類農(nóng)藥[1]，它具備高活性、殺蟲譜廣等優(yōu)點(diǎn)，主要利用胃毒、觸殺和內(nèi)吸作用來(lái)控制害蟲（螟蟲、蚜蟲、跳蚤、虱和蟑螂等）的神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)系統(tǒng)從而取得顯著殺傷效應(yīng)，因此，被廣泛應(yīng)用在蔬菜、水果等種植業(yè)，以及畜牧業(yè)領(lǐng)域。在化學(xué)環(huán)境方面，氟蟲腈能在強(qiáng)酸性和中等環(huán)境中穩(wěn)定出現(xiàn)，但在堿性環(huán)境和日照條件下也會(huì)引起分解，產(chǎn)生各種代謝物質(zhì)：氟甲腈（MB46513）、氟蟲腈砜（MB41136）和氟蟲腈亞砜（MB45950）等。有關(guān)研究人員指出，氟蟲腈代謝產(chǎn)物毒性更強(qiáng)，會(huì)使水體中的魚類、蝦等高度中毒，再經(jīng)由食物鏈傳染至體內(nèi)進(jìn)而損害肝臟和甲狀腺功能[2,3]。氟蟲腈已被全球健康機(jī)構(gòu)定名為“對(duì)人體有中等毒害”化學(xué)物質(zhì)[4]。近年來(lái)，部分發(fā)達(dá)國(guó)家也發(fā)生了食物中氟蟲腈濃度超標(biāo)事故，在中國(guó)和歐洲均已明確限制將氟蟲腈廣泛應(yīng)用于家畜養(yǎng)殖業(yè)中，對(duì)氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物的監(jiān)督管理也日益趨嚴(yán)，因此，建立更為有效的檢驗(yàn)手段有著很大的實(shí)際意義。

柚子皮作為一個(gè)藥食相適宜的食物，不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，而且含有大量的維他命、多種礦物質(zhì)、胡蘿卜素、枳實(shí)和糖類等營(yíng)養(yǎng)素，還具備了食療的功效，如健胃、化痰、潤(rùn)肺、消食等功效，能促使創(chuàng)傷痊愈，對(duì)腦血管病變，如腦血栓、中風(fēng)等也有較好的防治效果。

目前，氟蟲腈及其代謝物質(zhì)的檢驗(yàn)技術(shù)一般有氣相色譜法[5-8]、氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法[9-15]和液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法[16-19]，大部分所面向的范圍為蔬菜、水果、動(dòng)物臟器以及自然水體等，但對(duì)于柚子皮中氟蟲腈及其代謝物質(zhì)的檢驗(yàn)技術(shù)，尚未見報(bào)道。本文通過(guò)優(yōu)化改進(jìn)后的QuEChERS 前處理技術(shù)，構(gòu)建了同時(shí)檢測(cè)柚子皮中氟蟲腈及其代謝物氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜殘留的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：8900B-7000D，配EI 源，安捷倫技術(shù)公司；電子天平：JJ500，常熟市雙杰測(cè)試技術(shù)公司；離心機(jī)：5804R，賽默飛世爾技術(shù)公司；氮吹儀：M64，北京萊伯泰科儀器設(shè)備集團(tuán)有限公司。

氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：均是100 mg·L-1，農(nóng)業(yè)部環(huán)?？蒲斜O(jiān)測(cè)所；磷酸三苯酯：1 000 mg·L-1，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；乙腈：HPLC 級(jí)，北京安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；乙酸：優(yōu)級(jí)純，廣州化學(xué)試劑廠；N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化碳黑（GCB）、十八烷基硅烷（C18）：安捷倫科技有限公司；無(wú)水硫酸鎂（MgSO4）：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；0.22 μm 有機(jī)濾膜：天津津騰實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司；QuEChERS 萃取的鹽包：內(nèi)含6 g 無(wú)水硫酸鎂（MgSO4）和1.5 g 無(wú)水乙酸鈉（NaAc），安捷倫科技有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液及試劑配制

氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)工作液：用乙腈稀釋氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，配制成濃度為1.0 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

磷酸三苯酯標(biāo)準(zhǔn)工作液：用乙腈稀釋磷酸三苯酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，配制成濃度為1.0 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1%酸化乙腈溶液：先取10 mL 乙酸加入1 L 容量瓶中，然后加入乙腈溶液稀釋至刻度。

氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：用乙腈逐級(jí)稀釋氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)工作液，質(zhì)量濃度分別為10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L。

氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物基質(zhì)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法：取陰性柚子皮樣品，取1.0 mL 試樣萃取液，各5 份，經(jīng)氮?dú)獯蹈?，依次加入氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0 mL，再添加50 μL 磷酸三苯酯的標(biāo)準(zhǔn)工作液，混勻，形成質(zhì)量濃度分別為10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L 的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

色譜條件：HP-5MS 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：高純氦；載氣流速：氦氣，1.0 mL/min；進(jìn)樣方式：不分流；進(jìn)樣溫度：280℃；進(jìn)樣量：1.0 μL；升溫程序：80℃保持1 min，20℃/min 升溫到180℃，保持5 min，再以60℃/min 升溫到230℃，最后以40℃/min升溫到300℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；接口溫度280℃；離子源溫度280℃；四極桿工作溫度150℃；碰撞氣：高純氮?dú)猓ā?9.999%）；數(shù)據(jù)采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

提?。悍Q取粉碎后的柚子皮樣品3 g，加入15 mL 去離子水充分浸潤(rùn)30 min，再加入15 mL 1%酸化乙腈渦旋5 min充分混勻，之后加入QuEChERS 萃取鹽包渦旋提取10 min，以10 000 r/min 離心5 min，取9 mL 上清液于另一50 mL離心管內(nèi)。

凈化方法：向離心管中加入150 mg PSA、50 mg C18、150 mg GCB 和750 mg 無(wú)水硫酸鎂，在渦旋5 min 后以10 000 r/min 離心5 min，取5 mL 上清液經(jīng)氮吹濃縮至近干，后用乙腈定容至1 mL，渦旋混勻后過(guò)0.22 μm 有機(jī)濾膜至進(jìn)樣小瓶中，加50 μL 磷酸三苯酯標(biāo)準(zhǔn)工作液，待GC-MS/MS分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）下對(duì)氟蟲腈及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)加以優(yōu)化，詳細(xì)信息如表1 所示。

表1 氟蟲腈及其代謝物質(zhì)譜參數(shù)

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

本文主要通過(guò)采用QuEChERS 法對(duì)柚子皮中氟蟲腈及其代謝物等進(jìn)行萃取，對(duì)提取溶劑的選擇和凈化、純化等方面進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.1 提取溶劑的選擇

由于氟蟲腈及其代謝物在不同的有機(jī)溶劑中有著不同的溶解度[20,21]，本研究選取了乙腈、1%酸化乙腈、乙酸乙酯、甲醇和丙酮為提取溶劑。給陰性柚子皮樣品中加入了氟蟲腈及其代謝物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，水平為10 μg·kg-1，按照1.4 節(jié)中方法進(jìn)行前處理，結(jié)果如圖1 所示。在采用甲醇和丙酮為萃取溶劑時(shí)，4 種化合物的回收率在26.8%～45.6%；使用乙酸乙酯為提取溶劑時(shí)，4 種物質(zhì)的回收率約在78.2%～86.4%，且萃取液比其他幾種溶劑的顏色更深，或許是由于乙酸乙酯對(duì)色素和油脂類物質(zhì)具有更強(qiáng)的萃取能力；使用乙腈為提取溶劑時(shí)，4 種化合物平均提取率為79.2%～82.5%；而使用1%酸化乙腈為提取溶劑時(shí)，回收率均可達(dá)到80.0%以上，這是因?yàn)榉纂?、氟蟲腈、氟蟲腈砜及氟蟲腈亞砜的酸度系數(shù)（pKa）分別為-4.15±0.20、-5.86±0.20、-8.12±0.20 和-4.16±0.20，易溶于酸性溶劑，然而乙腈的極性強(qiáng)，具有沉淀樣品中蛋白質(zhì)作用，能夠降低脂類、色素及其他雜質(zhì)的溶出，從而降低了基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的影響。結(jié)合以上情況，本實(shí)驗(yàn)選用1%酸化乙腈作為提取溶液。

圖1 5 種提取溶劑對(duì)氟蟲腈及其代謝物回收率的影響

為了獲得更好的萃取效果，對(duì)1%酸化乙腈的萃取體積進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，分別考察了體積為10 mL、15 mL 和20 mL 對(duì)氟蟲腈及其代謝物的萃取功效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，體積為10 mL 時(shí)，回收率范圍在81.4%～82.9%；體積為15 mL 時(shí)，回收率范圍在85.9%～91.8%；體積為20 mL 時(shí)，回收率范圍在84.2%～90.4%。在回收率相當(dāng)?shù)那闆r下，為節(jié)省試劑，可以采用15 mL 作為本實(shí)驗(yàn)的萃取體積。

2.2.2 凈化條件的優(yōu)化

QuEChERS 方法凈化中，PSA、GCB 和C18都是常用的空氣凈化材料[15]，功能又各有優(yōu)點(diǎn)和不同，其中：PSA 主要作用是去除基質(zhì)中糖類、色素和脂肪酸；C18主要作用是去除基質(zhì)中脂肪；GCB 則主要去除基質(zhì)中的色素等。本文根據(jù)柚子皮特性選取以PSA、GCB 和C18為三因素，選取50 mg、100 mg、150 mg 3 個(gè)添加水平，并以正交實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行優(yōu)化，從表2 中數(shù)據(jù)可以得出，氟蟲腈及其代謝物均會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)增強(qiáng)現(xiàn)象，由于4 種化合物性質(zhì)較近，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈趨同性。其中C18量的增加對(duì)4 種化合物的回收率均沒有顯著影響，所以從經(jīng)濟(jì)方面考慮C18加入量為50 mg；而PSA 和GCB 則對(duì)凈化起主要作用，隨著用量的增加，目標(biāo)物的回收率降低，就意味著基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)減弱，因此在加入150 mg 后4 種化合物的回收率也會(huì)有明顯的降低，所以PSA 和GCB 加入量均為150 mg。綜上，本研究?jī)艋牧咸砑恿繛椋篏CB 150 mg、PSA 150 mg 和C1850 mg。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

樣品基質(zhì)中的其他成分也會(huì)對(duì)目標(biāo)化合物的響應(yīng)造成一定影響，稱為基質(zhì)效應(yīng)，分為基質(zhì)增強(qiáng)和基質(zhì)減弱[12]。一般通過(guò)目標(biāo)化合物在空白基質(zhì)中和溶劑中的響應(yīng)值比（K）來(lái)評(píng)價(jià)其效果，若K值＞1.1，則認(rèn)為是基質(zhì)增強(qiáng)；若K值＜0.9，則認(rèn)為是基質(zhì)減弱；若K值在0.9～1.1 之間，則認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)可以忽略。

選取陰性柚子皮樣品按照1.4 節(jié)中方法進(jìn)行前處理得到空白基質(zhì)溶液。分別用空白機(jī)制溶液和乙腈溶液稀釋氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)工作液配成濃度為20 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，比較2種標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值如表3 所示?？梢钥闯鰞艋蟮腒值仍然＞1.1，具有顯著的基質(zhì)增強(qiáng)作用，因此必須通過(guò)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)氟蟲腈及其代謝物進(jìn)行精確定量。

表3 基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

對(duì)1.2節(jié)中質(zhì)量濃度為10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L 的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定，以氟蟲腈及其代謝物的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，4 種化合物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2＞0.995，分別用3 倍和10 倍信噪比（S/N）確定出檢出限（LOD）以及定量限（LOQ）值，如表4 所示。

表4 氟蟲腈及其代謝物基質(zhì)標(biāo)曲線性參數(shù)、檢出限（LOD）及定量限（LOQ）

2.5 精密度和加標(biāo)回收

往空白柚子皮樣品中分別添加5 μg·kg-1、10 μg·kg-1、20 μg·kg-1的氟蟲腈及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液配制成低、中、高三個(gè)含量樣品，并按照1.4 節(jié)中的方法進(jìn)行了加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表5 所示，氟蟲腈及其代謝物的加標(biāo)回收率為81.7%～89.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.0%～7.3%。

表5 柚子皮中氟蟲腈及其代謝物的平均回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

3 結(jié)束語(yǔ)

本文通過(guò)建立QuEChERS 前處理技術(shù)，結(jié)合GC-MS/MS檢測(cè)技術(shù)對(duì)柚子皮中氟蟲腈及其代謝物殘留量進(jìn)行了分析。探討了提取溶劑的選擇和基質(zhì)效應(yīng)，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了凈化條件的優(yōu)化。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，氟蟲腈及其代謝物的線性相關(guān)系數(shù)均＞0.995，檢出限和定量限依次是1 μg·kg-1和3 μg·kg-1，加標(biāo)回收率為81.7%～89.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.0%～7.3%，表明該方法能夠滿足柚子皮中氟蟲腈及其代謝物氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜的定量分析。