李籃,曾志云,姜玉梅,謝佳琦

(湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院,湖南 株洲 412000)

消炎利膽片是《中國藥典》2020年版收載品種,由穿心蓮、苦木、溪黃草3味藥組成,具有清熱、祛濕、利膽的功效[1],用于肝膽濕熱所致的脅肋脹痛、口干口苦;急性膽囊炎、膽管炎見上述征候者。消炎利膽片現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),其含量測定項(xiàng)下僅規(guī)定了穿心蓮活性成分——穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯[2]的含量。穿心蓮雖為消炎利膽片的主藥,其兩個(gè)內(nèi)酯的含量卻難以全面反映制劑產(chǎn)品的質(zhì)量。

研究表明消炎利膽片含量測定的指標(biāo)成分多達(dá)10余種[3-5]。本研究對消炎利膽片的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了系統(tǒng)梳理與考證,按照“關(guān)鍵藥味重點(diǎn)突出、質(zhì)量控制無盲點(diǎn)”的原則,在原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)穿心蓮內(nèi)酯類含量測定的基礎(chǔ)上新增酚酸類物質(zhì)作為含量測定指標(biāo)成分。酚酸類物質(zhì)是溪黃草發(fā)揮抗炎、抗病毒作用的主要活性成分,其中迷迭香酸發(fā)揮了重要作用,而其含量因溪黃草不同產(chǎn)地而表現(xiàn)出較大差異,可作為區(qū)分的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)之一[6]。故采用HPLC法測定消炎利膽片中迷迭香酸、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量,以期建立適合全面控制消炎利膽片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),為該制劑產(chǎn)品的后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司,美國),Waters sunfire C18(4.6 mm × 250 mm,5 μm,沃特世科技有限公司,美國) 色譜柱;KQ-50B型超聲波清洗器(青島精誠儀器儀表有限公司,中國);AP225WD電子天平(日本島津儀器有限公司,日本)。乙腈、甲醇、甲酸為色譜純,水為超純水,其他試劑均為分析純。

1.2 材料

穿心蓮內(nèi)酯(批號:110797-202010,純度99.6%),脫水穿心蓮內(nèi)酯(批號:110854-202111,純度98.9%),迷迭香酸(批號:111871-202007,純度98.1%),以上均購自中國食品藥品檢定研究院。18批消炎利膽片樣品來自12個(gè)廠家,這些廠家分布在全國各地,具體見表1。

2 方法和結(jié)果

2.1 流動相的選擇

查閱相關(guān)文獻(xiàn)后[7-12],設(shè)計(jì)了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.2%甲酸水溶液等三種洗脫條件,對比發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%甲酸水溶液下色譜峰出峰較多,達(dá)到基線分離,峰形對稱,保留時(shí)間適中,即確定該洗脫條件。

2.2 檢測波長的選擇

取迷迭香酸、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯等對照品溶液,在波長190～400 nm間掃描,將各成分在205,225,250 nm下的色譜圖進(jìn)行比較,225 nm下各成分出峰效果較好、基線較穩(wěn),故選用消炎利膽片的檢測波長為225 nm。

2.3 色譜柱溫度的選擇

取同一份消炎利膽片供試品溶液,考察不同色譜柱溫度對峰面積及峰形的影響,考察溫度分別為20,25,30 ℃,結(jié)果發(fā)現(xiàn)色譜柱溫度對峰形影響不大,峰形相對穩(wěn)定,分離度均大于1.5,故選擇室溫作為洗脫溫度。

2.4 提取溶劑的考察

取供試品3份,每份0.3 g,置具塞錐形瓶中,分別各加水、甲醇、70%甲醇50 mL,超聲30 min(300 W,40 kHz),放冷,補(bǔ)足減失的重量,搖勻,過濾,取續(xù)濾液,即得[13]。分別吸取上述3種供試品溶液測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用水超聲時(shí),有絮狀物及沉淀產(chǎn)生,且各峰面積相對較小,而采用甲醇、70%甲醇超聲時(shí),各成分的含量較高。且采用70%甲醇的基線更為平穩(wěn),即確定以70%甲醇作為其溶劑,結(jié)果見表2。

表2 不同提取溶劑對各成分峰面積的影響

2.5 提取方法的考察

取供試品2份,每份0.3 g,置具塞錐形瓶中,分別采用超聲和回流的方式進(jìn)行提取[14]。分別吸取上述2種供試品溶液測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲和回流法,提取效率相當(dāng),為節(jié)省時(shí)間提高效率,建議采用超聲法提取樣品,結(jié)果見表3。

表3 不同提取方法對各成分峰面積的影響

2.6 色譜條件

采用Waters sunfire C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm);流動相選擇乙腈(流動相A)-0.1%甲酸水溶液(流動相B),梯度洗脫(0～15 min,20%A;15～20 min,20%A→25%A;25～45 min,25%A→35%A;46～50 min,35%A);流速為1mL·min-1;檢測波長:225 nm;柱溫為30 ℃;結(jié)果各色譜峰分離度均良好,且無干擾。

1.迷迭香酸;2.穿心蓮內(nèi)酯;3.脫水穿心蓮內(nèi)酯。圖1 消炎利膽片供試品溶液(A)及混合對照品溶液(B)色譜圖

2.7 供試品溶液的制備

取消炎利膽片樣品10 片,除去包衣,精密稱定,研細(xì),取約0.3 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密量取70%甲醇50 mL溶解樣品,密塞,稱定重量,超聲處理(50 W,40 kHZ)30 min,放冷,再稱定重量,用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得。

2.8 對照溶液的制備

精密稱取迷迭香酸、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品適量,置容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液作為對照品溶液(每1 mL含迷迭香酸3.5～350 μg、穿心蓮內(nèi)酯19.6～1 961 μg、脫水穿心蓮內(nèi)酯25.3～2 530 μg)。

2.9 方法學(xué)考察

2.9.1 線性關(guān)系考察

將配制的迷迭香酸、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯不同濃度對照品溶液,按“2.6”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣,分別以上述三種對照品的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(x),峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸,結(jié)果見表4。

表4 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.9.2 精密度試驗(yàn)

取同一批消炎利膽片,按“2.7”項(xiàng)制備供試品溶液,按“2.6”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6針。計(jì)算得到迷迭香酸峰面積的RSD為1.8%,穿心蓮內(nèi)酯峰面積的RSD為1.1%,脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積的RSD為0.9%,說明儀器精密度良好。

2.9.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批消炎利膽片,按“2.7”項(xiàng)制備供試品溶液,按“2.6”項(xiàng)色譜條件下0,2,4,8,12,24,48 h分別進(jìn)行測定。結(jié)果:迷迭香酸峰面積RSD為0.9%,穿心蓮內(nèi)酯峰面積的RSD為2.3%,脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積的RSD為2.3%,說明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批消炎利膽片,按“2.7”項(xiàng)分別制備6份供試品溶液,按“2.6”項(xiàng)色譜條件下測定。結(jié)果:迷迭香酸平均含量的RSD為3.2%;穿心蓮內(nèi)酯平均含量的RSD為1.8%;脫水穿心蓮內(nèi)酯平均含量的RSD為1.9%,說明該方法的重復(fù)性良好。

2.9.5 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批消炎利膽片,研細(xì),精密稱取6份,每份0.15 g,置具塞錐形瓶中,精密加入一定量的迷迭香酸、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的對照品,按“2.7”項(xiàng)制備供試品溶液,按“2.6”的色譜條件下測定,計(jì)算迷迭香酸、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的回收率。結(jié)果見表5,表明該方法的準(zhǔn)確度較好。

表5 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

2.10 樣品含量測定

取表1中的18批樣品按“2.7”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,按“2.6”的色譜條件測定,記錄色譜峰面積,計(jì)算各樣中迷迭香酸、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量。結(jié)果如表6所示。迷迭香酸含量為0.03～0.48 mg/片,穿心蓮內(nèi)酯含量為3.5～7.6 mg/片,脫水穿心蓮內(nèi)酯含量為1.6～8.9 mg/片。

表6 18批消炎利膽片含量測定結(jié)果

3 討論

消炎利膽片具有清熱、祛濕、利膽功效,對熱毒熾盛證的急性膽囊炎療效確切。穿心蓮與溪黃草、苦木配伍等在一定程度上能改善膽囊炎,保護(hù)肝功能。現(xiàn)代藥理研究表明迷迭香酸具有抑菌、抗氧化、抗炎等藥理活性;穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯具有顯著抗炎、抗菌、抗病毒、保肝、護(hù)肺等生物活性,所以本研究選擇內(nèi)酯類成分和酚酸類成分作為研究對象對消炎利膽片進(jìn)行考察。

不同廠家的消炎利膽片中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的總量差異不大,范圍為7.2～13.6 mg/片,均符合藥典的要求。但兩者之間的比率差異較大,編號為1,2,5,8,9,10批次的樣品中,穿心蓮內(nèi)酯的含量高于脫水穿心蓮內(nèi)酯,尤其是編號為1的批次,這可能與每個(gè)廠家的不同工藝設(shè)備及其參數(shù)有關(guān)。不同廠家的消炎利膽片都含有迷迭香酸,但含量存在明顯差異。各廠家所使用的溪黃草基原不同可能是其原因之一,文獻(xiàn)也記載不同溪黃草基原中迷迭香酸含量具有較大差異[15-17]。因此應(yīng)當(dāng)注意該投料藥材的來源、生產(chǎn)工藝等。

本研究制定了消炎利膽片中穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯和迷迭香酸三種成分的同步含量測定方法,同時(shí)對不同廠家樣品的含量差異進(jìn)行分析。但穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯是穿心蓮藥材中的特征性成分,迷迭香酸是溪黃草中的主要成分,本研究沒有涉及苦木中的特征性成分,下一步本課題組將針對苦木的化學(xué)成分繼續(xù)開展研究,以期能建立更加完善的消炎利膽片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。