楊代曉,梁宇恒,何熾明,譚麗容,梁旭霞,張磊

(廣東省生物制品與藥物研究所,廣東 廣州 510440)

元寶草,又名大葉對(duì)口蓮、對(duì)月草等,是藤黃科金絲桃屬的多年生草本植物,民間以全草入藥,在我國(guó)的陜西、湖南、湖北、江西、江蘇、四川等地分布廣泛,具有豐富的資源。石金城等[1]研究發(fā)現(xiàn)了元寶草正丁醇和水層部位有較好的抗抑郁活性,但較少有關(guān)于元寶草其他提取工藝進(jìn)行藥效學(xué)的研究,且未有使用大鼠進(jìn)行慢性不可預(yù)知性應(yīng)激模型進(jìn)行元寶草抗抑郁作用的研究。故本研究通過(guò)選擇慢性不可預(yù)知性應(yīng)激模型對(duì)元寶草的藥物效果進(jìn)行評(píng)價(jià),為抗抑郁中藥元寶草的作用研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥材本實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)所用藥材元寶草產(chǎn)地為河北保定,購(gòu)自河北安國(guó)藥材公司,此藥材經(jīng)鑒定為藤黃科元寶草(HyperipumsampsoniiHance)的全草(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院李彬副研究員鑒定)。參考有關(guān)文獻(xiàn)選擇本研究的提取方法如下[2]：70% 的乙醇,60 ℃的提取溫度,料液比為20倍的乙醇用量,提取3次,1.5 h每次,把濾液合后制備成干粉,于4 ℃冰箱保存待用,得率為12.11%。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為25只雄性SD (sprague dawley)大鼠,清潔級(jí)(200±20)g,由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào)：SCXK(軍) 2012-0004。所有動(dòng)物均單籠進(jìn)行飼養(yǎng),自由飲食、飲水,喂養(yǎng)1周,光照/黑暗=12 h/12 h,溫度范圍為(20±2)℃,濕度范圍為30%±10%。大鼠適應(yīng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器0.9%生理鹽水(石家莊四藥有限公司);恒佳DT1001A電子天平(常熟佳衡天平儀器有限公司);LGJ-25C冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠);TGL-16B型高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及處理大鼠進(jìn)行適應(yīng)一周后隨機(jī)分組,平均分5組,每組5只,分別為空白對(duì)照組、元寶草高、中、低劑量組(720、360、180 mg·kg-1提取物)和模型組,除空白對(duì)照組以外,其余各組均通過(guò)慢性不可預(yù)見性刺激實(shí)驗(yàn)進(jìn)行造模,持續(xù)造模4周。造模同時(shí)給藥,元寶草藥物干粉用生理鹽水配制成相應(yīng)劑量的溶液,并分別對(duì)元寶草高、中、低劑量組進(jìn)行灌胃,1 mL/只,模型組和空白對(duì)照組灌胃相同體積的生理鹽水,連續(xù)4周。 實(shí)驗(yàn)同時(shí),每周進(jìn)行大鼠行為學(xué)絕望實(shí)驗(yàn)(包括強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)),持續(xù)28 d。

有研究表明[3],為了保證動(dòng)物的身體狀況保持在較理想的條件,應(yīng)在上午對(duì)動(dòng)物的體重進(jìn)行稱量并進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。

2.2 慢性不可預(yù)見性刺激實(shí)驗(yàn)每日隨機(jī)選取以下刺激中的任一種至兩種,每種刺激方式不連續(xù)出現(xiàn)：①潮濕墊料和傾斜45°;②晝夜顛倒(24 h);③夾尾(5 min);④禁食(24 h);⑤禁水(24 h);⑥束縛應(yīng)激(6 h);⑦熱刺激(45 ℃,5 min);⑧陌生異常物品(如碎布片、塑料杯、木勺等)[4]。

2.3 行為學(xué)測(cè)試懸尾測(cè)試(tail suspension test,TST)：離大鼠尾尖大約3 cm處用懸尾鉤進(jìn)行固定,使大鼠豎直倒掛在自制的懸尾裝置上并與桌面保持約5 cm的距離,懸尾裝置僅一面可觀察,其余均使用黑板遮蔽,且在大鼠可觸碰范圍內(nèi)無(wú)可支撐物,實(shí)驗(yàn)環(huán)境保持安靜,懸掛6 min并累計(jì)后 5 min內(nèi)大鼠的不動(dòng)時(shí)間為失望時(shí)間[5]。

強(qiáng)迫游泳測(cè)試(forced swimming test,FST)：取高60 cm、直徑25 cm的圓柱形玻璃缸,裝入溫度為(25±2.0)℃的水,保持水位45cm高,使得大鼠置于水缸中后可以保持自然伸展的狀態(tài),尾巴不會(huì)觸碰缸底。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,用黑布包繞玻璃缸僅留觀察面,實(shí)驗(yàn)環(huán)境保持安靜,測(cè)試6 min取后5 min 對(duì)大鼠的漂浮不動(dòng)時(shí)間進(jìn)行計(jì)算[6]。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析將體重以及行為學(xué)測(cè)試等的數(shù)據(jù)在SPSS 17.0 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件中進(jìn)行處理,組間進(jìn)行方差的分析。若方差齊,多組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA);若方差不齊,用Wilcoxon秩和檢驗(yàn),以P<0.05表示組間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P<0.01表示組間有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,最終的結(jié)果均按照Mean±SD來(lái)表示。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大鼠體重變化情況實(shí)驗(yàn)開始時(shí),對(duì)各組大鼠的體重進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)無(wú)顯著差異(P>0.05);實(shí)驗(yàn)開始后,各組大鼠與空白對(duì)照組比較,體重均有不同程度的下降,模型組的體重下降的更明顯。元寶草高、中、低劑量組與模型組比較體重均上升,且元寶草高、中劑量組在第4周比模型組體重明顯增加,差異比較顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),結(jié)果見表1和圖1。

圖1 各組大鼠體重變化情況

表1 各組大鼠體重變化情況(Mean±SD)

3.2 大鼠懸尾測(cè)試變化情況懸尾測(cè)試過(guò)程中,大鼠進(jìn)行掙扎來(lái)克服不正常的體位,但是掙扎活動(dòng)到一定程度后會(huì)有間斷性的不動(dòng)時(shí)間,表明了大鼠的失望狀態(tài),模擬了人類抑郁的狀態(tài)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果知,模型組大鼠在TST中,較空白對(duì)照組有極顯著的延長(zhǎng)不動(dòng)時(shí)間的表現(xiàn)(P<0.01)。給予元寶草高、中劑量組的大鼠與模型組比較能顯著的縮短不動(dòng)時(shí)間,差異有比較顯著的變化(P<0.05),表明元寶草有抗抑郁的作用,而元寶草低劑量組在縮短不動(dòng)時(shí)間時(shí)的效果不明顯(P>0.05),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2和圖2。

圖2 各組大鼠懸尾測(cè)試中不動(dòng)時(shí)間結(jié)果

表2 TST實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間變化情況 (Mean±SD,n=5)

3.3 大鼠強(qiáng)迫游泳測(cè)試變化情況強(qiáng)迫游泳測(cè)試中大鼠的不動(dòng)狀態(tài)可以表明動(dòng)物的失望行為,模擬人類的抑郁狀態(tài)。在強(qiáng)迫游泳模型中,元寶草高、中劑量組可以顯著縮短大鼠的不動(dòng)時(shí)間,差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明元寶草可以有抗抑郁的作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3和圖3。

圖3 各組大鼠強(qiáng)迫游泳測(cè)試中不動(dòng)時(shí)間結(jié)果

表3 FST實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間變化情況(Mean±SD)

4 討論

動(dòng)物模型是疾病病理及藥理機(jī)制等研究的基礎(chǔ),可較好的模擬人類的疾病狀態(tài),指導(dǎo)人們對(duì)藥物的研究。模型的選擇要與臨床患者的病因相似,抑郁癥患者最理想的是應(yīng)激抑郁模型,應(yīng)激抑郁模型主要有慢性輕度不可預(yù)知應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)抑郁模型以及慢性束縛應(yīng)激(chronic restraint stress,CRS)抑郁模型[7-8]。慢性束縛應(yīng)激模型對(duì)機(jī)體的刺激沒有損傷性,而且和身心性的疾病有一致的致病原因;慢性不可預(yù)知性輕度應(yīng)激模型可持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),并有較高的有效性,可解決其他模型不能解決的問題,所以是現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外專家較為認(rèn)可的模型[9]。故本研究用慢性不可預(yù)知性應(yīng)激模型來(lái)模擬動(dòng)物的抑郁狀態(tài)。

元寶草作為一種傳統(tǒng)中藥材,收錄于《全國(guó)中草藥匯編》,據(jù)《本草從新》《本草綱目拾遺》《百草鏡》中的記載具有涼血止血、活血調(diào)經(jīng)、清熱解毒、祛風(fēng)通絡(luò)的作用。元寶草味微苦、性寒,用于治療吐血、小孩兒高熱、風(fēng)濕痹痛、痢疾、咔血、外傷出血、乳腺炎、蛇咬傷、燒傷、月經(jīng)不調(diào)等[10]。元寶草是一味歷史悠久的中藥,在民間得到廣泛使用,含有多環(huán)多異戊烯基間苯三酚衍生物、萘駢雙蒽酮類、類黃酮類、揮發(fā)油、二苯甲酮類、蒽醌等化學(xué)成分,具有抗癌、抗抑郁、抗腫瘤、抗炎、抗病毒及抗菌等作用,不同產(chǎn)地的元寶草化學(xué)成分也有一定的差異,各類化合物結(jié)構(gòu)多樣,且生物活性也是多樣化,具有廣泛的開發(fā)前景[11]。

FST和TST被廣泛用于評(píng)估基于動(dòng)物絕望行為的藥物的抗抑郁作用,缺乏掙扎行為代表一種絕望狀態(tài)[12]。在測(cè)試前對(duì)動(dòng)物進(jìn)行服用抗抑郁藥干預(yù),會(huì)有更長(zhǎng)時(shí)間的堅(jiān)持逃避導(dǎo)向的行為,抗抑郁效果的主要測(cè)量指標(biāo)是不動(dòng)時(shí)間的顯著減少。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型組大鼠與空白組相比,FST和TST測(cè)試中的不動(dòng)時(shí)間均顯著增加,表明造模有效而且元寶草高、中、低劑量組存在劑量依賴的關(guān)系。其中元寶草高劑量(720 mg·kg-1)調(diào)節(jié)作用最顯著,抗抑郁效果最好,不足之處是因?yàn)楸敬螌?shí)驗(yàn)樣本量偏少,還需要更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其作用,更深層次的結(jié)果尚需進(jìn)一步的研究。