李夢輝,王 平,張耀文

食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)病因不明、機(jī)制不清、死亡率極高[1-2]。全球每年新發(fā)的ESCC患者中,中國占一半以上,其中河南占中國的一半以上[3-4]。因此,尋找ESCC早診早治的特異性分子標(biāo)志物,對降低其發(fā)病率及改善患者預(yù)后至關(guān)重要。

資料顯示,新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非編碼RNA-circRNA(circular RNA,circRNA)具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、種類豐富、特異性強(qiáng)、序列保守等特點(diǎn),可調(diào)控天然小RNA(microRNAs,miRNAs)活性,參與結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件及轉(zhuǎn)錄蛋白互作基因等[5-7]。circRNA已被證實(shí)為肝癌、胃癌、肺癌等多種惡性腫瘤的生物標(biāo)志物[8-10]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA6448-14在ESCC中的表達(dá)量顯著高于正常組織,表明hsa_circRNA6448-14與ESCC發(fā)生發(fā)展相關(guān),但其具體致病機(jī)制尚不明確[11-12]。

本研究建立hsa_circRNA6448-14敲低的ESCC細(xì)胞系,采用CCK8及平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測親本與敲低細(xì)胞系的體外增殖能力,分析hsa_circRNA6448-14在ESCC細(xì)胞惡性增殖過程中的作用,為ESCC治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

KYSE30及KYSE150細(xì)胞系(人ESCC細(xì)胞系,中國BNCC公司)。Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(美國 Invitrogen公司);hsa_circRNA6448-14-siRNA及siNC(上海吉瑪基因公司);hsa_circRNA6448-14上游引物為5’-CCAATGGGGACTGTC ATGGA-3’,下游引物為5’-TCATGCCGTGTTTCAGCTCA-3’,GAPDH 上游引物為5’-GTGGAGTCCACTGGCGTCT-3’,下游引物為5’-GTGCAGGAGGCATTGCTGAT-3’(中國Sangon Biotech公司);Trizol試劑盒(美國Thermo公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒及qPCR試劑盒(中國Vazyme公司);CCK8試劑盒、PBS緩沖液、4%細(xì)胞固定液及1%結(jié)晶紫染液(中國Solarbio公司)。PCR儀(美國Bio-Rad公司);倒置顯微鏡(日本Nikon公司);成像系統(tǒng)(美國Thermo公司);酶標(biāo)儀(美國PerkinElmer公司)。

1.2 hsa_circRNA6448-14敲低

常規(guī)培養(yǎng)KYSE30及KYSE150細(xì)胞,將兩株細(xì)胞各分為兩組:對照組及觀察組。待細(xì)胞密度為70%時(shí),根據(jù)說明書將siNC及hsa_circRNA6448-14-siRNA與Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑混合,分別轉(zhuǎn)染對照組及觀察組細(xì)胞。48 h后,采用qRT-PCR檢測hsa_circRNA6448-14的敲低效率,并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 qRT-PCR

待各組細(xì)胞密度至80%,棄去培養(yǎng)基,PBS清洗后,加入Trizol冰上裂解,根據(jù)說明書步驟提取各組細(xì)胞總RNA。各組細(xì)胞均取1 μg總RNA,采用試劑盒配制反轉(zhuǎn)錄體系,反應(yīng)條件為:25 ℃ 5 min,42 ℃ 60 min,70 ℃ 15 min。采用試劑盒配制qRT-PCR反應(yīng)體系,反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性20 s,95 ℃變性3 s,60 ℃退火 30 s,共40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算circRNA的相對表達(dá)量。具體步驟參考說明書及文獻(xiàn)[12]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 CCK8

將各組細(xì)胞密度調(diào)整為每mL 1 × 104。每組均于96孔板中鋪入100 μL細(xì)胞懸液,常規(guī)培養(yǎng)。采用CCK8試劑盒,每隔24 h于酶標(biāo)儀測定一次OD450 nm。對比不同組間的體外增殖能力,具體步驟參考說明書及文獻(xiàn)[13]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 平板克隆

將各組細(xì)胞密度調(diào)整為每mL 5 × 102個(gè)。每組均于6孔板中鋪入2 mL細(xì)胞懸液,常規(guī)培養(yǎng)。1周后可見克隆形成。棄去培養(yǎng)基,于PBS緩沖液清洗、4%細(xì)胞固定液固定、1%結(jié)晶紫染液染色后,對單克隆進(jìn)行拍照并計(jì)數(shù)[13]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件為GraphPad 8.0。采用t檢驗(yàn)比較兩組細(xì)胞間hsa_circRNA6448-14表達(dá)量差異及體外增殖能力差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞hsa_circRNA6448-14的表達(dá)量

建立hsa_circRNA6448-14敲低的KYSE30及KYSE150細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)分為對照組及觀察組,通過qRT-PCR檢測各組細(xì)胞系中hsa_circRNA6448-14的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示,與對照組相比,觀察組細(xì)胞中hsa_circRNA6448-14的相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。表明成功建立hsa_circRNA6448-14敲低的ESCC細(xì)胞系。見圖1。

A、B:qRT-PCR檢測各組KYSE30/KYSE150細(xì)胞。圖1 各組細(xì)胞中hsa_circRNA6448-14相對表達(dá)量的檢測結(jié)果

2.2 各組細(xì)胞體外增殖能力的CCK8檢測

實(shí)驗(yàn)分為對照組及觀察組。圖2結(jié)果顯示,與對照組相比,觀察組細(xì)胞的體外增殖能力顯著減弱(P<0.05)。表明hsa_circRNA6448-14可維持ESCC的惡性增殖。

A、C:CCK8法檢測各組KYSE30/KYSE150細(xì)胞的體外增殖能力;B、D:各組KYSE30/KYSE150細(xì)胞的體外增殖能力差異。圖2 各組細(xì)胞體外增殖能力的CCK8檢測

2.3 各組細(xì)胞體外增殖能力的平板克隆檢測

實(shí)驗(yàn)分為對照組及觀察組。圖3結(jié)果顯示,與對照組相比,觀察組細(xì)胞的體外增殖能力顯著減弱(P<0.05)。表明hsa_circRNA6448-14在ESCC惡性增殖過程中發(fā)揮重要作用。

A、C:平板克隆法檢測各組KYSE30/KYSE150細(xì)胞的體外增殖能力;B、D:各組KYSE30/KYSE150細(xì)胞的體外增殖能力差異。圖3 各組細(xì)胞體外增殖能力的平板克隆檢測結(jié)果

3 討論

河南ESCC發(fā)病率居全國首位,由于ESCC起病隱匿,多數(shù)患者確診時(shí)已發(fā)展至中晚期,5 a生存率極低。因此,尋找ESCC的診斷標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。

研究表明,circRNA已被證實(shí)與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。甲狀腺癌中,has_circRNA0058124可通過miR-218-5p/NUMB調(diào)控NOTCH3/GATAD2A軸促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移,且顯著縮短患者生存期[14];前列腺癌中,circCSNK1G3可通過調(diào)控miR-181促進(jìn)癌細(xì)胞惡性增殖,降低其治療敏感性[15];肝癌中,circASAP1可通過調(diào)控miR-326/miR-532-5P-MAPK1信號通路促進(jìn)癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,引起患者耐藥及復(fù)發(fā)[16];非小細(xì)胞肺癌中,circFGFR1可通過miR-381-3P誘導(dǎo)CXCR4高表達(dá),引起癌細(xì)胞抵抗凋亡,導(dǎo)致其免疫逃逸[17];胃癌中,hsa_circ_0001725可通過miR-150-5P/c-Myc軸參與胃癌的發(fā)生發(fā)展,其高表達(dá)的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高,TNM分期差,術(shù)后生存期短[18];骨肉瘤中,circMYO10可通過miR-370-3P/RUVBL1軸引起染色質(zhì)重塑,增強(qiáng)β-catenin/LEF1轉(zhuǎn)錄活性,促進(jìn)癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致其惡性轉(zhuǎn)移[19]。

資料顯示,CircRNA在ESCC發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。Circ-7不僅可通過miR-7激活NFκB/p65通路促進(jìn)ESCC細(xì)胞生長,還可通過miR-7激活KLF4促進(jìn)ESCC細(xì)胞遷移[20-21]。circ_0000654可通過miR-149-5P激活I(lǐng)L-6/STAT3通路誘發(fā)炎癥反應(yīng),降低ESCC細(xì)胞的放療敏感性[22]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA6448-14高表達(dá)的ESCC患者生存期縮短[11-12],表明hsa_circRNA6448-14參與了ESCC的發(fā)生發(fā)展?；诖?本研究建立hsa_circRNA6448-14敲低的ESCC細(xì)胞系,采用CCK8及平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測親本與敲低細(xì)胞系的體外增殖能力,發(fā)現(xiàn)與親本細(xì)胞系相比,hsa_circRNA6448-14敲低的ESCC細(xì)胞系的體外增殖能力顯著減弱,提示靶向hsa_circRNA6448-14可有效抑制ESCC細(xì)胞的惡性增殖,表明hsa_circRNA6448-14為ESCC細(xì)胞增殖過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子。

綜上所述,hsa_circRNA6448-14在ESCC細(xì)胞惡性增殖過程中發(fā)揮重要作用。由于ESCC的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素相互作用的復(fù)雜過程,且本研究檢測方法較少,circRNA的具體致病機(jī)制后續(xù)仍需其他實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證,但靶向hsa_circRNA6448-14可抑制ESCC細(xì)胞生長。本研究為ESCC治療提供了新思路。